Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Wirusy pseudotypowane są narzędziami molekularnymi, które można wykorzystać do badania interakcji gospodarz-wirus oraz do testowania aktywności neutralizującej próbek surowicy. W pracy, którą dziś prezentujemy, przedstawiona zostanie ogólna metodyka wytwarzania wirusów pseudotypowych na podstawie trzech plazmidów. Do testów neutralizacji zwykle stosuje się wirusy typu Y, ale są one wysoce zjadliwe i nie mogą być obsługiwane w laboratoriach BSL-2, co sprawia, że system ten jest trudny do zastosowania na dużą skalę.

Technologia pseudowirusów może być bezpieczniejszą alternatywą w porównaniu z żywym wirusem, aby umożliwić badanie interakcji patogen-gospodarz i testowanie neutralizującej aktywności przeciwciał. Przyszłe eksperymenty będą badać rolę specyficznych przeciwciał w utrzymaniu odporności po szczepieniu, z wykorzystaniem technologii pseudowirusów. Na początek w 6-dołkowej płytce wysiew jeden mililitr ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki.

Dodaj dwa mililitry kompletnego DMEM. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą pożywką wolną od antybiotyków, aby przygotować komórki do transfekcji. Aby transfekować przylegające komórki, najpierw przygotuj mieszaninę A, dodając plazmidowe DNA do 100 mikrolitrów Opti-MEM.

Następnie dodaj 17,5 mikrolitra polietyleniny do 100 mikrolitrów Opti-MEM. Wymieszać zawartość mieszanki A i B, a następnie inkubować. Podczas inkubacji delikatnie przesuwaj probówkę co trzy do czterech minut, aby usprawnić mieszanie.

Dodać całą objętość mieszaniny do płytki z komórkami HEK 293T. Po 16 do 20 godzinach transfekcji zastąp pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym DMEM. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla, aby wytworzyć wirusy pseudotypowe.

Po 72 godzinach od transfekcji zebrać supernatant do probówki zbiorczej. Odwirować sklarowany sklarent o stężeniu 1600 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować supernatant przez filtr z octanu celulozy o grubości 0,45 mikrometra.

Rozprowadzić 50 mikrolitrów kompletnego DMEM w dołkach 96-dołkowej płytki. Pozostaw wiersz A pusty. Dodać 100 mikrolitrów wywaru pseudowirusa do studzienek w rzędzie A. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów roztworu z rzędu A do B. Powtórzyć ten proces do rzędu G, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia.

Usunąć wyczerpaną pożywkę z płytki z hodowanymi podatnymi komórkami HEK 293T ACE2 i umyć komórki czterema mililitrami DPBS. Następnie odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w soli fizjologicznej DPBS. Teraz dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny podatnych komórek do każdej studzienki zawierającej wirusy pseudotypowe.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika lucyferazy do każdej studzienki. Po inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki do czarnej płytki 96-dołkowej, a następnie odczytać płytkę w czytniku płytek.

Na 96-dołkowej płytce dodaj 50 mikrolitrów świeżego kompletnego DMEM do kolumn od jednego do dziesięciu od rzędu B do H. Dodaj 95 mikrolitrów świeżego kompletnego DMEM do odpowiednich studzienek rzędu A. Teraz dodaj 50 mikrolitrów kompletnego DMEM do studzienek w kolumnie 11 i 100 mikrolitrów DMEM do kolumny 12. Odpipetować pięć mikrolitrów próbek surowicy inaktywowanej termicznie do rzędu A. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać próbki w pierwszym rzędzie i przenieść 50 mikrolitrów surowicy zawierającej podłoże z rzędu A do B, aż do rzędu H. Rozprowadzić 50 mikrolitrów rozcieńczonej pożywki zawierającej pseudowirusa do każdej studzienki z kolumn 1 do 11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę.

Przygotować zawiesinę podatnych komórek HEK 293T ACE2 w pięciu mililitrach. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, a następnie inkubuj przed wykonaniem testu lucyferazy. Mniejsze rozcieńczenie surowicy skutkowało zmniejszonym wnikaniem wirusa do komórek.

Potwierdza to zwiększony procent neutralizacji.