Name: Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Poznaj metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo działania hormonów tarczycy za pomocą modelu THAI u myszy. Technika ta umożliwia ilościowe badanie lokalnych efektów zaburzaczy endokrynnych w tkankach żywego organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez numer projektu. RRF-2.3.1-21-2022-00011, zatytułowany National Laboratory of Translational Neuroscience, został zrealizowany przy wsparciu Instrumentu na rzecz Odbudowy i Zwiększania Odporności Unii Europejskiej w ramach Programu Széchenyi Plan Plus.

Niniejszy protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Instytucie Medycyny Doświadczalnej (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Prezentowane dane pochodzą od FVB/Ant background14, 3-miesięcznych samców myszy tajskich (n = 3-6/grupa). Tło FVB/Mrówki: Tajskie zwierzęta mają zwykle silnie pigmentowane plamy na skórze, które mogą zniekształcać pomiary. Dlatego szukaj pigmentowanych plam na skórze obrazowanego obszaru po usunięciu sierści. Zwierzęta nie wymagają specjalnych warunków przetrzymywania, chyba że doświadczenie wyraźnie tego wymaga (np. specjalna dieta).
1. Leczenie nadczynności tarczycy
UWAGA: Ogólny protokół wywoływania nadczynności tarczycy u myszy znajduje się tutaj. Przewodnik ATA19 zawiera szczegółowe wyjaśnienia dotyczące tła wymienionych metod z wymienionymi alternatywami.
<ol>
	<li>Rozpuścić T3 (3,5,3'-trójjodotyroninę, patrz tabela materiałów) w 40 mM NaOH, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu między 5-10 mg/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy solą fizjologiczną do końcowego stężenia 0,1 μg/μl.</li>
	<li>Rozcieńczony roztwór T3 wstrzyknąć dootrzewnowo (i.p.) obudzonym zwierzętom w objętości 10 μl na gram masy ciała (bwg). Po 24 godzinach zwierzęta zostaną uznane za nadczynność tarczycy. 
	UWAGA: Leczenie T3 można zastąpić dowolnym innym rodzajem leczenia. Zabieg nie ma wpływu na protokół obrazowania in vivo.</li>
</ol>
2. Leczenie niedoczynności tarczycy
UWAGA: Tutaj podano tylko ogólny protokół wywoływania niedoczynności tarczycy u myszy. ATA guide19 opisuje szczegółowe wyjaśnienia dotyczące tła metod z wymienionymi alternatywami.
<ol>
	<li>Zmień dietę na dietę bezjodową i dodaj KClO4 i methimazol do wody pitnej (0,01 % methimazolu, 0,05 % KClO4) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Roztwór do picia należy regularnie (co 2-3 dni) zastępować świeżym roztworem do picia, ponieważ methimazol jest wrażliwy na światło i szybko ulega degradacji.</li>
	<li>Utrzymuj reżim leczenia przez co najmniej 2 tygodnie, nie dłużej niż 4 tygodnie. Zwierzęta stracą na wadze i będą wykazywać dyskomfort. Jeśli zwierzęta prawie się nie poruszają, straciły dużo sierści lub są ledwo przytomne, należy zastosować humanitarny punkt końcowy i usunąć je dowolną metodą (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
	<li>Kontynuuj leczenie niedoczynności tarczycy w połączeniu z innymi metodami leczenia, aby zapobiec potencjalnemu wyzdrowieniu z niedoczynności tarczycy.</li>
</ol>

