Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji
September 8th, 2023
Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.
Nasze badania mają na celu standaryzację LAMP jako testu prediagnostycznego odpowiedniego do pracy w terenie lub podstawowej opieki zdrowotnej, np. w zaawansowanej infrastrukturze laboratoryjnej. Staramy się promować stosowanie lokalnie produkowanych i alternatywnych barwników, zmniejszając niezależność od importowanych zestawów komercyjnych. Obecnie CRISPR-Cas jest wydajnym systemem wykorzystywanym do opracowywania szybkich, specyficznych i czułych metod diagnostycznych patogenów.
Obecnie system ten posiada szeroką gamę enzymów i suplementów Cas do wykrywania celów RNA lub DNA w różnych próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na zapobieganiu amplifikacji niedocelowej wynikającej z zanieczyszczenia amplikonem i pierwotnej amplifikacji komórek, zwłaszcza w przypadku długich starterów podatnych na tworzenie dimerów. Dodatkowo dążymy do określenia optymalnych warunków reakcji, aby uzyskać zwykle rozróżnialną zmianę koloru barwnika.
Po standaryzacji i pełnej walidacji metoda ta może być łatwo wdrożona i dostosowana do dowolnego laboratorium lub punktu opieki w ciągu 60 minut przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu do wykrywania prawie każdego patogenu. W związku z tym może być potencjalnie stosowany w ośrodkach podstawowej opieki zdrowotnej w celu przeprowadzenia w odpowiednim czasie nadzoru epidemiologicznego. Nasza multidyscyplinarna grupa koncentruje się na odkrywaniu cząsteczek z rodzimych roślin kolumbijskich, próbując zidentyfikować potencjał do zahamowania replikacji wirusów takich jak denga, Zika czy SARS-CoV-2.
Ponadto prowadzimy badania mające na celu opracowanie metod diagnostyki molekularnej tych wirusów. Aby rozpocząć, włącz szafę z laminarnym przepływem powietrza, pozwalając jej ustabilizować się na trzy minuty. W asepcie wyczyść i zdezynfekuj wewnętrzne powierzchnie szafy za pomocą następujących środków dezynfekujących.
Po zdezynfekowaniu wszelkich materiałów, które dostaną się do szafki, umieść w niej serwetki i rękawiczki nitrylowe. Następnie wyłącz szafkę i wystaw ją na działanie światła ultrafioletowego przez 15 minut. Po naświetlaniu należy ponownie uruchomić szafkę.
Umieść odczynniki do projektowania podkładu w lodówce wypełnionej lodem. Po odkażeniu go 70% etanolem umieść pojemnik w szafce. Przygotuj amplifikację izotermiczną za pośrednictwem pętli lub mieszaninę LAMP w 0,6 mililitrowej probówce mikrowirówkowej.
Odpipetować mieszaninę, aby ją homogenizować. Następnie inkubuj zamknięte rurki w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie schłodzić rurki w wypełnionej lodem chłodziarki polistyrenowej przez pięć minut.
Po schłodzeniu umieść rurki w komorze z przepływem laminarnym. Aby uzupełnić mieszaninę LAMP, dodaj cztery mikrolitry polimerazy DNA, a następnie jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy. Aby przeprowadzić detekcję kolorymetryczną, dodaj barwnik, błękit hydroksynaptolowy.
Po dodaniu odczynnika odpipetuj każdy roztwór, aby prawidłowo wymieszać odczynniki LAMP. Następnie odpipetuj 22 mikrolitry roztworu do probówek PCR, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Do kontroli ujemnej dodać trzy mikrolitry 0,1% wody dietylopirowęglanowej.
Odłóż na bok wszelkie pozostałe probówki do dodania materiału genetycznego. Następnie usuń wszystkie materiały z szafki. Po zdezynfekowaniu powierzchni szafki 70% etanolem wyłącz ją.
W oddzielnym obszarze dodaj trzy mikrolitry próbki do każdej probówki PCR i dobrze odpipetuj mikropipetą o pojemności 20 mikrolitrów, aby dokładnie zhomogenizować. Przed rozpoczęciem reakcji kolorymetrycznej należy użyć wysokiej jakości aparatu, aby zrobić zdjęcia probówek PCR. Teraz przeprowadź reakcję za pomocą termocyklera i łaźni wodnej.
