Izolacja docelowych neuronów podwzgórza do badań regulacji hormonalnej, metabolicznej i elektrycznej

Zakres naszych badań polega na badaniu zaburzeń metabolicznych w odniesieniu do dysfunkcji podwzgórza. Jesteśmy zainteresowani badaniem biochemicznego i komórkowego mechanizmu docelowego pierwotnego neuronu podwzgórza ssaków, zwłaszcza tego, który wyraża receptor leptyny. Podwzgórze to złożony obszar mózgu zajmujący się utrzymaniem karmienia, snu, motywacji i metabolizmu.

A to sugeruje bardzo zróżnicowaną społeczność neuronalną. Tylko kilka z tej populacji zostało dokładnie przebadanych, a większość pozostałych wymaga dalszych badań i dalszego wyjaśnienia ich mechanizmu komórkowego. Neurony podwzgórza i ich funkcja są badane głównie za pomocą elektrofizjologii, chemogenetyki i optogenetyki.

Techniki te są bardzo pouczające w odniesieniu do zrozumienia zachowania zwierząt i obwodów mózgowych. Jednak bardzo niewiele wiadomo na temat mechanizmu komórkowego i molekularnego, który napędza to zachowanie. I tylko patrząc głębiej na poziom komórkowy, możemy wypełnić te luki.

Zacznij od wypolerowania na gorąco trzech pipet Pasteura za pomocą palnika Bunsena, tworząc zmniejszające się średnice. Następnie wysterylizuj brzuch ciężarnej myszy poddanej eutanazji 70% etanolem. Rozetnij jamę brzuszną od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego klatki piersiowej.

Teraz wyjmij róg macicy z jamy brzusznej i umieść go na 100-milimetrowej płytce wypełnionej lodowatym roztworem HBSS. Wyciągnij i oddziel wszystkie zarodki od umytej macicy za pomocą cienkich kleszczy. Szybko odetnij głowy wyekstrahowanym zarodkom myszy i umieść głowy na 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej HBSS.

Umieść parę cienkich kleszczy w jamie oka, aby przytrzymać mózg. Kolejną parą obierz skórę i czaszkę, aż mózg będzie widoczny. Wyjmij mózg z opuszki węchowej z czaszki i odwróć go do góry nogami.

Obserwuj korę po stronie brzusznej i podwzgórze po stronie grzbietowej. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby usunąć warstwę opon mózgowych i naczyń krwionośnych, aż mózg stanie się biały i czysty, a następnie oddziel obszar podwzgórza od reszty mózgu. Pokrój podwzgórze na trzy do czterech małych drobnych kawałków i za pomocą pipety przenieś kawałki do 15-mililitrowej probówki.

Następnie napełnij probówkę sześcioma mililitrami HBSS. Następnie dodaj enzym, wymieszaj jeden, gdy tkanka opadnie, a supernatant zostanie usunięty. Inkubuj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, mieszając co pięć minut w celu ponownego zawieszenia tkanki.

Teraz dodaj 30 mikrolitrów enzymu, wymieszaj dwa i zdysocjuj tkankę, pipetując w górę iw dół 10 razy z dużą średnicą obok pipety. Po dodatkowych 10 minutach inkubacji dodaj pozostałe 15 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej dwa. Używając dwóch polerowanych ogniowo pipet o zmniejszającej się średnicy, odpipetuj tkankę 10 razy.

Natychmiast dodaj 10 mililitrów HBSS z 0,5% BSA do probówki, a następnie odwiruj probówkę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze HBSS z 0,5% BSA. Rozpocznij od odwirowania izolowanej zawiesiny komórek mózgowych w stężeniu 300 G przez osiem minut.

Zawiesić osad w 80 mikrolitrach HBSS z 0,5% roztworem BSA. Dodaj 20 mikrolitrów koktajlu przeciwciał biotyny nieneuronalnej i inkubuj. Umyj komórki dwoma mililitrami HBSS z 0,5% BSA, a następnie ponownie zawieś osad wirówki w 80 mikrolitrach HBSS z 0,5% BSA.