3. Obrazowanie in vivo
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie kompatybilne z systemem obrazowania in vivo (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zaloguj się i poczekaj, aż załaduje się panel "Kreator obrazowania". Jest to mniejszy panel w lewym dolnym rogu okna.</li>
	<li>W "Kreatorze obrazowania" zainicjuj chłodzenie kamery, klikając przycisk Zainicjuj w panelu "Kreator obrazów". To sprawia, że instrument uruchamia protokół konfiguracji, czekając na jego zakończenie. "Panel Kreatora obrazowania" zmieni kolor na niebieski, a zielone światło zaświeci się w panelu, gdy temperatura aparatu będzie wystarczająco niska, a instrument będzie gotowy.</li>
	<li>Ustaw temperaturę poduszki grzewczej na 30-37 °C, aby utrzymać ciepło mierzonych zwierząt. 
	UWAGA: Kontynuuj zgodnie z protokołem, czekając, aż temperatura kamery będzie optymalna.</li>
	<li>Nie trzymaj ani nie traktuj zwierząt w pobliżu instrumentu. Unikaj nadmiernej ilości włosów krążących w powietrzu wokół instrumentu.</li>
	<li>Znieczulić 1-3 zwierzęta wstrzyknięciem ketaminy-ksylazyny i.p. (ketamina 50 mg/kg masy ciała, ksylazyna 10 mg/kg masy ciała, patrz tabela materiałów). Alternatywnie, jeśli zainstalowany jest system znieczulający izofluranem, postępuj zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami, aby zastosować znieczulenie izofluranem, zastępując mieszaninę ketaminy i ksylazyny. 
	UWAGA: Myszy z niedoczynnością tarczycy są bardziej wrażliwe na ketaminę-ksylazynę; Stosować połowę dawki.</li>
	<li>Podczas znieczulenia należy stosować żel ochronny do oczu.</li>
	<li>Sprawdź odruch pedału, ściskając podnóżki. Brak odruchu pedałowania potwierdza stan znieczulenia płaszczyzną chirurgiczną.</li>
	<li>Po zadziałaniu znieczulenia usuń sierść z obrazowanych części ciała za pomocą najbardziej odpowiedniej metody usuwania sierści (depilator, golenie, krem itp.). Upewnij się, że na obrazowanych częściach ciała nie pozostało futro, aby zapobiec rozpraszaniu światła luminescencyjnego.</li>
	<li>Rozpuścić Na-lucyferynę (patrz tabela materiałów) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w stężeniu 15 mg/ml. Lucyferyna jest wrażliwa na światło; Unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło. Przechowuj roztwór w bursztynowych tubkach lub zawiń go w folię aluminiową.</li>
	<li>Traktować ogolone zwierzęta roztworem lucyferyny 10 μL/bwg i.p.</li>
	<li>Umieść zwierzęta w instrumencie tak, aby punkt środkowy aparatu był oznaczony jako "+" na podkładce. Upewnij się, że rozmieszczenie jest prawidłowe, sprawdzając linie siatki i potwierdzając pojedynczym przechwyceniem "Zdjęcie", jeśli nie masz pewności.</li>
	<li>Odczekaj 15 minut po podaniu substratu przed wykonaniem pierwszego pomiaru. W tym czasie ustaw czas obrazowania w panelu "Kreator obrazów" na 3 minuty dla luminescencji i zaznacz pola Zdjęcie i Luminescencja. "Zdjęcie" jest konieczne, aby zbiegło się z luminescencją w celu zidentyfikowania źródła mierzonego sygnału. 
	UWAGA: 15 minut jest wymagane do optymalnego pobierania substratu i rozprowadzenia w tkankach. Sygnał luminescencyjny stabilizuje się 15-20 minut po podaniu lucyferyny. Po ustabilizowaniu się sygnału zaczyna powoli słabnąć.</li>
	<li>Wykonaj pierwszy pomiar, klikając Zmierz w panelu "Kreator obrazowania".</li>
	<li>Jeśli wykonywane jest zarówno obrazowanie brzuszne, jak i grzbietowe, należy przestawić zwierzęta pod kątem drugiej części ciała, która ma być obrazowana natychmiast po zakończeniu pierwszej.</li>
	<li>Po wykonaniu obrazowania należy umieścić zwierzęta z powrotem w klatkach i kontynuować eksperyment z następnym zestawem zwierząt.</li>
	<li>Pozwól zwierzętom dojść do siebie, co zwykle zajmuje maksymalnie 1-2 godziny. Umieść rurkę wypełnioną ciepłą wodą w pobliżu zwierząt, aby ułatwić powrót do zdrowia i monitoruj parametry życiowe, takie jak oddychanie i perfuzja.</li>
	<li>Zdecyduj o losie mierzonych zwierząt. W danych przedstawionych w tym artykule, mierzone zwierzęta zostały poddane eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami pomiarów ex vivo. Nie jest to jednak konieczne. Zastanów się, czy eutanazja lub dalsze eksperymenty są etyczne.</li>
</ol>

4. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik "ClickInfo" w oprogramowaniu. Po prawej stronie okna otworzy się panel o nazwie "Paleta narzędzi" do analizy i edycji obrazu.</li>
	<li>Konwertuj skalę na blask w lewym górnym rogu obrazu.</li>
	<li>Kliknij "Dostosuj obraz".</li>
	<li>Zdecyduj o optymalnym binningu i skali kolorów obrazów. Spraw, aby wszystkie obrazy korzystały z tych samych ustawień.</li>
	<li>Kliknij "Narzędzia ROI" w "Palecie narzędzi".</li>
	<li>Wybierz obszary zainteresowania, klikając "Umieść ROI" w "Narzędziach ROI". Korzystanie z tych samych rozmiarów ROI lub różnych rozmiarów ROI może być również znaczące w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
	<li>Kliknij "Mierz zwrot z inwestycji". Otworzy się nowe okno z danymi umieszczonych ROI. Eksportuj dane za pomocą polecenia ctr + c-ctrl + v Windows do wybranego oprogramowania organizacyjnego lub statystycznego.</li>
	<li>Dane można eksportować jako całkowity strumień lub średnią radiancję. Wybierz, która zmienna jest najbardziej odpowiednia w bieżącym ustawieniu eksperymentalnym.</li>
	<li>Kontynuuj analizę danych zgodnie z projektem eksperymentalnym. Zaleca się indywidualne obliczanie wartości (tła poddanego działaniu substancji chemicznej) jako "zmierzonego efektu u jednego zwierzęcia".</li>
</ol>

