Name: Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych wirusów SARS-CoV-2 w systemie trzech plazmidów do testów neutralizacji przeciwciał. Technika ta umożliwia bezpieczne badanie odpowiedzi immunologicznej w warunkach BSL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wkład wolontariuszy pracowników służby zdrowia. Projekt ten był wspierany przez Department of Excellence 2023/2027, MUR, Włochy. AR i DZ były wspierane przez PRIN2022 (fundusze unijne; NextGenerationEU)

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Uniwersytetu w Veronie (numer protokołu zatwierdzenia 1538) i jest z nią zgodny. Od osób uczestniczących w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę. Próbki krwi pełnej pobrano od ochotników będących pracownikami służby zdrowia (HCW), którzy znajdowali się w procesie szczepień przeciwko SARS-CoV-2. Próbki te zbierano do plastikowych probówek zawierających przeciwkrzepliwe w celu późniejszej izolacji surowicy15.
Wszystkie poniższe procesy muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy 2, w warunkach sterylnych. Praca z wirusem musi być prowadzona z zachowaniem szczególnej ostrożności, a wszystkie odpady muszą zostać zneutralizowane w rozcieńczonym roztworze wybielacza. Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat testu infekcji pseudowirusami SARS-CoV-2, proces infekcji komórek, wynik analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Graficzna reprezentacja testu neutralizacji. (A) produkcja PV, (B) miareczkowanie PV oraz (C) test neutralizacji. Wszystkie procedury są wykonywane w dygestorium biologicznym klasy 2 w warunkach sterylnych. Etap miareczkowania (B) musi zostać przeprowadzony w celu standaryzacji poziomów zakaźności PV przed ich użyciem w teście neutralizacji (C). Rysunek został przygotowany w programie BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
1. Produkcja pseudowirusów (PV) SARS-CoV-2 i test zakaźności
<ol>
	<li>Wysiać 5 x 105 komórek HEK293T w kompletnej pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, wysoka zawartość glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny) do płytki 6-dołkowej (6WP), aby uzyskać gęstość komórek odpowiednią dla stosowanego odczynnika do transfekcji. W przypadku przeprowadzania transfekcji za pomocą polietylenoiminy (PEI) (odczynnik przygotować zgodnie z instrukcją producenta), należy upewnić się, że w dniu transfekcji (krok 1.3) komórki osiągnęły gęstość 40-60%. Komórki przechowywać w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Przed transfekcją zastąpić zużytą pożywkę świeżą pożywką bez antybiotyków (DMEM, wysoka zawartość glukozy, 10% FBS, 1% L-glutaminy), aby uzyskać wyższą wydajność transfekcji. 
	UWAGA: Komórki HEK293T są gotowe do transfekcji dzień po wysianiu.</li>
	<li>Przeprowadzić transfekcję adherentnych komórek HEK293T przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. W przypadku użycia PEI przygotować dwie mieszaniny i postępować zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Aby przygotować mieszaninę A, dodać 500 ng plazmidu pakującego pCMV-dR8.9116, 750 ng plazmidu reporterowego pCSFLW16 oraz 450 ng plazmidu wykazującego ekspresję białka Spike SARS-CoV-2 do 100 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.</li>
		<li>Aby przygotować mieszaninę B, dodać 17,5 µL PEI (stężenie: 1 mg/mL) do 100 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.</li>
		<li>Pozostawić obie mieszaniny do inkubacji w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min. Następnie połączyć zawartość obu probówek, dodając mieszaninę PEI B do mieszaniny DNA A.</li>
		<li>Inkubować probówkę przez 20-30 min w temperaturze RT. Delikatnie potrząsać probówką co 3-4 min w celu usprawnienia mieszania. Na koniec dodać mieszaninę do komórek HEK293T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Od 16 do 20 h po transfekcji zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą, kompletną pożywką DMEM. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby umożliwić produkcję PV przez transfektowane komórki.</li>
	<li>72 h po transfekcji zebrać nadsącz zawierający PV. Następnie wirować przy 1600 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć szczątki komórkowe i martwe komórki, a następnie przefiltrować przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm.</li>
	<li>KROK OPCJONALNY: Aby zwiększyć końcową wydajność miana PV, przeprowadzić wielokrotne transfekcje, połączyć pożywki komórkowe zawierające PV i skoncentrować je za pomocą probówek do koncentracji.</li>
	<li>Przejść bezpośrednio do kolejnych kroków („Miareczkowanie PV”, sekcja 2) lub rozdzielić pożywkę zawierającą PV do odpowiednich probówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Przygotować dodatkową alikwotę (400-500 µL) do miareczkowania. 
	UWAGA: Przygotowanie wielu alikwotów zagwarantuje powtarzalność między eksperymentami poprzez uniknięcie nadmiernej liczby cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Miareczkowanie PV
<ol>
	<li>Użyć świeżego medium zawierającego PV do kolejnych kroków lub rozmrozić alikwot testowy (krok 1.7), aby przeprowadzić miareczkowanie nowego zapasu wirusa. Zamrażanie alikwotów z tego samego zapasu PV zagwarantuje powtarzalność.</li>
	<li>Do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej (96WP) niezbędnych do przeprowadzenia testu zapasu PV w dubletach, z pominięciem rzędu „A”, dodać 50 µL kompletnego DMEM (lub kompletnego medium kompatybilnego z używaną linią komórkową). Do rzędu „A” dodać 100 µL zapasu PV. W zależności od liczby preparacji do przetestowania, pozostawić jedną kolumnę bez wirusa jako kontrolę „same komórki” (Rysunek 2).</li>
	<li>Przenieść pipetą 50 µL z rzędu A do rzędu B i powtórzyć ten proces aż do rzędu G, aby uzyskać rozcieńczenia seryjne zapasu początkowego. Odrzucić nadmiar objętości z ostatniego rzędu.</li>
	<li>Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego 1x (EDTA) w buforze fosforanowym Dulbecco 1x (DPBS 1x), po usunięciu zużytego medium i dwukrotnym przemyciu komórek DPBS 1x. Przygotować komórki o zagęszczeniu 4 x 105 komórek/mL. 
	UWAGA: W niniejszym protokole zakażenie PV testowano na podatnej linii komórkowej HEK293T/ACE2; komórki te pochodziły z linii HEK293T i zostały transdukowane za pomocą wektora lentiwirusowego w celu ekspresji receptora ACE2.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 50 µL zawiesiny komórkowej, aby zapewnić liczbę 2 x 104 komórek na dołek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 h.</li>
	<li>Po inkubacji przeprowadzić test lucyferazy, aby uzyskać odczyt zgodnie z instrukcjami producenta. Do dołków dodać 100 µL odczynnika do lucyferazy i inkubować w ciemności w RT przez 2 min. Przenieść zawartość każdego dołka do czarnej płytki 96-dołkowej (kompatybilnej z dostępnym czytnikiem płytek) i odczytać płytki w czytniku płytek 96-dołkowych. 
	UWAGA: Luminometr użyty do odczytu lucyferazy wygeneruje plik arkusza z surowymi, nieprzetworzonymi danymi, które zostaną wykorzystane do dalszych analiz (w tym przypadku plik Excel). Zakaźność wirusa zostanie wyrażona w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU) (opisano w akapicie 4.1).</li>
</ol>
<img alt="Schemat seryjnych rozcieńczeń PV SARS-CoV-2, układ płytki 96-dołkowej, badanie infekcji wirusowej, hodowla komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej do miareczkowania PV. Stała objętość supernatantu zawierającego PV jest dodawana do wiersza A, kolumn 1-11, a następnie rozcieńczana seryjnie. Ostatnią kolumnę pozostawiono jako kontrolę „same komórki”. Rysunek został wykonany w programie BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Test neutralizacji
<ol>
	<li>Rozmrozić surowice pacjentów na lodzie. Inaktywować próbki surowicy poprzez inkubację w temperaturze 56 °C przez 30 min.</li>
	<li>Do płytki 96-dołkowej dodać 50 µL świeżego, kompletnego DMEM (lub kompletnego medium kompatybilnego z używaną linią komórek docelowych) do każdego z następujących dołków: od rzędu B (kolumny 1-10) do rzędu H (kolumny 1-10). W rzędzie A (kolumny 1-10) umieścić 95 µL świeżego, kompletnego DMEM. Do dołków w kolumnach 11 i 12 dodać odpowiednio 50 µL i 100 µL kompletnego DMEM. Będą to odpowiednio kontrole zainfekowane (kontrola wirusowa, VC) i niezinfekowane (same komórki, CC) (Rysunek 3).</li>
	<li>Do rzędu A (kolumny 1-10) dodać 5 µL termicznie inaktywowanych próbek surowicy/osocza. Każda próbka powinna być wykonana w duplikacie. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać próbki w pierwszym rzędzie i przenieść 50 µL medium zawierającego surowicę z rzędu A do rzędu B. Powtarzać ten proces aż do ostatniego rzędu (Rysunek 3). Pozostałe 50 µL odrzucić.</li>
	<li>Rozmrozić odpowiednią liczbę alikwotów PV i rozcieńczyć do poziomu ≥ 104 RLU/mL. Do każdego dołka (od kolumny 1 do kolumny 11) dodać 50 µL rozcieńczonego medium zawierającego PV za pomocą pipety wielokanałowej, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1 termicznie inaktywowanej surowicy/osocza do wirusa. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 h, aby umożliwić związanie przeciwciał z próbek surowicy z białkiem spike SARS-CoV-2 na PV.</li>
	<li>Przygotować co najmniej 5 mL zawiesiny podatnych komórek (HEK293T/ACE2) o gęstości 4 x 105 komórek/mL. Do każdego dołka dodać 50 µL zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 h.</li>
	<li>Po inkubacji przeprowadzić odczyt testu lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano w kroku 2.7. 
	UWAGA: Luminometr użyty do odczytu lucyferazy wygeneruje plik arkusza kalkulacyjnego (w tym przypadku .xlsx) z surowymi, nieprzetworzonymi danymi, które zostaną wykorzystane do dalszej analizy (plik testu lucyferazy).</li>
</ol>
<img alt="Schemat płytki mikrotitracyjnej z rozcieńczeniem seryjnym dla analizy surowicy w eksperymencie ELISA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentacja płytki w zależności od rozcieńczenia surowicy. Kolor jasnoczerwony odpowiada wyższej ilości surowicy, a jasnoniebieski pasek (kolumna 11) odpowiada kontroli komórek zainfekowanych (VC, kontrola wirusowa). Jasnoniebieski pasek (kolumna 12) odpowiada komórkom niezainfekowanym (CC, kontrola komórkowa). Rysunek został wykonany w programie BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Analiza miareczkowa
<ol>
	<li>W pliku z testem lucyferazy przypisz nazwy/tytuły do odpowiednich próbek.</li>
	<li>Pomnóż wartość RLU przez czynniki rozcieńczenia (od góry do dołu siatki: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x), aby uzyskać RLU/mL. Jeśli zastosowano inne czynniki rozcieńczenia, zmień odpowiednio mnożniki.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość RLU/mL dla każdej preparacji PV.</li>
</ol>
5. Analiza testu neutralizacji PVs
<ol>
	<li>W arkuszu kalkulacyjnym testu lucyferazowego (w tym przypadku plik .xlsx) przypisz odpowiednie nazwy do badanych próbek. Wprowadź czynnik rozcieńczenia próbki (40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1 280x, 2 560x, 5 120x). Oblicz logarytm dziesiętny (Log10) czynników rozcieńczenia.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość RLU dla kontroli niezakażonej i zakażonej (Rycina 3, odpowiednio kolumny 11 i 12). Wartości te będą przydatne do normalizacji w kroku 5.5.</li>
	<li>Otwórz nowy dokument do analizy danych. Wybierz X/Y analysis, wprowadź X jako Numbers, a Y jako Enter 2 replicate values in side-by-side sub-columns.</li>
	<li>Wprowadź wartości Log10 (rozcieńczenia) jako liczby X. Wprowadź duplikaty RLU dla próbek.</li>
	<li>Przejdź do Analyze &gt; Normalize &gt; Flag all dla wszystkich próbek w tym samym arkuszu. Wprowadź średnie wartości VC i CC odpowiednio w polach How is 0% defined? oraz How is 100% defined?. Kliknij OK.</li>
	<li>W arkuszu z danymi znormalizowanymi przejdź do Analyze &gt; XY analyses &gt; Nonlinear analyses (curve fit). Zaznacz wszystkie próbki i kliknij OK. Dla Dose-response - Inhibition wybierz log(inhibitor) vs normalized response - variable slope.</li>
