Name: Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj metodę RT-LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 w zasobach ograniczonych. Ta technika izotermiczna umożliwia szybką, specyficzną i tanią diagnostykę w ciągu 60 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Sistema General de Regalías z Kolumbii, grant numer BPIN 2020000100092, oraz Universidad Icesi - Convocatoria Interna, grant numer CA0413119. MFVT był również finansowany z funduszy adiunktury z Universidad de los Andes. Podmioty finansujące nie brały udziału w projektowaniu, realizacji działań, gromadzeniu i analizie danych oraz przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Szpitalowi Uniwersyteckiemu Fundación Valle del Lili za wirusowe RNA z próbek Sars-CoV-2 oraz dr Alvaro Barrera-Ocampo za komentarze do manuskryptu.

Użyte próbki zostały dostarczone przez laboratorium kliniczne szpitala uniwersyteckiego Fundación Valle del Lili i odpowiadały oczyszczonemu RNA od pacjentów, którzy uzyskali pozytywny wynik testu na COVID-19 za pomocą techniki RT-qPCR. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę na badanie, a badanie to zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną ds. badań na ludziach ze szpitala uniwersyteckiego Fundación Valle del Lili.
1. Projekt i przygotowanie podkładu RT-LAMP
UWAGA: Startery LAMP mogą być używane z różnymi platformami, w tym New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer i LAMP assay versatile analysis (LAVA). W przypadku tego protokołu wykorzystano jednak narzędzie NEB LAMP. Projektowanie starterów można wykonać przy użyciu genomów SARS-CoV-2 uzyskanych z bazy danych NextStrain10. Tabela 1 przedstawia zestaw starterów używany w tym protokole.
<ol>
	<li>Projekt podkładu do LAMP
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencje genomu wirusa.</li>
		<li>Wykonaj wyrównanie sekwencji, aby uzyskać sekwencję konsensusu.</li>
		<li>Przejdź do narzędzia do projektowania podkładów NEB LAMP platforma11 i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w krótkim przewodniku. To narzędzie daje takie same wyniki jak primer explorer V5, ale jest znacznie bardziej przyjazne dla użytkownika w swoich wynikach. Korzystaj z podręczników użytkownika eksploratora podkładów jako przewodnika przy projektowaniu podkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena termodynamiczna zestawu starterów
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia Primer-Dimer12, aby przeprowadzić analizę termodynamiczną otrzymanych starterów.</li>
		<li>Umieść sekwencje podkładu w narzędziu. Następnie wybierz opcję Analiza multipleksowa i Raport struktury ściemniania.</li>
		<li>Wybierz zestawy podkładów, które mają ΔG nie mniejsze niż -5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena swoistości projektowanych podkładów
	<ol>
		<li>Użyj bazy danych kolekcji nukleotydów (nt/nt) w BLAST13, aby przeanalizować każdy starter.</li>
		<li>Aby przeprowadzić pierwszą analizę BLAST, należy wybrać Refseq_rna Bazę Danych i przefiltrować wyszukiwanie według grupy rodzajów należących do podrodziny Orthocoronavirinae. Są to: Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) i Deltacoronavirus (taxid:1159901). Ponadto oceń sekwencję w stosunku do innych wirusów, które krążą jako podtyp H1N1 (taxid:114727), wirus grypy A (taxid:11320) i wirus grypy B (taxid:11520).</li>
		<li>Aby przeprowadzić drugą analizę BLAST, wybierz Betacoronavirus GenBank i przefiltruj wyszukiwanie według Coronaviridae (taxid:11118) i SARS (taxid:694009). Grupy te zawierają sekwencje wszystkich zidentyfikowanych genomów koronawirusa SARS, w tym genomów znalezionych u nietoperzy, Betacoronavirus (taxid:694002).</li>
		<li>W przypadku tego protokołu upewnij się, że startery nie są zgodne z genomami innymi niż genom docelowy, SARS-CoV-2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podkładu
	<ol>
		<li>Odwirować fiolki zawierające jofilizowane startery za pomocą mikrowirówki (10 000 x g, 1 min w temperaturze pokojowej [RT]), aby uniknąć strat podczas otwierania probówki.</li>
		<li>Ponownie uwodnić jjofilizowany proszek w 0,1% wodzie z pirowęglanu dietylu (DEPC) lub wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM (Tabela 2) i dokładnie rozpuścić, pipetując w górę iw dół. Następnie wirować z maksymalną prędkością (10 000 x g, 1 min przy suchej smocie) w mikrowirówce, aby zebrać wszystkie roztwory startera na dnie probówki.</li>
		<li>Przygotować 10-krotną mieszankę starterów w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przednim wewnętrznym starterem (FIP), wstecznym wewnętrznym starterem (BIP), przednim zewnętrznym starterem (F3), wstecznym zewnętrznym starterem (B3), pętlowym wstecznym (LB) i pętlowym do przodu (LF), jak podano w Tabeli 2. Aby zapobiec stratom, należy pipetować lub delikatnie zagmatwać roztwór startera przed wykonaniem szybkiego wirowania (10 000 x g, 1 min przy suchej stężeniu względnej) za pomocą mikrowirówki.</li>
		<li>Przechowuj 10-krotną mieszankę starterów w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania; jednak przygotuj się na maksymalnie pięć eksperymentów, niezależnie od kilku próbek, aby uniknąć zbyt wielu cykli zamrażania i rozmrażania. 
