Name: Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Odkryj metodę oznaczania aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT). Technika ta pozwala szybko ocenić zaburzenia krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin, grant nr 81930031, 81901525. Ponadto dziękujemy firmie Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. za dostarczenie nam maszyn i wskazówek technicznych.

Pobieranie próbek od ludzi zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala Ogólnego Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Pobieranie ludzkiej krwi żylnej ściśle przestrzegało wytycznych wydanych przez Narodową Komisję Zdrowia Chin, a mianowicie wytycznych WS/T 661-2020 dotyczących pobierania próbek krwi żylnej. Krótko mówiąc, krew pobrano od zdrowych osób za świadomą zgodą z żyły przedniej części ramiennej, a próbki zmieszano przy użyciu 3,2% antykoagulantu cytrynianu sodu w stosunku 1:9. Gdy pobrano tylko próbki antykoagulantu cytrynianu sodu, pierwsze naczynie zbiorcze zostało odrzucone. Przepływ przetwarzania został zainicjowany w ciągu 0,5 godziny od pobrania próbki. Dorośli zdrowi ochotnicy zostali zrekrutowani do pobrania próbki po uzyskaniu świadomej zgody. Kryteriami wykluczenia pacjentów były: (1) niedawno przebyta zakrzepica wewnątrznaczyniowa, (2) upośledzenie czynności wątroby i nerek, (3) nadciśnienie, hiperlipidemia, cukrzyca i inne choroby przewlekłe, (4) aspiryna lub leki przeciwzakrzepowe, (5) miesiączka i ciąża.
1. Izolacja plazmy bogatej w EV
<ol>
	<li>Odwirować próbki o masie 120 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia krwinek. Supernatantem jest osocze bogatopłytkowe. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipety.</li>
	<li>Odwirować osocze bogatopłytkowe o stężeniu 1500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia płytek krwi. Supernatantem jest osocze ubogie w płytki krwi. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Odwirować osocze ubogie w płytki krwi o sile 13000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórek. Supernatantem jest plazma bogata w EV. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej w celu przeprowadzenia dalszych badań.</li>
</ol>
2. Wykrywanie EV-ACT próbki przez analizator
<ol>
	<li>Włącz analizator skrzepów (patrz Tabela materiałów) i rozgrzej przyrząd do 37 °C. Zainstaluj jednorazową sondę i kubek testowy, a następnie rozpocznij procedurę kontroli jakości urządzenia. 
	UWAGA: Gdy wartość sygnału rezystancji lepkości na ekranie jest wyświetlana jako linia prosta, oznacza to, że detekcja nie jest zakłócana, a kontrola jakości stanu analizatora jest kwalifikowana. Procedurę testowania można rozpocząć po zakwalifikowaniu autotestu.</li>
	<li>Wprowadź przykładowe informacje do systemu. Następnie przenieś 200 μl osocza bogatego w EV do kubka testowego, a następnie 20 mM 170 μl chlorku wapnia. Kliknij przycisk Start. Mieszadło magnetyczne w kubku testowym w pełni wymiesza próbkę i chlorek wapnia. Zamknij pokrywę, a sonda zacznie wykrywać zmianę rezystancji próbki. 
	UWAGA: Po zakończeniu testu analizator automatycznie wyświetli komunikat "test zakończony". Czas EV-ACT jest wyświetlany i rejestrowany przez system. Wynik jest wyrażony w jednostce czasu "sekunda". Wyrzuć sondę i przetestuj kubek.</li>
</ol>
3. Kontrola jakości próbki osocza bogatego w EV oparta na cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>EV zostały najpierw zidentyfikowane na podstawie ich rozmiaru (0,1-1 μm). Dostosuj wcześniej parametry cytometru przepływowego i ustaw "bramkę" EV za pomocą dostępnych w handlu kulek polistyrenowych (0,5, 0,9 i 3,0 μm) (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Mieszanina kulek składa się z kulek fluorescencyjnych o różnych średnicach pokrywających zakres wielkości mikropęcherzyków (0,5 i 0,9 μm) i płytek krwi (0,9 μm i 3 μm).</li>
	<li>Dostosuj napięcie rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego i upewnij się, że mikrosfery 0,9 μm mieszczą się w odpowiednim obszarze. Obszar EV można narysować zgodnie ze średnicą mikrosfery.</li>
	<li>Przenieść 50 μl osocza bogatego w EV do rurki przepływowej, a następnie 450 μl przefiltrowanego buforu fosforanowego soli fizjologicznej. Dokładnie wymieszaj płyn w rurze przepływowej. Na koniec wykryj próbki za pomocą cytometrii przepływowej25.</li>
	<li>Użyj cząstek fluorescencyjnych Ultra Rainbow (patrz tabela materiałów), aby określić ilościowo liczbę EVs.In brief, dodaj 10 μl cząstek do próbki przed wykryciem przepływu i oblicz stężenie EV za pomocą następującego wzoru po zakończeniu wykrywania próbki: 10,120 * EV (#) / (mikrogranulki * objętość) * współczynnik rozcieńczenia26.</li>
</ol>

Assessing Blood Hypercoagulation of EV-Rich Plasma

<ol><li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury%3A+systemic+manifestation+of+a+localized+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li>
<li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothrombotic+state+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Prothrombotic state associated with preeclampsia.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).</li>
<li>Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+thrombosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).</li>
<li>You, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypercoagulability+with+thrombelastography+in+patients+with+hip+fracture+receiving+thromboprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis.</a> Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Zang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-derived+microparticles+as+novel+biomarkers+for+the+diagnosis+of+deep+venous+thrombosis+in+trauma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V%28-%29+and+tissue+factor%28%2B%29+microparticles+as+biomarkers+for+predicting+deep+vein+thrombosis+in+patients+after+joint+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty.</a> Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).</li>
<li>Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles+in+the+pathogenesis+and+early+anticoagulation+of+thrombosis+in+COVID-19+with+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).</li>
<li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).</li>
<li>Cointe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+microparticle+enumeration+across+different+flow+cytometry+platforms%3A+results+of+a+multicenter+collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).</li>
<li>Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+and+platelet-derived+microvesicle+absolute+counts+determined+by+flow+cytometry+correlates+with+a+measurement+of+their+functional+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).</li>
<li>Mooberry, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+microparticles+promote+coagulation+in+a+factor+XI-dependent+manner+in+human+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+microparticles+and+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).</li>
<li>Bolliger, D., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+coagulation+testing+in+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).</li>
<li>Ganter, M. T., Hofer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+monitoring%3A+current+techniques+and+clinical+use+of+viscoelastic+point-of-care+coagulation+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices.</a> Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).</li>
<li>Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+assessment+of+the+anticoagulant+activity+of+direct+oral+anticoagulants%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review.</a> Chest. 151 (1), 127-138 (2017).</li>
<li>Maier, C. L., Sniecinski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulation+monitoring+for+perioperative+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anticoagulation monitoring for perioperative physicians.</a> Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).</li>
<li>Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+in+vivo+evaluation+of+hemostasis%3A+Spatial+thrombodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics.</a> Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).</li>
<li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+coagulation+activity+in+hip+fracture+patients%3A+A+case-control+study+using+rotational+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).</li>
<li>Premkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19-related+dynamic+coagulation+disturbances+and+anticoagulation+strategies+using+conventional+D-dimer+and+point-of-care+Sonoclot+tests%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study.</a> BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).</li>
<li>Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+thromboelastography+and+thromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Anestesiologica%22%5BJournal%5D)">Comparison between thromboelastography and thromboelastometry.</a> Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16F+mediated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release+on+erythrocyte+contribute+to+hypercoagulable+state+in+hyperuricemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperuricemia+enhances+procoagulant+activity+of+vascular+endothelial+cells+through+TMEM16F+regulated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release.</a> The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPs-ACT%2C+an+assay+to+evaluate+the+procoagulant+activity+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+extracellular+vesicles+induce+vasoconstriction+and+reduce+cerebral+blood+flow+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice.</a> Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microvesicles+levels+and+effects+of+associated+factors+in+elderly+patients+with+obstructive+sleep+apnea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung disease.</a> Chest. 153 (1), 210-216 (2018).</li>
<li>Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Hypertension+Reports%22%5BJournal%5D)">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).</li>
<li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications%3B+emphasis+on+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861(2019).</li>
<li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li>
<li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+endothelial+locus-1+%28Del-1%29+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li>
<li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li>
<li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+removal+by+single-step+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability%3A+a+clinical+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis%2C+treatment%2C+and+prognosis+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).</li>
<li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714(2023).</li>
<li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy zadeklarowali, że nie ma potencjalnych konfliktów interesów.

W pracy opisano sposób otrzymywania osocza bogatego w EV, a także zweryfikowano zasadność metody za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie ponownie zwapnione próbki osocza analizowano pod kątem czasu ACT za pomocą analizatora skrzepów opartego na zasadach lepkosprężystości24. Jak pokazano na rysunku 3A, stwierdzono, że stężenie EV uzyskane w wyniku ultrawirowania skraca czas EV-ACT, podczas gdy supernatant po ultrawirowaniu, który obniżył poziomy EV, wykazywał wydł...

Zakrzepica, która jest spowodowana nadkrzepliwością, odgrywa znaczącą rolę w różnych chorobach, w tym urazach mózgu1, stanie przedrzucawkowym2, guzy3, oraz pacjenci ze złamaniami4. Mechanizm leżący u podstaw nadkrzepliwości jest złożony, a ostatnio położono nacisk na rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w zaburzeniach krzepnięcia. EV to ciała przypominające pęcherzyki o dwuwarstwowej strukturze, które odłączają się od błony komórkowej, o średnicy od 10 nm do 1000 nm. Są one związane z różnymi procesami chorobowymi, w szczególności zaburzeniami krzepnięcia5. Kilka badań zidentyfikowało EV jako obiecujący predyktor ryzyka zakrzepicy6,7. Aktywność prokoagulantyczna EV zależy od ekspresji czynników krzepnięcia, przede wszystkim czynnika tkankowego (TF) i fosfatydyloseryny (PS). EV o silnej aktywności prokoagulacyjnej znacznie zwiększają wydajność katalityczną kompleksu tenazy i protrombiny, promując w ten sposób fibrynogen za pośrednictwem trombiny i miejscową zakrzepicę8. Podwyższony poziom EV i ich związek przyczynowy z nadkrzepliwością zaobserwowano w wielu chorobach9. W związku z tym standaryzacja wykrywania EV i raportowanie ich aktywności prokoagulacyjnej jest ważnym obszarem badań10.
Do tej pory dostępnych jest tylko kilka komercyjnych zestawów do wykrywania aktywności prokoagulacyjnej pojazdów elektrycznych. Test MP-Activity i test MP-TF, wyprodukowane przez firmę komercyjną, są testami funkcjonalnymi stosowanymi do pomiaru aktywności prokoagulantu EV w klasie plasma<sup="xref">11. Testy te wykorzystują zasadę podobną do testów immunoenzymatycznych do wykrywania PS i TF na EV. Jednak zestawy te są drogie i ograniczone do kilku instytucji badawczych wysokiego poziomu. Proces ten jest złożony i czasochłonny, co sprawia, że wdrożenie ich w warunkach klinicznych jest trudne. Dodatkowo, komercyjnie opracowany test prokoagulantu fosfolipidowego (PPL) miesza osocze wolne od PS z osoczem testowym, mierząc czas krzepnięcia w celu ilościowego wykrycia poziomów PS-dodatnich EVs12. Jednak testy te koncentrują się przede wszystkim na PS i TF na EV, pomijając inne szlaki krzepnięcia, w które mogą być zaangażowane krążące EV12.
System krzepnięcia plazmy jest skomplikowany i składa się zarówno z "niewidocznych", jak i "widocznych" komponentów, w tym koagulantów, antykoagulantów, systemów fibrynolitycznych i EV zawieszonych w osoczu. Fizjologicznie składniki te utrzymują dynamiczną równowagę. W stanach patologicznych znacznie zwiększone EV w krążeniu przyczyniają się do nadkrzepliwości, szczególnie u pacjentów z urazami mózgu, stanem przedrzucawkowym, złamaniami i różnymi rodzajami raka13. Obecnie ocena stanu krzepnięcia w laboratoriach klinicznych obejmuje przede wszystkim ocenę układu krzepnięcia, układu przeciwzakrzepowego i fibrynolizy14,15,16,17. Czas protrombinowy, czas częściowej tromboplastyny po aktywacji, czas trombinowy i międzynarodowy współczynnik znormalizowany są powszechnie używane do oceny poziomów czynnika krzepnięcia w systemie krzepnięcia18. Jednak ostatnie badania wykazały, że testy te nie odzwierciedlają w pełni nadkrzepliwości niektórych chorób19. Inne metody testowe, takie jak tromboelastometria (TEG), rotacyjna TEG i analiza Sonoclot, mierzą zmiany lepkosprężyste krwi pełnej20,21. Ponieważ próbki krwi pełnej zawierają liczne komórki krwi i płytki krwi, testy te z większym prawdopodobieństwem wskażą stan krzepnięcia próbki jako całości. Niektórzy badacze donosili o roli komórek krwi i płytek krwi w aktywności prokoagulantu22,23. Niedawne badanie wykazało również, że poprzednie testy funkcji krzepnięcia napotykają trudności w wykrywaniu zmian w aktywności prokoagulacyjnej mikrocząstek24. W związku z tym zaproponowano hipotezę, że funkcję prokoagulacyjną EV można ocenić za pomocą lepkosprężystych pomiarów czasu krzepnięcia aktywnego (ACT) w osoczu bogatym w EV.