W przypadku termocyklera umieść rurki w bloku reakcyjnym i ustaw profil termiczny na urządzeniu. Jeśli korzystasz z łaźni wodnej, bezpiecznie umieść rurki w okrągłych pojemnikach, a następnie umieść te pojemniki w łaźni wodnej w temperaturze 66,3 stopni Celsjusza na 60 minut. Po upływie czasu reakcji wyjmij probówki i przechowuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia.
Jeśli przeprowadzono reakcję kolorymetryczną, uchwyć obrazy PCR za pomocą wysokiej jakości kamery. Gradient temperatury wykazał, że optymalna temperatura topnienia wynosiła 66,3 stopni Celsjusza. Stężenie enzymu BST 3.0 zoptymalizowano do 3,2 jednostki międzynarodowej na mikrolitr.
Aby określić strategię kolorymetryczną, oceniono czerwień fenolową i neutralne czerwone barwniki. Jednak po amplifikacji nie zaobserwowano zmiany koloru. Przeprowadzono standaryzację różnych stężeń błękitu hydroksynaptolowego, przy czym optymalna zmiana zaszła przy 125 mikromolach błękitu hydroksynaptolowego.
Amplifikowane próbki wykazały zmianę barwy w zależności od ich stężenia. Amplifikacja próbki została dodatkowo potwierdzona za pomocą elektroforezy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia zstandardyzowany protokół wykrywania wirusa SARS-CoV-2 z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji pętlowej amplifikacji izotermicznej (RT-LAMP). Jest zaprojektowany dla środowisk o ograniczonych zasobach, umożliwiając szybką detekcję w ciągu 60 minut przy użyciu niedrogiego sprzętu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Diagnostyka infekcji wirusowych
- Wdrożenie metod LAMP
- Niskobudżetowe rozwiązania opieki zdrowotnej
Tło
- Znaczenie terminowej detekcji SARS-CoV-2
- Potrzeba niedrogich narzędzi diagnostycznych
- Wyzwania w obecnych metodach diagnostyki molekularnej
Stosowane metody
- Odwrotna transkrypcja pętlowa amplifikacja izotermiczna (RT-LAMP)
- Użycie lokalnych buforów i barwników
- Wykrywanie kolorymetryczne z użyciem niebiesi hydroxynapthol
Główne wyniki
- Opracowanie szybkiej, specyficznej i czułej metody diagnostycznej
- Optymalizacja warunków reakcji prowadząca do obserwowalnych zmian kolorów
- Walidacja przydatności metody do zastosowania w opiece pierwotnej
Wnioski
- Protokół umożliwia wydajne, tanie wykrywanie patogenów
- Ma potencjał do szerokiego zastosowania w nadzorze epidemiologicznym
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, low-cost molecular diagnostics such as RT-LAMP are critical for early detection and containment of emerging viral threats in both centralized and decentralized settings. This protocol enables scalable, field-deployable detection of SARS-CoV-2 and other pathogens, supporting portfolio-wide risk mitigation and timely epidemiological surveillance. Its adaptability and minimal infrastructure requirements position it as a strategic asset for biopharma R&D and public health response pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of viral presence in biological samples for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by confirming nucleic acid amplification specificity.
- Facilitates functional validation of primer and dye combinations for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible workflow for nucleic acid detection assays.
- Delivers quantitative and qualitative outputs via colorimetric and electrophoretic readouts.
- Enables scalable assay deployment in resource-limited and high-throughput settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies for infectious disease surveillance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of diagnostic reagents.
- Reduces risk of late-stage assay failure through early standardization and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This RT-LAMP protocol integrates into the diagnostic discovery continuum from early assay development through translational deployment in field and clinical settings.
- Discovery Biology: Confirms target nucleic acid presence and primer specificity for hypothesis testing.
- Screening: Standardizes colorimetric and electrophoretic outputs for reliable assay comparison.
- Analytics: Provides measurable color change and gel electrophoresis data for condition assessment.
- Translational Research: Bridges laboratory assay development with field-ready diagnostic implementation.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for detection of diverse pathogens beyond SARS-CoV-2.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in viral detection workflows.
- Operational Value: Enables rapid, low-cost, and reproducible diagnostics with minimal infrastructure.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic candidates and supports scalable surveillance.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and surveillance assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design, nucleic acid handling, and colorimetric assay interpretation.
- Needs basic molecular biology instrumentation such as thermal cyclers or water baths and imaging devices.
- Demands cross-team standardization of reagent preparation and contamination control protocols.
- Adaptable across various sample types and pathogens with appropriate primer redesign.
- Potential limitations include risk of non-target amplification and need for dye optimization, as supported by source data.