Imaging of Thyroid Hormone Action Indicator Mice to Assess Endocrine Disruption

<ol><li>Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarsen%2C+PR+%22Williams+Textbook+of+Endocrinology%22">Williams Textbook of Endocrinology</a>. Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. , W.B. Saunders Co. 389-515 (1998).</li>
<li>Gereben, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+deiodinase-regulated+thyroid+hormone+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling.</a> Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).</li>
<li>Fekete, C., Lechan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+regulation+of+hypothalamic-pituitary-thyroid+axis+under+physiological+and+pathophysiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions.</a> Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).</li>
<li>Bianco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigms+of+Dynamic+Control+of+Thyroid+Hormone+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling.</a> Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).</li>
<li>Zoeller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+chemicals+and+thyroid+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action.</a> Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).</li>
<li>Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chemical+endocrine+disruptors+and+hormone+modulators+on+the+endocrine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system.</a> Int J Mol Sci. 23 (10), 5710(2022).</li>
<li>La Merrill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+on+the+key+characteristics+of+endocrine-disrupting+chemicals+as+a+basis+for+hazard+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification.</a> Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).</li>
<li>Fini, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+multiwell-based+fluorescent+screen+for+monitoring+vertebrate+thyroid+hormone+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption.</a> Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).</li>
<li>Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid-disrupting+chemicals+and+brain+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update.</a> Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).</li>
<li>Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrabromobisphenol+a+disturbs+brain+development+in+both+thyroid+hormone-dependent+and+-independent+manners+in+xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis.</a> Molecules. 27 (1), 249(2021).</li>
<li>Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+tetrabromobisphenol+A+effects+on+human+glucocorticoid+and+androgen+receptors%3A+A+comparison+of+results+from+human-+with+yeast-based+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays.</a> Toxicology. 370, 70-77 (2016).</li>
<li>Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell-based+assay+for+screening+thyroid+hormone+signaling+disruptors+using+thibz+expression+as+a+sensitive+endpoint+in+xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis.</a> Molecules. 27 (3), 798(2022).</li>
<li>Myosho, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preself-feeding+medaka+fry+provides+a+suitable+screening+system+for+in+vivo+assessment+of+thyroid+hormone-disrupting+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential.</a> Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).</li>
<li>Mohacsik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transgenic+mouse+model+for+detection+of+tissue-specific+thyroid+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action.</a> Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).</li>
<li>Sinko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrabromobisphenol+A+and+diclazuril+evoke+tissue-specific+changes+of+thyroid+hormone+signaling+in+male+thyroid+hormone+action+indicator+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice.</a> Int J Mol Sci. 23 (23), 14782(2022).</li>
<li>Sinko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+hypothalamic+mechanisms+control+decreased+circulating+thyroid+hormone+levels+in+infection+and+fasting-induced+non-thyroidal+illness+syndrome+in+male+thyroid+hormone+action+indicator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice.</a> Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).</li>
<li>Salas-Lucia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+T3+uptake+and+transport+can+trigger+thyroid+hormone+signaling+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain.</a> Elife. 12, 82683(2023).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+%28T3%29+promotes+brown+fat+hyperplasia+via+thyroid+hormone+receptor+alpha+mediated+adipocyte+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation.</a> Nat Commun. 13 (1), 3394(2022).</li>
<li>Bianco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+thyroid+association+guide+to+investigating+thyroid+hormone+economy+and+action+in+rodent+and+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models.</a> Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).</li>
<li>Silva, J. E., Larsen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+activation+of+triiodothyronine+production+in+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue.</a> Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).</li>
<li>Bianco, A. C., Silva, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+conversion+of+thyroxine+to+triiodothyronine+is+required+for+the+optimal+thermogenic+function+of+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue.</a> J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).</li>
<li>Caporale, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cohorts+to+molecules%3A+Adverse+impacts+of+endocrine+disrupting+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures.</a> Science. 375 (6582), 8244(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zagrożenia, jakie dla zdrowia ludzkiego stwarzają substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC), są dobrze znane; jednak badania nad EDC stoją przed ogromnymi wyzwaniami. Wyzwania te wynikają częściowo ze złożoności układu hormonalnego. Stwierdzono, że wiele EDC jednocześnie zakłóca działanie wielu układów hormonalnych22. Dodatkowo, w kontekście gospodarki hormonem tarczycy (TH), istnieje dodatkowa warstwa złożoności wynikająca ze specyficznych dla tkanek różnic w regul...

