Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro
4 sierpnia 2023
Ten protokół przedstawia kroki do wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do przeprowadzenia wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych u drożdży.
Obecnie dostępne są różne urządzenia, takie jak bioreaktory i oświetlacze płytek mikrostudzienkowych. Bioreaktory oferują dobrą rozdzielczość czasową, ale mają ograniczoną przepustowość. Urządzenia z płytkami mikrodołkowymi oferują wyższą przepustowość, ale brakuje im automatyzacji do niezawodnego rejestrowania wyników w czasie.
Lustro oferuje niezawodną i wysokoprzepustową charakterystykę systemów optogenetycznych w czasie rzeczywistym. Może również współpracować z testami, które mogą być wykonywane przez roboty do obsługi cieczy. Systemy optogenetyczne są atrakcyjnym narzędziem ze względu na precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową, jaką oferują nad zachowaniem komórek.
Możliwość szybszego projektowania, budowania i testowania systemów optogenetycznych utoruje drogę do lepszego zrozumienia i kontroli zachowań biologicznych. Zacznij od skonfigurowania stacji roboczej automatyzacji. Dołącz urządzenie do oświetlania mikropłytek, takie jak optopłytka, która umożliwia wygodny dostęp do ramienia chwytaka robota.
Następnie przetwórz arkusz kalkulacyjny z dostępnym skryptem MATLAB, aby zaprogramować optoplate. Wykonaj program stymulacji światłem, na płytce optycznej. Aby zaprogramować robota, rozwiąż wszelkie potencjalne błędy, aby zapewnić prawidłowe działanie nośnika i definicji LabWare.
Kilkakrotnie przepuść pustą płytkę przez pętlę skryptu, aby sprawdzić, czy ramię chwytaka robota jest w stanie dokładnie podnieść i umieścić płytkę. Następnie wybierz kolonie z płytek, aby ustawić płytkę próbki. Następnie zaszczepić je w trzech mililitrach syntetycznych kompletnych pożywek w szklanych probówkach hodowlanych.
Inkubuj te kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bębnie rolkowym w ciemności. W kuwecie rozcieńczyć 200 mikrolitrów kultury w jednym mililitrze syntetycznego kompletnego podłoża. Zapisać jego gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
Następnie rozcieńczyć każdą kulturę przez noc do gęstości optycznej 0,1 w szklanych probówkach hodowlanych. Rozcieńczone kultury należy odpipetować na płytkę 96-dołkową. Uwzględnij studzienki z ślepą pożywką i niefluorescencyjnymi komórkami jako kontrole ujemne.
Inkubować płytkę z próbką w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Teraz umieść płytkę próbki na wytrząsarce grzałki. Zainicjuj skrypt automatyzacji, klikając uruchom.
Po zarejestrowaniu początkowego pomiaru na czytniku płytek należy uruchomić program stymulacji świetlnej, włączając listwę zasilającą urządzenia oświetleniowego. Wartości fluorescencji w czasie dla szczepu optogenetycznego wykazały, że ogólny poziom fluorescencji był proporcjonalny do cyklu pracy stymulacji świetlnej. Odpowiednie wartości gęstości optycznej były spójne, co sugeruje, że na wzrost nie miały wpływu zmienne warunki oświetleniowe.
Różne szczepy optogenetyczne wykorzystywały różne reakcje na intensywność impulsów świetlnych, okres i zmiany cyklu pracy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje kroki wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych w drożdżach. Lustro zapewnia niezawodną i wydajną charakterystykę w czasie rzeczywistym, współpracując z robotami do obsługi cieczy w celu zwiększenia stopnia automatyzacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Optogenetyka
- Przesiewanie wysokoprzepustowe
- Drożdżowe modele systemowe
Wprowadzenie
- Systemy optogenetyczne pozwalają na precyzyjną kontrolę zachowania komórek.
- Obecnie stosowane urządzenia obejmują bioreaktory oraz iluminatory do płytek z mikrowyciekami.
- Bioreaktory zapewniają wysoką rozdzielczość czasową, lecz ograniczoną przepustowość.
- Urządzenia do płytek z mikrowyciekami oferują wyższą przepustowość, ale nie posiadają funkcji automatyzacji.
Cel badania
- Wykorzystanie systemu Lustro do wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych.
- Udoskonalenie automatyzacji rejestracji wyników w czasie.
- Zwiększenie wydajności analiz przeprowadzanych za pomocą robotów do obsługi cieczy.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie platformy Lustro do charakteryzacji.
- Integracja z robotami do obsługi cieczy w celu automatyzacji analizy.
- Monitorowanie systemów optogenetycznych w czasie rzeczywistym.
- Porównanie z tradycyjnymi metodami z użyciem bioreaktorów i płytek z mikrowyrostkami.
Główne wyniki
- Lustro zapewnia niezawodną charakterystykę systemów optogenetycznych.
- Możliwości wysokoprzepustowego przetwarzania przewyższają tradycyjne metody.
- Rejestracja danych w czasie rzeczywistym zwiększa dokładność eksperymentalną.
- Automatyzacja ogranicza konieczność ręcznej interwencji i zmniejsza liczbę błędów.
Wnioski
- Lustro jest skutecznym narzędziem do wysokoprzepustowych badań optogenetycznych.
- Automatyzacja znacząco usprawnia przebieg eksperymentów.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne systemy biologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa optogenetyka w drożdżach, możliwa dzięki platformie Lustro, eliminuje wąskie gardło iteracyjnych cykli projektowania, budowy i testowania (design-build-test) w biologii syntetycznej i inżynierii obwodów genowych. Poprzez automatyzację stymulacji światłem oraz ilościowych odczytów, Lustro zwiększa pewność prognostyczną i przyspiesza osiąganie punktów zwrotnych we wczesnej fazie odkrywania programowalnych systemów komórkowych. Możliwość ta wspiera ewaluację konstruktów optogenetycznych w całej skali portfela, redukując czas trwania cyklu oraz zapotrzebowanie na zasoby w procesach badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę funkcji obwodów genowych w kontrolowanych warunkach oświetleniowych.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez kwantyfikację dynamiki odpowiedzi optogenetycznej dla wielu konstruktów.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez precyzyjną, programowalną stymulację i pomiar.
- Zwiększa pewność predykcyjną w procesie rozwoju zasobów biologii syntetycznej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Automatyzuje przygotowanie i stymulację szczepów drożdży dla standaryzowanych, powtarzalnych testów.
- