Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)
August 4th, 2023
Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.
Skupiamy się przede wszystkim na zaburzeniach krzepnięcia u pacjentów, którzy doznali urazu mózgu. W tym badaniu staramy się monitorować zmiany w funkcji krzepnięcia za pomocą czasu krzepnięcia aktywności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Nasze zespoły zwróciły uwagę na badania nad uszkodzeniem mózgu, a w urazie mózgu występują ciężkie stany, które nazywamy stanem hiperkoagulacji, jest to bardzo trudne do zmierzenia, a we krwi pacjenta znajdują się mikropęcherzyki, które nazywamy pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, w tym ciało apoptozy, mikropęcherzyki i egzosom.
Różnią się one zdolnością do prokoagulacji, więc musimy znaleźć metodę pomiaru tej zdolności. I ta metoda możemy szybko wyostrzyć, aby znaleźć różnicę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. To bardzo ważne.
W zależności od tej miary możemy zrobić wiele rzeczy. Mamy pewność, że u myszy TPI i pacjenta klinicznego, zwłaszcza w krążeniu obwodowym, będzie to kosztować pewną embolizację, która jest bardzo, bardzo poważna w warunkach klinicznych. Nasz protokół oferował znaczną przewagę w porównaniu z innymi technikami ze względu na swoją prostotę, opłacalność i szybkość.
Pozwala na przeprowadzenie badania krzepliwości krwi przy łóżku pacjenta, eliminując potrzebę intensywnego przetwarzania laboratoryjnego. Nasze badania opracowały nową metodę, która może mierzyć stany hiperkoagulacji krwi obwodowej. Może być stosowany nie tylko w TPI, możemy również stosować w innych chorobach, takich jak suplazja przedrzucawkowa, choroba nowotworowa i hematologiczna.
W przyszłości planowaliśmy zbadać zoo EV ACT w skanowaniu pod kątem klinicznej nadkrzepliwości, stanu, który zwiększa ryzyko zakrzepów krwi. Aby rozpocząć odwirowywanie ludzkiej krwi o stężeniu 120 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia krwinek, należy następnie przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki. Następnie odwirować osocze bogatopłytkowe w celu usunięcia płytek krwi i przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki.
Następnie usuń resztki komórek, odwirowując osocze ubogie w płytki krwi w temperaturze 13 000 G przez dwie minuty. Przenieś górną połowę supernatantu do nowej probówki, włącz analizator skrzepów, aby wykryć pęcherzyk zewnątrzkomórkowy lub czas krzepnięcia aktywowany przez EV i podgrzej instrument do 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj jednorazową sondę i kubek testowy, a następnie rozpocznij procedurę kontroli jakości maszyny.
Po przeprowadzeniu kontroli jakości wprowadź informacje o próbce do systemu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów osocza bogatego w EV do kubka testowego, a następnie 20 milimolowych, 170 mikrolitrów chlorku wapnia. Kliknij przycisk start, zamknij pokrywę i pozwól sondzie wykryć zmianę rezystancji próbki.
Niekwalifikowane próbki EV wykazują wyraźny klaster z nieco większym rozmiarem cząstek w pobliżu bramki EV.In przeciwieństwie do tego, kwalifikowane próbki bogate w EV wykazały większość sygnałów w bramce EV jako pojedyncza grupa. Wzrost stężenia EV, skrócenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV, przy jednoczesnym spadku stężenia EV, wydłużenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV. Próbki osocza bogatego w EV od pacjentów ze stanem przedrzucawkowym, złamaniami szyjki kości udowej i rakiem płuc miały znacznie krótszy czas krzepnięcia aktywowanego EV w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada zaburzenia krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu poprzez monitorowanie funkcji krzepnięcia za pomocą aktywności pozakomórkowych wezykuł (EV). Badanie koncentruje się na stanie nadkrzepliwości, który jest trudny do zmierzenia, i ma na celu opracowanie metody oceny zdolności pro-krzepliwych EV we próbkach krwi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Zaburzenia krzepnięcia
- Pozakomórkowe wezykuły
Tło
- Zaburzenia krzepnięcia są częste u pacjentów z urazami mózgu.
- Pozakomórkowe wezykuły (EV) odgrywają rolę w procesach krzepnięcia.
- Zmierzenie stanu nadkrzepliwości jest złożone.
- Różne typy EV mają różne zdolności pro-krzepliwe.
Cel badania
- Monitorowanie zmian w funkcji krzepnięcia związanych z aktywnością EV.
- Opracowanie metody pomiaru zdolności krzepliwych EV.
- Zwiększenie rozumienia krzepnięcia w przypadkach urazów mózgu.
Stosowane metody
- Zbieranie osocza bogaty w EV poprzez różnicową centryfugację.
- Rekalcyfikacja próbek osocza do analizy.
- Ocena funkcji krzepnięcia za pomocą aktywności EV.
- Monitorowanie mikrowezykuł, w tym ciał apoptotycznych i egzosomów.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano różnice w zdolnościach pro-krzepliwych różnych EV.
- Opracowano szybką metodę oceny stanu krzepnięcia.
- Wykazano znaczenie EV w zrozumieniu zaburzeń krzepnięcia.
- Podano wgląd w związek między urazem mózgu a krzepnięciem.
Wnioski
- Badanie oferuje nowe podejście do pomiaru krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu.
- Pozakomórkowe wezykuły są kluczowymi wskaźnikami zdolności krzepliwych.
- Wymagane są dalsze badania nad klinicznymi implikacjami tych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying the procoagulant activity of extracellular vesicles (EVs) addresses a critical gap in early detection and risk assessment of hypercoagulable states across diverse disease contexts. The EV-Activated Clotting Time (EV-ACT) assay enables rapid, bedside evaluation of EV-driven coagulation, supporting mechanistic de-risking and target validation in translational research. This capability enhances predictive confidence at key inflection points in the discovery and preclinical pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-mediated coagulation pathways relevant to disease mechanisms.
- Supports biological de-risking by quantifying functional procoagulant activity of EVs.
- Facilitates target validation for interventions modulating EV release or activity.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative assay for assessing EV procoagulant function in plasma samples.
- Delivers reproducible, real-time viscoelasticity measurements suitable for assay optimization.
- Enables rapid screening of samples from diverse disease models for hypercoagulability risk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by detecting EV-driven hypercoagulability in preeclampsia, trauma, and cancer samples.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of coagulation biomarkers.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for candidate therapeutics targeting EV pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The EV-ACT assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of EVs in both healthy and disease states.
- Discovery Biology: Quantifies EV-mediated procoagulant activity to clarify mechanistic hypotheses.
- Screening: Provides a rapid, reproducible readout for evaluating sample hypercoagulability.
- Analytics: Generates quantitative clotting time outputs for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models with disease-relevant EV measurements.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for ongoing EV functional studies across indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV-related coagulation mechanisms and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible bedside testing capability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing actionable coagulation risk data early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of programs targeting EV-mediated pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in coagulation biology and EV isolation techniques.
- Needs access to viscoelasticity analyzers and standardized plasma preparation protocols.
- Demands cross-team alignment on assay parameters and data interpretation standards.
- May require adaptation for different disease models or sample types.
- Dependent on quality of EV enrichment and removal procedures for reliable outputs.