<table><tbody><tr><td>AccuCount Ultra Tęczowe cząstki fluorescencyjne</td><td>3,8 mikrom; Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td><td></td><td>Do ilościowego wykrywania MP</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Werfen (Chiny)</td><td>0020006800</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>Century Analizator skrzepów</td><td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td><td></td><td>Zasada polega na pomiarze lepkości osocza metodą lepkosprężystą</td></tr><tr><td>Jednorazowa sonda i kubek testowy</td><td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR Fortessa</td><td>BD, USA</td><td></td><td>Służy do wykrywania</td></tr><tr><td>kulek polistyrenowych MP Megamix</td><td>Biocytex, Marsylia, Francja</td><td>7801</td><td>Megamix składa się z mieszaniny mikrogranulek o wybranych średnicach: 0,5 i mikro; m, 0,9 i mikro; m oraz 3 &mikro;m.</td></tr></tbody></table>

oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (ev) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez ev (ev-act)

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

Rola pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w różnych chorobach zyskuje coraz większą uwagę, szczególnie ze względu na ich silne działanie prokoagulacyjne. Istnieje jednak pilna potrzeba przeprowadzenia testu przyłóżkowego w celu oceny aktywności prokoagulacyjnej EV w warunkach klinicznych. W badaniu tym zaproponowano wykorzystanie czasu aktywacji trombiny w osoczu bogatym w EV jako miary aktywności prokoagulacyjnej EV. Zastosowano standardowe procedury w celu uzyskania pełnej krwi z cytrynianem sodu, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania osocza bogatego w EV. Osocze bogate w EV i chlorek wapnia dodano do kubka testowego, a zmiany lepkosprężystości monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora. Określono naturalny czas krzepnięcia osocza bogatego w EV, określany jako EV-ACT. Wyniki wykazały znaczny wzrost EV-ACT, gdy EV został usunięty z osocza uzyskanego od zdrowych ochotników, podczas gdy znacznie zmniejszył się, gdy EV został wzbogacony. Co więcej, EV-ACT został znacznie skrócony w próbkach ludzkich ze stanu przedrzucawkowego, złamania szyjki kości udowej i raka płuc, co wskazuje na podwyższony poziom EV w osoczu i promowanie nadkrzepliwości krwi. Dzięki prostej i szybkiej procedurze, EV-ACT jest obiecującym testem przyłóżkowym do oceny funkcji krzepnięcia u pacjentów z wysokim poziomem EV w osoczu.

Czas aktywacji trombiny w osoczu bogatym w EV zmierzono przy użyciu analizatora metodą wiskoelastyczną do pomiaru czasu krzepnięcia osocza. Urządzenie składa się z czterech głównych komponentów: przetwornika sygnału elektronicznego, sondy, zbiornika detekcyjnego i elementu grzejnego (Rysunek 1A,B). Sonda wykorzystuje oscylacje o wysokiej częstotliwości i niskiej amplitudzie do wykrywania zmian lepkości osocza. Codzienna kontrola jakości obejmuje przede wszystkim kontrolę jak...

Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

Skupiamy się przede wszystkim na zaburzeniach krzepnięcia u pacjentów, którzy doznali urazu mózgu. W tym badaniu staramy się monitorować zmiany w funkcji krzepnięcia za pomocą czasu krzepnięcia aktywności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Nasze zespoły zwróciły uwagę na badania nad uszkodzeniem mózgu, a w urazie mózgu występują ciężkie stany, które nazywamy stanem hiperkoagulacji, jest to bardzo trudne do zmierzenia, a we krwi pacjenta znajdują się mikropęcherzyki, które nazywamy pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, w tym ciało apoptozy, mikropęcherzyki i egzosom.Różnią się one zdolnością do prokoagulacji, więc musimy znaleźć metodę pomiaru tej zdolności. I ta metoda możemy szybko wyostrzyć, aby znaleźć różnicę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. To bardzo ważne.W zależności od tej miary możemy zrobić wiele rzeczy. Mamy pewność, że u myszy TPI i pacjenta klinicznego, zwłaszcza w krążeniu obwodowym, będzie to kosztować pewną embolizację, która jest bardzo, bardzo poważna w warunkach klinicznych. Nasz protokół oferował znaczną przewagę w porównaniu z innymi technikami ze względu na swoją prostotę, opłacalność i szybkość.Pozwala na przeprowadzenie badania krzepliwości krwi przy łóżku pacjenta, eliminując potrzebę intensywnego przetwarzania laboratoryjnego. Nasze badania opracowały nową metodę, która może mierzyć stany hiperkoagulacji krwi obwodowej. Może być stosowany nie tylko w TPI, możemy również stosować w innych chorobach, takich jak suplazja przedrzucawkowa, choroba nowotworowa i hematologiczna.W przyszłości planowaliśmy zbadać zoo EV ACT w skanowaniu pod kątem klinicznej nadkrzepliwości, stanu, który zwiększa ryzyko zakrzepów krwi. Aby rozpocząć odwirowywanie ludzkiej krwi o stężeniu 120 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia krwinek, należy następnie przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki. Następnie odwirować osocze bogatopłytkowe w celu usunięcia płytek krwi i przenieść górną połowę supernatantu do nowej probówki.Następnie usuń resztki komórek, odwirowując osocze ubogie w płytki krwi w temperaturze 13 000 G przez dwie minuty. Przenieś górną połowę supernatantu do nowej probówki, włącz analizator skrzepów, aby wykryć pęcherzyk zewnątrzkomórkowy lub czas krzepnięcia aktywowany przez EV i podgrzej instrument do 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj jednorazową sondę i kubek testowy, a następnie rozpocznij procedurę kontroli jakości maszyny.Po przeprowadzeniu kontroli jakości wprowadź informacje o próbce do systemu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów osocza bogatego w EV do kubka testowego, a następnie 20 milimolowych, 170 mikrolitrów chlorku wapnia. Kliknij przycisk start, zamknij pokrywę i pozwól sondzie wykryć zmianę rezystancji próbki.Niekwalifikowane próbki EV wykazują wyraźny klaster z nieco większym rozmiarem cząstek w pobliżu bramki EV.In przeciwieństwie do tego, kwalifikowane próbki bogate w EV wykazały większość sygnałów w bramce EV jako pojedyncza grupa. Wzrost stężenia EV, skrócenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV, przy jednoczesnym spadku stężenia EV, wydłużenie czasu krzepnięcia aktywowanego EV. Próbki osocza bogatego w EV od pacjentów ze stanem przedrzucawkowym, złamaniami szyjki kości udowej i rakiem płuc miały znacznie krótszy czas krzepnięcia aktywowanego EV w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami.

determination-procoagulant-activity-extracellular-vesicle-ev-using-ev

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.

Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Odkryj metodę oznaczania aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT). Technika ta pozwala szybko ocenić zaburzenia krzepnięcia u pacjentów z urazami mózgu.

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT) (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)

Przeglądaj więcej filmów