Sygnalizacja hormonu tarczycy (TH) jest podstawowym regulatorem metabolizmu komórkowego, niezbędnym do prawidłowego rozwoju i optymalnego funkcjonowania tkanek w wieku dorosłym1. W tkankach działanie TH jest precyzyjnie kontrolowane przez złożoną maszynerię molekularną, co pozwala na specyficzne dla tkanki utrzymanie lokalnych poziomów TH. Ta autonomia różnych tkanek od krążących poziomów TH ma ogromne znaczenie2,3,4.
Liczne substancje chemiczne mogą potencjalnie zakłócać funkcje endokrynologiczne i znajdują się w środowisku jako zanieczyszczenia. Coraz większą obawą budzi fakt, że cząsteczki te mogą przedostawać się do łańcucha pokarmowego poprzez ścieki i produkcję rolną, wpływając w ten sposób na zdrowie zwierząt gospodarskich i ludzi5,6,7.
Jednym z istotnych wyzwań w rozwiązaniu tego problemu jest sama liczba zaangażowanych związków, w tym zarówno zatwierdzonych, jak i już zakazanych, ale wciąż stale obecnych molekuł. W ostatnich latach poczyniono znaczne wysiłki w celu opracowania systemów testowych do badań przesiewowych i identyfikacji potencjału destrukcyjnego różnych substancji chemicznych8,9,10,11. Chociaż metody te doskonale sprawdzają się w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych tysięcy związków i identyfikacji potencjalnych zagrożeń, szczegółowa analiza specyficznych skutków in vivo tych cząsteczek jest niezbędna do ustalenia zagrożeń związanych z narażeniem ludzi. W związku z tym konieczne jest wieloaspektowe podejście przy badaniu i charakteryzowaniu substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).
W kontekście regulacji TH, zrozumienie specyficznych dla tkanek konsekwencji ekspozycji na EDC wymaga ilościowego określenia lokalnego działania TH. Chociaż w tym celu opracowano kilka modeli in vivo, większość z nich opiera się na markerach endogennych jako miarze wyjściowej. Pomimo tego, że są fizjologiczne, markery te podlegają licznym mechanizmom regulacyjnym, zarówno bezpośrednim, jak i pośrednim, co utrudnia ich interpretację. W związku z tym scharakteryzowanie wpływu EDC na regulację TH na poziomie tkankowym pozostaje poważnym wyzwaniem12,13.
Aby sprostać wyzwaniom związanym z pomiarem specyficznej tkankowo sygnalizacji TH, niedawno opracowano mysi model Wskaźnika Działania Hormonów Tarczycy (THAI). Model ten pozwala na specyficzną kwantyfikację zmian w lokalnym działaniu TH w warunkach endogenicznych. Do genomu myszy wprowadzono transgen lucyferazy, który jest bardzo wrażliwy na regulację przez działanie TH14. Model ten wykazał skuteczność w odpowiadaniu na różne pytania badawcze, które wymagają ilościowego określenia zmian w lokalnej sygnalizacji TH w tkance14,15,16,17,18.
Rozpoznanie jednego z potencjalnych zastosowań modelu THAI polega na scharakteryzowaniu specyficznych tkankowo efektów EDC na sygnalizację TH. Model ten został ostatnio z powodzeniem wykorzystany do zbadania specyficznego tkankowo wpływu tetrabromobisfenolu A i diklazurilu na sygnalizację TH15. W tym miejscu przedstawiono podstawowe protokoły wykorzystania technik obrazowania in vivo na modelu THAI jako systemu testowego do charakteryzowania EDC, które zakłócają funkcję TH. Metoda ta wykorzystuje bioluminescencyjny charakter reakcji lucyferyna-lucyferazy. Zasadniczo, transgenicznie wyrażony enzym lucyferazy katalizuje utlenianie podanej lucyferyny, generując światło luminescencyjne proporcjonalne do ilości lucyferazy w tkance (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W związku z tym mierzoną odpowiedzią biologiczną jest aktywność lucyferazy, która została zwalidowana jako odpowiednia miara lokalnego działania TH14. Podczas gdy model THAI ma zastosowanie do ilościowego określania działania TH w praktycznie wszystkich tkankach, obrazowanie in vivo koncentruje się przede wszystkim na działaniu TH w jelicie cienkim (obrazowanie brzuszne) i brunatnej tkance tłuszczowej między łopatkami (BAT, obrazowanie grzbietowe)14.
Istotną zaletą techniki obrazowania in vivo jest to, że eliminuje ona potrzebę poświęcania zwierząt do pomiarów. Dzięki temu badacze mogą projektować eksperymenty podłużne i uzupełniające jako badania kontrolowane samodzielnie, zmniejszając stronniczość między uczestnikami i liczbę wykorzystanych zwierząt. Ten aspekt jest szczególnie istotny w charakterystyce EDC, a siła i wszechstronność metody w tym celu została już wcześniej zademonstrowana14,15.

<table><tbody><tr><td>3,5,3'-trójjodotyronina (T3)</td><td>Merck</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>Zwierzęta, myszy</td><td></td><td></td><td>Mysz tajlandzka Żel</td></tr><tr><td>ochronny</td><td>do oczu Oculotect</td><td></td><td>1000 IU/g</td></tr><tr><td>Rurka Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific Objętość</td><td></td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dieta bez jodu</td> Diety <td>badawcze</td><td>niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II obrazowanie in vivo system</td><td>Perkin</td> <td>Elmer-Ketamine</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Vetcentre</td><td>E1857</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Living Image 4.5</td><td>Perkin Elmer-dostarczony</td><td></td> <td>z instrumentem</td></tr><tr><td>Cylinder</td><td></td><td></td> miarowy <td>250 ml</td></tr><tr><td>methimazol</td><td>Merck</td><td>M8506</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do rozcieńczania materiałów do obróbki</td></tr><tr><td>NaClO4</td><td>Merck</td><td>71852</td><td></td></tr><tr><td>Na-lucyferyna, substrat</td><td>Goldbio</td><td>103404-75-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>101052833</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Phoshphate sól fizjologiczna</td><td>Chem Cruz</td><td>sc-362302</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Gilson</td><td></td><td>Do rozcieńczania materiałów do zabiegów</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Axygen</td><td></td><td>Do rozcieńczania materiałów zabiegowych</td></tr><tr><td>Krem do golenia/depilator/golarka</td><td></td><td></td><td>Preferencje osobiste</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>B Braun</td><td></td><td>Objętość 1 ml</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa</td><td>B Braun</td><td></td><td>0,3 x 12 mm</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Vetcentre</td><td>E1852</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy

In vivo Characterization of Endocrine Disrupting Chemical Effects via Thyroid Hormone Action Indicator Mouse

Hormony tarczycy (TH) odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym i funkcjonowaniu tkanek. Gospodarka TH jest podatna na substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC), które mogą zakłócać produkcję lub działanie hormonów. Wiele substancji zanieczyszczających środowisko to substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego, stanowiące nowe zagrożenie zarówno dla zdrowia ludzkiego, jak i dla produkcji rolnej. Doprowadziło to do zwiększonego zapotrzebowania na odpowiednie systemy testowe do badania skutków potencjalnych EDC. Obecne metodologie stoją jednak przed wyzwaniami. Większość systemów testowych wykorzystuje markery endogenne regulowane przez wiele, często złożonych procesów regulacyjnych, co utrudnia rozróżnienie efektów bezpośrednich i pośrednich. Co więcej, systemy badań in vitro nie są tak złożone, jak fizjologiczna złożoność metabolizmu EDC i farmakokinetyki u ssaków. Ponadto narażenie na środowiskowe EDC zwykle wiąże się z mieszaniną wielu związków, w tym metabolitów wytwarzanych in vivo, więc nie można ignorować możliwości interakcji. Ta złożoność sprawia, że charakterystyka EDC jest trudna. Mysz ze wskaźnikiem działania hormonów tarczycy (THAI) jest modelem transgenicznym, który posiada system reporterowy lucyferazy reagujący na TH, umożliwiający ocenę specyficznego tkankowo działania TH. Można ocenić specyficzny tkankowo wpływ substancji chemicznych na lokalne działanie TH poprzez ilościowe określenie ekspresji reporterowej lucyferazy w próbkach tkanek. Ponadto, dzięki obrazowaniu in vivo, mysi model THAI pozwala na prowadzenie badań podłużnych nad wpływem potencjalnych EDC na żywe zwierzęta. Podejście to stanowi potężne narzędzie do testowania długotrwałej ekspozycji, złożonych struktur leczenia lub odstawienia, ponieważ umożliwia ocenę zmian w miejscowym działaniu TH w czasie u tego samego zwierzęcia. Niniejszy raport opisuje proces pomiarów obrazowania in vivo na myszach z Tajlandii. Omawiany tutaj protokół koncentruje się na rozwoju i obrazowaniu myszy z nadczynnością i niedoczynnością tarczycy, które mogą służyć jako kontrola. Naukowcy mogą dostosować lub rozszerzyć prezentowane terapie w celu zaspokojenia swoich konkretnych potrzeb, oferując fundamentalne podejście do dalszych badań.

Zazwyczaj mierzona radiancja mieści się w zakresie od 105 do 1010 p/s/cm2/sr. Jednak dokładne wartości mogą różnić się między zwierzętami na tym samym obrazie oraz pomiędzy różnymi obrazami. W związku z tym porównywanie surowych danych może być mylące. Kluczowe jest ustalenie sygnałów kontrolnych i tła we wszystkich eksperymentach, dlatego wysoce zaleca się stosowanie schematów z kontrolą wewnętrzną.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Mysi model wskaźnika działania hormonu tarczycy został opracowany, aby umożliwić specyficzną tkankowo kwantyfikację lokalnego działania hormonu tarczycy za pomocą jego endogennej maszynerii regulacyjnej. Ostatnio wykazano, że model ten nadaje się do charakteryzowania substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną, oddziałujących z gospodarką hormonów tarczycy, zarówno za pomocą metodologii ex vivo, jak i in vivo.

Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy

Thyroid hormones (TH) play a critical role in cell metabolism and tissue function. TH economy is susceptible to endocrine disrupting chemicals (EDCs) that ...

Substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego są coraz częściej obecnymi zanieczyszczeniami i mogą znacznie zakłócać gospodarkę hormonów tarczycy. Jest to poważny problem, ponieważ hormony tarczycy są ważnymi regulatorami funkcji biologicznych. Jednym z naszych głównych celów jest zmierzenie, czy określone cząsteczki i ich metabolity są w stanie zakłócić gospodarkę hormonów tarczycy in vivo u ssaków.Chociaż istnieją metody badań przesiewowych pod kątem takich związków, niewiele wiadomo na temat ich działania in vivo na tkanki. Wynika to z braku odpowiednich systemów testowych mających na celu scharakteryzowanie ich specyficznego dla tkanek działania. Dodatkowo wymagałoby to ilościowego pomiaru lokalnego działania hormonów tarczycy, co jest również wyzwaniem.Opracowaliśmy mysi model wskaźnika działania hormonów tarczycy (THAI) w celu scharakteryzowania działania hormonów tarczycy w tkankach. Zdaliśmy sobie sprawę, że będzie to wystarczające do zmierzenia wpływu substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na tarczycę w sposób specyficzny dla tkanki. Warto zauważyć, że model THAI pozwoliłby nam to zrobić w żywym organizmie ssaków.Model THAI umożliwia wykrycie in vivo endogennych zmian w miejscowym działaniu hormonów tarczycy poprzez obrazowanie bioluminescencyjne. Umożliwia to wykorzystanie projektów krzyżowych, badań kontrolnych, badań samokontroli i ciągłej ekspozycji na czynniki zakłócające. Warto zauważyć, że model THAI pozwala nam obniżyć wymaganą liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniu.Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie kompatybilne z systemem obrazowania in vivo. Zaloguj się i poczekaj, aż panel kreatora obrazowania w pełni się załaduje. Kliknij przycisk Inicjalizuj na panelu kreatora obrazowania, aby rozpocząć chłodzenie aparatu.Następnie ustaw temperaturę poduszki grzewczej w zakresie od 30 do 37 stopni Celsjusza, aby utrzymać zwierzęta w cieple. Następnie delikatnie uszczypnij opuszki stóp znieczulonych zwierząt, aby ocenić ich odruch pedałowania. Dootrzewnowo wstrzyknąć 10 mikrolitrów na gram masy ciała lucyferyny sodu ogolonym zwierzętom.Teraz ustaw zwierzę względem środka aparatu, jak oznaczono symbolem na przyrządzie do obrazowania. Ustaw czas obrazowania w panelu kreatora obrazów na trzy minuty dla obrazowania luminescencji i zaznacz pola wyboru zarówno dla zdjęcia, jak i luminescencji. Kliknij Pobierz, aby wykonać pierwszy pomiar.Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów przekonwertuj skalę obrazu na promieniowanie. Teraz określ optymalne ustawienia kategoryzacji i skali kolorów dla obrazów i zachowaj jednolitość dla wszystkich obrazów. Następnie kliknij narzędzie ROI w panelu Paleta narzędzi i użyj opcji Umieść ROI, aby wybrać obszary zainteresowania na obrazie.Na koniec kliknij Zmierz zwrot z inwestycji i skopiuj wynikowe dane w celu wyeksportowania do wybranego oprogramowania organizacyjnego lub statystycznego. Obrazowanie in vivo myszy z Tajlandii wykazało, że obszary pozbawione sierści, takie jak opuszki stóp, ogon i nos, miały wyższe sygnały podstawowe. Na sygnał lucyferazy miał wpływ stan hormonów tarczycy.W okolicy jąder zaobserwowano silne sygnały. Działanie hormonów tarczycy było znacznie zwiększone w brunatnej tkance tłuszczowej myszy z Tajlandii zestresowanych zimnem. Leczenie nie wpłynęło na sygnały lucyferazy z opuszków stóp i ogona.W badaniach obrazowych uchwycono również akumulację i klirens diklazurilu, związku zaburzającego funkcjonowanie układu hormonalnego, w okresie trzech tygodni.

in-vivo-characterization-endocrine-disrupting-chemical-effects-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje procedurę ortotopowej inokulacji komórek raka tarczycy do tarczycy mysich modeli, które mogą następnie służyć jako cenna platforma do oceny kancerogenezy i odkrywania potencjalnych strategii leczenia.