		UWAGA Jeśli potrzebna jest mniejsza objętość mieszanki podkładowej, dostosuj wartości, obliczając nowe objętości (Tabela 2). Ponadto zestawy RdRp i RdRp/Hel nie zawierają startera LF, ponieważ startery pętlowe nie są wymagane do reakcji RT-LAMP. W rezultacie zastąp objętość startera LF wodą wolną od nukleaz lub 0,1% wodą DEPC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Reakcja RT-LAMP
<ol>
	<li>Włącz komorę z przepływem laminarnym zgodnie z instrukcjami producenta i odczekaj co najmniej 3 minuty, aż przepływ powietrza się ustabilizuje.</li>
	<li>Gdy przepływ powietrza ustabilizuje się, wyczyść i zdezynfekuj wewnętrzne powierzchnie szafy przy użyciu techniki aseptycznej. Aby to osiągnąć, użyj następujących środków dezynfekujących w następującej kolejności: 1000 ppm czwartorzędowego amoniaku (chlorek benzalkoniowy), 2% podchlorynu, 3% nadtlenku wodoru i 70% etanolu. 
	UWAGA: W tym przypadku technika aseptyczna polega na nałożeniu środka dezynfekującego i usunięciu go serwetkami z wnętrza kabiny na zewnątrz bez przechodzenia przez wcześniej oczyszczone powierzchnie.</li>
	<li>Używając środków dezynfekujących z kroku 2.2, wyczyść materiały, które wejdą do kabiny, w tej samej kolejności. 
	UWAGA: Do szafki należy włożyć mikropipety, pudełka z końcówkami filtrującymi, kolby z probówkami o pojemności 1,5 ml i 0,6 ml, probówki do PCR o pojemności 0,2 ml, stojaki i zlewkę o pojemności 400 ml.</li>
	<li>Przynieś do kabiny serwetki i rękawiczki nitrylowe. Następnie wyłącz szafkę i wystaw ją na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 15 minut. 
	UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanek i DNA w wyniku długotrwałej ekspozycji na promieniowanie, należy unikać światła UV do momentu upływu czasu ustawionego w kroku 2.4. 
	UWAGA Wykonaj montaż pokazany w Rysunek 2 przed rozpoczęciem protokołu i rozpocznij kąpiel wodną po wykonaniu kroku 2.4. Bardzo ważne jest, aby napełnić metalowy pojemnik prawie po brzegi wodą pitną i ustawić temperaturę laboratoryjnej płyty grzewczej żelazka na 90 °C, ponieważ spowoduje to temperaturę w układzie ~66,3 °C, która jest monitorowana termometrem rtęciowym.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu naświetlania należy ponownie uruchomić komorę i postępować zgodnie z zaleceniami podanymi w kroku 1.1.</li>
	<li>Umieść odczynniki (Tabela 3, Tabela 4 i Tabela 5) w lodówce wypełnionej lodem lub małej lodówce polistyrenowej. Umieść pojemnik w szafce po umyciu go 70% etanolem.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 0,6 ml przygotuj mieszaninę LAMP genu, który ma być amplifikowany (RdRp, N-A i RdRp/Hel), dodając tylko następujące składniki: 10x bufor, MgSO4, dNTPs, 1x mieszanina starterów i woda wolna od nukleaz lub 0,1% wody DEPC; dobrze wymieszaj pipetując do homogenizacji. 