Teraz dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny i odpipetuj do dokładnego wymieszania. Po inkubacji na zimno dodać 0,5 mililitra roztworu HBSS/BSA. Ustaw stojak przed przepłukaniem kolumny 0,5 mililitra HBSS z 0,5% BSA.

Następnie umieść 15-mililitrową rurkę pod kolumną i przepuść przez nią 0,5 mililitra zawiesiny komórek. Wykonaj trzy płukania 0,5 mililitra HBSS z 0,5% roztworem BSA, aby wychwycić resztki komórek nerwowych. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej 15-mililitrowej tubie.

Dodaj jeden mililitr HBSS z 0,5% BSA i użyj tłoka, aby zebrać magnetycznie znakowane komórki nieneuronalne. Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze HBSS z 0,5% roztworem BSA. Policz komórki w komorze liczącej Neubauera pod mikroskopem jasnego pola.

Neurony LepR dodatnie zaczęły tworzyć neuryty po 48 godzinach. W DIV4 rozszerzenia aksonów wykazały postęp, podczas gdy zaczęły pojawiać się procesy dendrytyczne. W DIV6 neurony były wystarczająco rozwinięte.

Badania immunofluorescencyjne wykazały, że nie zaobserwowano komórek glejowych ani innych komórek nieneuronalnych. Neuronalna natura komórek została potwierdzona przez barwienie białkiem-2 związanym z mikrotubulami. W DIV10 30% komórek LepR dodatnich ulega ekspresji POMC.

Łączność i funkcjonalność synaps zaobserwowano w kulturach ogólnych zawierających heterogeniczne populacje neuronów podwzgórza. Rozpocznij od odwirowania mysiej zawiesiny czystych komórek nerwowych w stężeniu 300 G przez osiem minut. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach HBSS z roztworem 0,5 BSA.

Po dodaniu specyficznego przeciwciała inkubować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Przepłukać nadmiar przeciwciał roztworem HBSS/BSA i odwirować. Dodać 20 mikrolitrów antybiotyku i mikrogranulek do osadu zawieszonego w HBSS/BSA.

Inkubować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 0,5 mililitra HBSS z 0,5% roztworem BSA na każde 10 do siedmiu komórek. Przepłukać kolumnę 0,5 mililitra HBSS 0,5% roztworem BSA.

Gdy kapanie ustanie, umieść 15-mililitrową rurkę pod kolumną i przepuść przez nią 0,5 mililitra zawiesiny komórek. Zebrać eluent zawierający niespecyficzne komórki neuronalne, a następnie oczyścić kolumnę trzema płukaniami 0,5 mililitra HBSS z 0,5% BSA. Teraz wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej 15-mililitrowej tubie.

Dodaj jeden mililitr HBSS z 0,5% BSA i użyj tłoka, aby wypłukać docelowe komórki. Po odwirowaniu i aspiracji supernatantu ponownie zawiesić osad w 0,5 mililitra podłoża galwanicznego. Policz komórki w komorze liczącej Neubauera pod mikroskopem jasnego pola.

Na przygotowanej 24-dołkowej płytce należy umieścić komórki docelowe jako kontrolę dodatnią, a komórki niespecyficzne jako kontrolę ujemną. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Neurony LepR dodatnie zaczęły tworzyć neuryty po 48 godzinach.

W DIV4 rozszerzenia aksonów wykazały postęp, podczas gdy zaczęły pojawiać się procesy dendrytyczne. W DIV6 neurony były wystarczająco rozwinięte. Badania immunofluorescencyjne wykazały, że nie zaobserwowano komórek glejowych ani innych komórek nieneuronalnych.

Neuronalna natura komórek została potwierdzona przez barwienie białkiem-2 związanym z mikrotubulami. W DIV 10 30% komórek LepR dodatnich ulega ekspresji POMC. Łączność i funkcjonalność synaps zaobserwowano w kulturach ogólnych zawierających heterogeniczne populacje neuronów podwzgórza.