Ortotopowa inokulacja komórek raka tarczycy do mysiej tarczycy: procedura ustalania ortotopowego modelu myszy raka tarczycy

Opisujemy rozwój szczupłego modelu myszy podobnego do PCOS z granulką dihydrotestosteronu w celu zbadania patofizjologii PCOS i potomstwa z tych matek podobnych do PCOS.

Hiperandrogenny model myszy do badania zespołu policystycznych jajników

Ten protokół opisuje mysie modele ksenoprzeszczepu i ortotopowego nowotworu ludzkiej tarczycy jako platformę do testowania terapii inhibitorami opartymi na mikroRNA. Takie podejście idealnie nadaje się do badania funkcji niekodujących RNA i ich potencjału jako nowych celów terapeutycznych.

Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

Klinicznie, niedobór estrogenu u kobiet w okresie menopauzy może nasilać występowanie zaburzeń lipidowych i miażdżycy. Ustaliliśmy model niedoboru estrogenu in vivo za pomocą obustronnej owariektomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-. Model mysi ma zastosowanie do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.

Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie

Tutaj prezentujemy standardowy potok do uzyskiwania mysich guzów ATC za pomocą spontanicznych genetycznie modyfikowanych modeli myszy. Ponadto przedstawiamy dynamikę guza i informacje patologiczne o zmianach pierwotnych i przerzutowych. Model ten pomoże naukowcom zrozumieć proces powstawania nowotworów i ułatwi odkrywanie leków.

Samoistny mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli zapalenia tarczycy Hashimoto, podobnie jak spontaniczne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u myszy NOD. Myszy H-2h4 to prosty i niezawodny model do indukcji HT. W tym artykule opisano to podejście i oceniono proces patologiczny w celu lepszego zrozumienia mysiego modelu SAT.

Generacja modelu spontanicznego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy u myszy

Hormon folikulotropowy (FSH) w różnych tkankach i organach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Mysi model owariektomii i leczony FSH (OVF) może być wykorzystany do zbadania pozagonowego działania FSH.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół dla opracowanego ostatnio wszechstronnego testu zachowania, testu belki drabiny. Test ten ma tę zaletę, że wykrywa subtelną ataksję móżdżkową spowodowaną defektem działania hormonów tarczycy w ośrodkowym układzie nerwowym w porównaniu z konwencjonalnymi testami behawioralnymi oceniającymi sprawność motoryczną.

Wszechstronna, behawioralna metoda badania wpływu hormonów tarczycy na funkcjonowanie móżdżku

Protokół opisuje rozwój dwóch modeli gryzoni naśladujących terapie hormonalne afirmujące płeć poprzez podskórne podawanie testosteronu lub estradiolu z octanem cyproteronu (stosowanych w terapiach dla ludzi transpłciowych): ustalanie dawek, identyfikacja odpowiednich biomarkerów i ocena efektów.

Stworzenie modeli szczurów naśladujących terapie hormonalne afirmujące płeć

Protokół ten opisuje metodę kolorymetryczną umożliwiającą wiarygodną ocenę wpływu chemikaliów na aktywność dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandell-Kolthoffa. Zawiera ona z góry określone kryteria akceptacji oraz statystyczne wskaźniki wydajności oraz wspiera dalsze działania na rzecz włączenia wytycznych testowych OECD.

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

Poznaj metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo działania hormonów tarczycy za pomocą modelu THAI u myszy. Technika ta umożliwia ilościowe badanie lokalnych efektów zaburzaczy endokrynnych w tkankach żywego organizmu.

Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy

Przeglądaj więcej filmów