	UWAGA: Ze względu na niewłaściwą obsługę i zachowanie wewnątrz szafy istnieje wysokie ryzyko zanieczyszczenia odczynnikami. Aby złagodzić ten problem, należy przestrzegać następujących zasad: (i) używaj sterylnych i filtrujących końcówek; (ii) używać jednej końcówki do każdego odczynnika; (iii) poruszać się powoli i ostrożnie, aby uniknąć zakłócenia przepływu laminarnego; (iv) utrzymywać porządek i używać jak najmniejszej ilości materiałów; oraz (v) używać różnych rękawiczek do przygotowania mieszanki i dodania materiału genetycznego. 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki, zwłaszcza enzymy, należy przechowywać na lodzie, ponieważ zmiany temperatury mogą je denaturować i zmieniać aktywność polimerazy.</li>
	<li>Umieścić probówkę (probówki) o pojemności 0,6 ml z zakrętką zamkniętą w bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut 
	UWAGA: Włączyć blok grzewczy dla probówek 1,5-2,0 ml znajdujących się na zewnątrz szafki na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem przygotowania mieszanki LAMP i monitorować temperaturę (95 °C) za pomocą termometru rtęciowego lub alkoholowego.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji umieść probówki w wypełnionej lodem chłodziarce polistyrenowej na 5 minut.</li>
	<li>Umieść probówki z powrotem w komorze laminarnej i zakończ przygotowanie mieszanki LAMP, dodając enzymy polimerazę DNA (Bst 3.0), odwrotną transkryptazę i polimerazę DNA o wysokiej wierności (Tabela 3, Tabela 4 i Tabela 5). W przypadku stosowania detekcji kolorymetrycznej należy dodać barwnik błękit hydroksynaftolowy (HNB).</li>
	<li>Po dodaniu tych odczynników należy bardzo dobrze wymieszać odczynniki LAMP, pipetując je w celu rozpuszczenia enzymów i barwnika.</li>
	<li>Napełnij każdą probówkę PCR 22,0 μl mieszanki, uważając, aby nie tworzyć bąbelków. Następnie dodać 3,0 μl 0,1% wody DEPC lub wody wolnej od nukleaz do kontroli ujemnej lub probówki bez próbki matrycowej (NTC) i odłożyć na bok pozostałą probówkę (probówki) do dodania (materiału genetycznego). 
	UWAGA: Probówki do PCR należy przechowywać w lodówce wypełnionej lodem do czasu dodania próbki, aby uniknąć aktywacji enzymu Bst 3.0 i przedwczesnego rozpoczęcia reakcji.</li>
	<li>Usuń wszystkie materiały z szafki i użyj 70% etanolu do czyszczenia powierzchni. Następnie wyłącz go zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>W oddzielnym miejscu dodaj 3 μl próbki do każdej probówki PCR i dokładnie ją homogenizuj. W tym celu należy użyć mikropipety o pojemności 20 μl i końcówek filtrujących. 
	UWAGA: Mikropipeta używana do dodawania materiału genetycznego musi być używana wyłącznie do tego celu i nie może być używana do przygotowania mieszanki. W ten sposób unika się zanieczyszczenia odczynników. Dodatkowo próbki RNA należy zawsze utrzymywać na lodzie, aby zmniejszyć możliwość degradacji RNA. Do dodania próbki należy użyć następujących środków ochrony osobistej (PPE): jednorazowy fartuch, czapka, maska N95, legginsy, gogle laboratoryjne i rękawice nitrylowe.</li>
	<li>Przed wykonaniem reakcji kolorymetrycznej należy sfotografować probówki PCR za pomocą wysokiej jakości aparatu. Kolorem wyjściowym z HNB jest fioletowy.</li>
	<li>Reakcję należy przeprowadzić w następującym układzie lub urządzeniu: (i) termocyklerze i (ii) łaźni wodnej.
	<ol>
		<li>Termocykler: Umieść probówki w bloku reakcyjnym i ustaw termoprofil (patrz Tabela 6) na urządzeniu.</li>
		<li>Kąpiel wodna: Umieść rurki w okrągłych pojemnikach i bardzo dobrze je wyreguluj, aby zapobiec ich wydostaniu się. Następnie umieść pojemniki w łaźni wodnej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A, B) w temperaturze podanej w tabeli 6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku łaźni wodnej, gdy rurki znajdą się wewnątrz systemu, uruchom timer na 60 minut (Tabela 6).</li>
	<li>Po upływie czasu reakcji wyjąć probówki z termocyklera lub łaźni wodnej i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia procesu elektroforetycznego lub w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Jeśli przeprowadzono reakcję kolorymetryczną, należy sfotografować probówki PCR za pomocą wysokiej jakości aparatu. Końcowy kolor z HNB to błękit nieba.</li>
</ol>
3. Analiza produktów amplifikacji w żelu agarozowym
UWAGA: Te kroki są sugerowane jako dodatkowe kontrole reakcji kolorymetrycznej lub kontroli wydajności podczas etapu standaryzacji. Dzieje się tak, ponieważ technika ta może stwarzać ogromne ryzyko zanieczyszczenia dla laboratorium wykonującego te testy.