	<li>W sekcji Constrain zmień HillSlope na Must be less than 0.</li>
	<li>W sekcji Output zaznacz Create summary table and graph. Kliknij OK, aby uzyskać końcowe analizy. Arkusz roboczy z szablonem analizy znajduje się w Supplementary File 1.</li>
</ol>

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

<ol><li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963(2012).</li>
<li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945(2021).</li>
<li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-%CE%BAB+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695(2022).</li>
<li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine%2C+antiviral-drugs%2C+and+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993(2022).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963(2018).</li>
<li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern%3A+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693(2022).</li>
<li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses%3A+current+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+pseudotypes%3A+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016(2020).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fourth+generation+lentiviral+Vector%3A+Simplifying+genomic+gymnastics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116(2013).</li>
<li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins%3A+application+in+vaccine+immunogenicity%2C+mAb+potency%2C+and+sero-surveillance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379(2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li>
<li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na%C3%AFve%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38(2021).</li>
<li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+titration%2C+neutralisation%2C+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+%28SARS-CoV-2%29+lentiviral+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236(2021).</li>
<li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants%3A+The+role+of+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li>
<li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li>
<li>Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+in+monoclonal+antibody+neutralization+of+HIV-1+pseudoviruses+and+infectious+molecular+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346(2014).</li>
<li>Chen, M., Zhang, X. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li>
<li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li>
<li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).</li>
<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li>
<li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554(2022).</li>
<li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection%3A+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089(2022).</li>
<li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination%3A+a+mathematical+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li>
<li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63%2C+HKU1%2C+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58(2023).</li>
<li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na%C3%AFve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22(2022).</li>
<li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na%C3%AFve+and+previously+COVID-19-infected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li>
<li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471(2023).</li>
<li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437(2023).</li>
<li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+%28N1-N9%29+and+Influenza+B+%28B%2FVictoria+and+B%2FYamagata%29+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520(2022).</li>
<li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays%3A+a+1-week+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651(2021).</li>
<li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie występują w konflikcie interesów.

Chociaż użycie wirusa typu dzikiego symuluje rzeczywistą infekcję, lentiwirusowe PV są bezpieczniejszą opcją do badania mechanizmów związanych z wnikaniem wirusa i infekcją bez ścisłych wymogów bezpieczeństwa niezbędnych do pracy z wirusami chorobotwórczymi 4,20,21. PV składają się z wadliwego replikacyjnie rdzenia wirusa otoczonego glikoproteiną otoczki powierzchniowej wirusa chorobotwórczego, co jest celem badania.
<p clas...

Pseudotypowane wirusy (PVs) to molekularne narzędzia używane w mikrobiologii do badania interakcji gospodarz-wirus i patogen-patogen1,2,3,4. PV składają się z części wewnętrznej, rdzenia wirusa, który chroni genom wirusa, oraz części zewnętrznej, glikoprotein otoczki na powierzchni wirusa, która definiuje tropizm5. Pseudowirus jest niekompetentny w replikacji w komórce docelowej, ponieważ nie zawiera całej informacji genetycznej potrzebnej do wytworzenia nowych cząstek wirusa. Ta kombinacja szczególnych cech sprawia, że PV są bezpieczną alternatywą dla wirusa typu dzikiego. Z drugiej strony wirusy typu dzikiego są wysoce zjadliwe i nie mogą być używane w laboratoriach BSL 2 do analizy6.
Zakaźność PV może być monitorowana przez gen reporterowy, zwykle kodujący białko fluorescencyjne (GFP, RFP, YFP) lub enzym wytwarzający produkty chemiluminescencyjne (lucyferasa). Jest on zawarty w jednym z plazmidów używanych do produkcji PV i włączony do genomu pseudowirusa7.
Obecnie istnieje kilka rodzajów rdzeni fotowoltaicznych, w tym cząstki pochodzące z lentiwirusa oparte na genomie HIV-1. Ogromną przewagą PV opartych na HIV-1 nad innymi platformami jest ich wewnętrzny proces integracji z genomem komórki docelowej8. Chociaż HIV-1 jest wysoce zaraźliwym wirusem i jest czynnikiem wywołującym AIDS, te wektory lentiwirusowe są bezpieczne w użyciu ze względu na szeroko zakrojone kroki optymalizacji na przestrzeni lat. Optymalne warunki bezpieczeństwa osiągnięto dzięki wprowadzeniu wektorów lentiwirusowych 2. generacji, w których geny wirusa zostały zubożone bez wpływu na zdolności transdukcji9. Trzecie i czwarte pokolenie przyczyniło się do zwiększenia bezpieczeństwa obchodzenia się z wektorami lentiwirusowymi dzięki dalszemu podziałowi genomu wirusa na oddzielne plazmidy10, 11. Najnowsze generacje ogniw fotowoltaicznych są na ogół wykorzystywane do produkcji wektorów lentiwirusowych do terapii genowej.
PVs mogą być używane do badania interakcji między wirusami a komórkami gospodarza, zarówno w fazie produkcji, jak i infekcji. PV są szczególnie stosowane w testach neutralizacji pseudowirusów (PVNA). PVNA są szeroko weryfikowane w celu oceny potencjału neutralizacji surowicy lub osocza poprzez celowanie w wirusową glikoproteinę na otoczce PV12,13. Aktywność neutralizacyjna, wyrażona jako stężenie hamujące 50 (IC50), jest definiowana jako rozcieńczenie surowicy/osocza, które blokuje 50% wejścia cząstek wirusa14. W niniejszym protokole opisaliśmy konfigurację PVNA do badania aktywności przeciwciał przeciwko zespołowi ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej - koronawirusowi 2 (SARS-CoV-2) w surowicach pobranych przed i po otrzymaniu dawki przypominającej szczepionki.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtr m</td><td>SARSTEDT</td><td>83 1826</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>SARSTEDT</td><td>83 3920</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>SARSTEDT</td><td>8,33,924</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15</td><td>Merck</td><td>10403892</td><td></td></tr><tr><td>nieprzezroczysta 96-dołkowa mikropłytka</td><td>Perkin Elmer</td><td>60005270</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D6546 - 500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS 1x)</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>AUROGENE</td><td>AU-S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism wersja 7</td><td>graphpad dotmatics</td><td>NA</td><td>W manuskrypcie zastępujemy nazwę handlową słowem "program do analizy danych"</td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATCC</td><td>Komórki CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T / ACE2</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T zostały transdukowane do nadekspresji ACE2 za pomocą wektora lentiwirusowego.</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Luminometr AUROGENE</td><td>AU-X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>- Victor3</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH35000500</td><td>W rękopisie zastępujemy nazwę handlową na&nbsp; 'luminometr'&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>W manuskrypcie nazwę handlową zastępujemy "pożywką o zredukowanej surowicy"&nbsp;</td></tr><tr><td>p8.91 plazmid opakowania</td><td>Di Genova i wsp., 2021</td><td></td><td>Miły prezent od prof. Nigela Tempertona (ref 16.)</td></tr><tr><td>pCSFLW reporter plazmid</td><td>Di Genova et al., 2021</td><td></td><td>Miły prezent od prof. Nigela Tempertona (ref 16.)</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina, rozgałęziona (PEI) (25 kDa)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td><td>Addgene</td><td>145839</td><td>Ten plazmid został użyty do wytworzenia HEK293Tcells/ACE2</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Plazmid eksprymujący Spike</td><td>Addgene</td><td>pGBW-m4137382</td><td></td></tr><tr><td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin Elmer</td><td>6066759</td><td>W rękopisie zastąpiliśmy nazwę handlową "odczynnikiem do odczytu lucyferazy"</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 1x</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0949-100</td><td></td></tr></tbody></table>

wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko sars-cov-2 za pomocą testu neutralizacji

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotypowane wirusy (PV) to molekularne narzędzia, które mogą być używane do badania interakcji gospodarz-wirus i testowania zdolności neutralizacji próbek surowicy, oprócz ich lepiej znanego zastosowania w terapii genowej do dostarczania interesującego genu. PV są wadliwe w replikacji, ponieważ genom wirusa jest podzielony na różne plazmidy, które nie są włączone do PV. Ten bezpieczny i wszechstronny system pozwala na stosowanie paneli fotowoltaicznych w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. W tym miejscu przedstawiamy ogólną metodologię wytwarzania lentiwirusowych PV w oparciu o trzy plazmidy, jak wspomniano tutaj: (1) plazmid szkieletowy przenoszący gen reporterowy potrzebny do monitorowania infekcji; (2) plazmid pakujący przenoszący geny dla wszystkich białek strukturalnych potrzebnych do wytworzenia PV; (3) plazmid ekspresji glikoproteiny na powierzchni otoczki, który określa tropizm wirusa i pośredniczy w wnikaniu wirusa do komórki gospodarza. W tej pracy kolec SARS-CoV-2 jest glikoproteiną otoczkową wykorzystywaną do produkcji niereplikacyjnych lentiwirusów SARS-CoV-2 z pseudotypem.
Krótko mówiąc, komórki pakujące (HEK293T) były współtransfekowane z trzema różnymi plazmidami przy użyciu standardowych metod. Po 48 godzinach supernatant zawierający PV został zebrany, przefiltrowany i przechowywany w temperaturze -80 °C. Zakaźność PV SARS-CoV-2 badano, badając ekspresję genu reporterowego (lucyferazy) w docelowej linii komórkowej 48 godzin po zakażeniu. Im wyższa wartość względnych jednostek luminescencji (RLU), tym wyższy współczynnik infekcji/transdukcji. Ponadto zakaźne PV dodano do seryjnie rozcieńczonych próbek surowicy w celu zbadania procesu neutralizacji wnikania pseudowirusów do komórek docelowych, mierzonego jako zmniejszenie intensywności RLU: niższe wartości odpowiadające wysokiej aktywności neutralizującej.

Niniejszy protokół opisuje produkcję pseudowirusów (PV) SARS-CoV-2 oraz późniejsze zastosowanie tych PV do analizy aktywności neutralizacyjnej surowicy/osocza osób poddanych szczepieniu przeciw COVID-1917. Ponadto protokół ten można zastosować do produkcji pseudotypów każdego wariantu budzącego niepokój (VOC) SARS-CoV-2 w celu zbadania ewolucji odpowiedzi neutralizacyjnej. Mimo że protokół ten ułatwia badanie humoralnej odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu przeciw COVID-19, można go łatwo dos...