<ol>
	<li>Umieść złoże w komorze elektroforetycznej tak, aby gumy krawędziowe stykały się ze ściankami, tworząc szczelną przestrzeń do dodania agarozy (komora wewnętrzna) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A, B).</li>
	<li>Po wykonaniu kroku 3.1 zważyć niezbędną ilość agarozy w zlewce o pojemności 500 ml, aby uzyskać 2% żel. Następnie dodaj wymaganą objętość 0,5x buforu tris-acetate EDTA (TAE) i mikrofaluj przez 1-2 min. 
	UWAGA: Agaroza jest całkowicie stopiona, gdy jest półprzezroczysta i pozbawiona grudek po wyjęciu z piekarnika. Jeśli nie zostanie to potwierdzone, mogą pozostać słabo zżelowane obszary, powodując zmianę przebiegu elektroforetycznego i wizualizacji produktów amplifikacji.</li>
	<li>Wyjmij zlewkę z piekarnika i wlej agarozę do wewnętrznej komory utworzonej w kroku 3.1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Następnie sprawdź, czy nie ma pęcherzyków, a jeśli są, usuń je za pomocą końcówki do mikropipet.</li>
	<li>Ułóż grzebień tak, aby uformował dołki i pozostaw agarozę do zżelowania na około 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po tym czasie dodaj 5 ml 0,5x buforu TAE, aby ułatwić usunięcie grzebieni i łoża zawierającego żel. Następnie umieść żel w taki sposób, aby studzienki znajdowały się w anodzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Napełnij komorę elektroforezy buforem 0,5x TAE do pojemności określonej przez producenta, upewniając się, że elektrody stykają się z buforem.</li>
	<li>Dodać 3 μl markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka żelu i dodać 9 μl NTC i każdą próbkę do następnych studzienek. Dokonać ich przez połączenie 7 μl produktu amplifikacji z 3 μl buforu ładującego; następnie załadować 9 μl tej mieszaniny do studzienek żelu.</li>
	<li>Przykryj komorę elektroforezy pokrywą i podłącz do portów zasilania w kolorze wzorze. Ustaw źródło zasilania na następujące parametry: 100 V i stałe natężenie prądu przez 120 min.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu elektroforetycznego umieścić żel w pojemniku z roztworem barwiącym (bromek etydyny) i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji usuń żel z roztworu barwiącego i umieść go w woreczku z zamkiem błyskawicznym. Zapobiega to zanieczyszczeniu sprzętu, który będzie używany do wizualizacji amplikonów.</li>
	<li>Wizualizacja żelu na transiluminatorze lub imagerze, takim jak Amersham Imager 600.</li>
</ol>

Using Colorimetric and RT-LAMP Analysis to Detect SARS-CoV-2 

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Who+coronavirus+%28COVID-19%29+dashboard+%28no+date%29%22">Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date)</a>. , https://covid19.who.int/ (2023).</li>
<li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic%3A+types%2C+challenges+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li>
<li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+in+Latin+America%3A+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+%28Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America%29%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan%2C+China%2C+from+Jan+to+Feb+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li>
<li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li>
<li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+principle%2C+features%2C+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid%2C+sensitive%2C+specific%2C+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182(2020).</li>
<li>Nextstrain. , https://nextstrain.org/ (2023).</li>
<li>Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).</li>
<li>PrimerDimer. , http://www.primer-dimer.com/ (2023).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information. Blast: Basic local alignment search tool (no date). , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (2023).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+%28COVID-19%29+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li>
<li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNajafov%2C+A+%22PCR+Guru%22">PCR Guru</a>. , Elsevier, Academic Press. (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li>
<li>Ramírez-Chavarría, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy%3A+A+SARS-CoV-2+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosensors%22%5BJournal%5D)">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230(2023).</li>
<li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484(2021).</li>
<li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li>
</ol>

Natalia Campillo-Pedroza jest Prezesem Zarządu firmy BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż RT-LAMP jest uważana za uzupełniającą metodologię przeprowadzania diagnostyki molekularnej, ma również pewne ograniczenia i krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę, gdy protokół jest standaryzowany i wdrażany.
Standaryzacja LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 oceniła następujące parametry i składniki mieszanki wzorcowej: (a) stężenie i temperaturę wyrównania starterów; b) stężenie enzymów; c) stężenie magnezu; d) czas reakcji; e) włączenie dodatków, takich jak BSA, DMSO, chlorek guanid...

Wirus SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) wywołuje chorobę COVID-19 (coronavirus disease 2019). Światowa Organizacja Zdrowia ogłosiła stan zagrożenia zdrowia publicznego o znaczeniu międzynarodowym 30 stycznia 2020 r. oraz pandemię 11 marca 2020 r. Do dnia napisania tego artykułu pandemia spowodowała ponad 760 milionów zachorowań i 6,87 miliona zgonów1.
Wpływ tego wirusa podkreślił potrzebę opracowania lepszych, dokładniejszych, szybszych i bardziej powszechnie dostępnych narzędzi nadzoru w celu usprawnienia wykrywania i kontroli chorób zakaźnych2,3. Podczas pandemii testy diagnostyczne SARS-CoV-2 opierały się na wykrywaniu kwasów nukleinowych, przeciwciał i białek, jednak wykrywanie kwasów nukleinowych za pomocą RT-PCR pozostaje złotym standardem4. RT-PCR posiada jednak pewne ograniczenia; wymaga specjalistycznego sprzętu, infrastruktury oraz personelu przeszkolonego w zakresie biologii molekularnej, co ogranicza jego zastosowanie do wyspecjalizowanych laboratoriów. Ponadto metoda ta jest czasochłonna (4-6 h), nie wliczając czasu transportu próbek do laboratorium, który może trwać wiele dni5. Ograniczenia te uniemożliwiają efektywne przetwarzanie próbek i pozyskiwanie informacji niezbędnych do planowania działań awaryjnych oraz zarządzania epidemiologicznego.
Izotermiczna amplifikacja zapętlona z odwrotną transkrypcją (RT-LAMP) posiada kilka zalet w porównaniu z RT-PCR, co czyni ją atrakcyjną strategią projektowania przyszłych testów diagnostycznych w punkcie opieki (POCT), szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów6. Po pierwsze, charakteryzuje się ona wysoką specyficznością, ponieważ wykorzystuje od czterech do sześciu starterów rozpoznających od sześciu do ośmiu obszarów w sekwencji docelowej, niezależnie od tego, czy jest to DNA, czy RNA7,8. Po drugie, ze względu na to, że proces przebiega w stałej temperaturze, nie wymaga on zaawansowanego sprzętu, takiego jak termocyklery czasu rzeczywistego do przeprowadzenia amplifikacji, ani wysoko wykwalifikowanego personelu do jego obsługi. Po trzecie, czas reakcji jest bardzo krótki (~60 min), a stosowane odczynniki nie są bardzo specjalistyczne, co czyni tę metodę narzędziem kosztowo efektywnym6. Biorąc pod uwagę powyższe oraz stan zagrożenia zdrowia publicznego spowodowany pandemią COVID-19, technikę tę można postrzegać jako alternatywną metodę diagnostyczną, która jest szybka, niedroga i łatwa do wdrożenia w każdym laboratorium badawczym9.
W niniejszym artykule opisano protokół standaryzacji i wdrażania metody RT-LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 za pomocą metod kolorymetrycznych z wykorzystaniem termocyklera i łaźni wodnej (Rysunek 1). Omówiono punkty krytyczne, ich ograniczenia oraz alternatywne rozwiązania służące do ich usprawnienia.