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Wirusy pseudotypowane są narzędziami molekularnymi, które można wykorzystać do badania interakcji gospodarz-wirus oraz do testowania aktywności neutralizującej próbek surowicy. W pracy, którą dziś prezentujemy, przedstawiona zostanie ogólna metodyka wytwarzania wirusów pseudotypowych na podstawie trzech plazmidów. Do testów neutralizacji zwykle stosuje się wirusy typu Y, ale są one wysoce zjadliwe i nie mogą być obsługiwane w laboratoriach BSL-2, co sprawia, że system ten jest trudny do zastosowania na dużą skalę.Technologia pseudowirusów może być bezpieczniejszą alternatywą w porównaniu z żywym wirusem, aby umożliwić badanie interakcji patogen-gospodarz i testowanie neutralizującej aktywności przeciwciał. Przyszłe eksperymenty będą badać rolę specyficznych przeciwciał w utrzymaniu odporności po szczepieniu, z wykorzystaniem technologii pseudowirusów. Na początek w 6-dołkowej płytce wysiew jeden mililitr ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki.Dodaj dwa mililitry kompletnego DMEM. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą pożywką wolną od antybiotyków, aby przygotować komórki do transfekcji. Aby transfekować przylegające komórki, najpierw przygotuj mieszaninę A, dodając plazmidowe DNA do 100 mikrolitrów Opti-MEM.Następnie dodaj 17,5 mikrolitra polietyleniny do 100 mikrolitrów Opti-MEM. Wymieszać zawartość mieszanki A i B, a następnie inkubować. Podczas inkubacji delikatnie przesuwaj probówkę co trzy do czterech minut, aby usprawnić mieszanie.Dodać całą objętość mieszaniny do płytki z komórkami HEK 293T. Po 16 do 20 godzinach transfekcji zastąp pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym DMEM. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla, aby wytworzyć wirusy pseudotypowe.Po 72 godzinach od transfekcji zebrać supernatant do probówki zbiorczej. Odwirować sklarowany sklarent o stężeniu 1600 G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować supernatant przez filtr z octanu celulozy o grubości 0,45 mikrometra.Rozprowadzić 50 mikrolitrów kompletnego DMEM w dołkach 96-dołkowej płytki. Pozostaw wiersz A pusty. Dodać 100 mikrolitrów wywaru pseudowirusa do studzienek w rzędzie A. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów roztworu z rzędu A do B. Powtórzyć ten proces do rzędu G, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia.Usunąć wyczerpaną pożywkę z płytki z hodowanymi podatnymi komórkami HEK 293T ACE2 i umyć komórki czterema mililitrami DPBS. Następnie odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w soli fizjologicznej DPBS. Teraz dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny podatnych komórek do każdej studzienki zawierającej wirusy pseudotypowe.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika lucyferazy do każdej studzienki. Po inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki do czarnej płytki 96-dołkowej, a następnie odczytać płytkę w czytniku płytek.Na 96-dołkowej płytce dodaj 50 mikrolitrów świeżego kompletnego DMEM do kolumn od jednego do dziesięciu od rzędu B do H. Dodaj 95 mikrolitrów świeżego kompletnego DMEM do odpowiednich studzienek rzędu A. Teraz dodaj 50 mikrolitrów kompletnego DMEM do studzienek w kolumnie 11 i 100 mikrolitrów DMEM do kolumny 12. Odpipetować pięć mikrolitrów próbek surowicy inaktywowanej termicznie do rzędu A. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać próbki w pierwszym rzędzie i przenieść 50 mikrolitrów surowicy zawierającej podłoże z rzędu A do B, aż do rzędu H. Rozprowadzić 50 mikrolitrów rozcieńczonej pożywki zawierającej pseudowirusa do każdej studzienki z kolumn 1 do 11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę.Przygotować zawiesinę podatnych komórek HEK 293T ACE2 w pięciu mililitrach. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, a następnie inkubuj przed wykonaniem testu lucyferazy. Mniejsze rozcieńczenie surowicy skutkowało zmniejszonym wnikaniem wirusa do komórek.Potwierdza to zwiększony procent neutralizacji.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film prezentuje test neutralizacji mierzący skuteczność surowicy w neutralizacji wirusów SARS-CoV-2. Obejmuje wirusy pseudotypowane, rozcieńczenie surowicy i kwantyfikację na podstawie luminescencji, ujawniającą miano neutralizacji.

Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych wirusów SARS-CoV-2 w systemie trzech plazmidów do testów neutralizacji przeciwciał. Technika ta umożliwia bezpieczne badanie odpowiedzi immunologicznej w warunkach BSL-2.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji (Wideo) | JoVE Journal

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Przeglądaj więcej filmów