<img alt="Schemat pracy RT-qPCR dla COVID-19: przygotowanie mastermixu, cykli termicznych, analiza wyników elektroforezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu amplifikacji SARS-CoV-2 z wykorzystaniem techniki RT-LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>1 kb Drabinka DNA</td><td>SOLIS BIODYNE</td><td>07-12-00050</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>50x TAE Bufor do elektroforezy</td><td>ThermoScientific</td><td>B49</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Accuris High Fidelity Polymerase</td><td>ACCURIS ODCZYNNIKI DO NAUKI NATURALNEJ</td><td>PR1000-HF-200</td><td>Może być stosowany w przypadku, gdy nie można kupić polimerazy Q5 High-Fidelity DNA. Dla enzymu należy przygotować podwielokrotności o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>PanReacAppliChem</td><td>A8963,0100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bst 3.0 Polimeraza DNA 8000 IU/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>M0374S/M0374L</td><td>Dla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Zestaw roztworów deoksynukleotydów (dNTP) New</td><td>England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220-25G&nbsp;</td><td>Obchodź się z nim ostrożnie pod szafką wyciągową</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, gotowy do użycia</td><td>ThermoScientific</td><td>SM0322</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Hydroksynaftol niebieska sól disodowa</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215156B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności 2000 IU / ml&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S/M0491L</td><td>Dla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza WarmStart RTx 15000 j.m./ml</td><td>New England BioLabs</td><td>M0380S/M0380L</td><td>Dla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C do momentu użycia.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusa sars-cov-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

Wirus koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) dramatycznie wpłynął na ludzkie zdrowie. Nadal stanowi zagrożenie dla współczesnego społeczeństwa, ponieważ wiele osób umiera w wyniku infekcji. Chorobę diagnozuje się za pomocą testów serologicznych i molekularnych, takich jak złoty standard reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Ten ostatni ma kilka wad, ponieważ wymaga specjalistycznej infrastruktury, kosztownego sprzętu i wyszkolonego personelu. W tym miejscu przedstawiamy protokół przedstawiający kroki wymagane do wykrycia wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) w próbkach ludzkich. Protokół zawiera instrukcję projektowania starterów in silico, przygotowania odczynników, amplifikacji i wizualizacji. Po standaryzacji metodę tę można łatwo wdrożyć i dostosować do dowolnego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem w ciągu 60 minut, przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu. Jest przystosowany do wykrywania różnych patogenów. W związku z tym może być potencjalnie stosowany w terenie i w ośrodkach zdrowia do prowadzenia terminowego nadzoru epidemiologicznego.

Wdrożenie protokołu rozpoczyna się od zaprojektowania zestawu starterów dla każdego genu docelowego zgodnie z opisanym powyżej protokołem. W czerwcu 2020 roku z bazy danych NextStrain pobrano 5 000 genomów SARS-CoV-2, z czego 10% stanowiły genomy pochodzące z Kolumbii. Sekwencje te zostały dopasowane w celu uzyskania sekwencji konsensusu, która posłużyła w procesie projektowania starterów. Tabela 1 przedstawia zestaw starterów wybranych dla RdRp/Hel oraz RdRp. Zestaw starterów do amplifikacji genu N pobr...

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

Nasze badania mają na celu standaryzację LAMP jako testu prediagnostycznego odpowiedniego do pracy w terenie lub podstawowej opieki zdrowotnej, np. w zaawansowanej infrastrukturze laboratoryjnej. Staramy się promować stosowanie lokalnie produkowanych i alternatywnych barwników, zmniejszając niezależność od importowanych zestawów komercyjnych. Obecnie CRISPR-Cas jest wydajnym systemem wykorzystywanym do opracowywania szybkich, specyficznych i czułych metod diagnostycznych patogenów.Obecnie system ten posiada szeroką gamę enzymów i suplementów Cas do wykrywania celów RNA lub DNA w różnych próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na zapobieganiu amplifikacji niedocelowej wynikającej z zanieczyszczenia amplikonem i pierwotnej amplifikacji komórek, zwłaszcza w przypadku długich starterów podatnych na tworzenie dimerów. Dodatkowo dążymy do określenia optymalnych warunków reakcji, aby uzyskać zwykle rozróżnialną zmianę koloru barwnika.Po standaryzacji i pełnej walidacji metoda ta może być łatwo wdrożona i dostosowana do dowolnego laboratorium lub punktu opieki w ciągu 60 minut przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu do wykrywa

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy test RT-LAMP do wykrywania TiLV u ryb tilapia za pomocą prostych narzędzi w stosunkowo krótkim okresie czasu w porównaniu do konwencjonalnych technik RT-PCR. Protokół ten może pomóc w kontrolowaniu rozprzestrzeniania się epidemii TiLVD, zwłaszcza w krajach rozwijających się.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Poznaj metodę RT-LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 w zasobach ograniczonych. Ta technika izotermiczna umożliwia szybką, specyficzną i tanią diagnostykę w ciągu 60 minut.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Przeglądaj więcej filmów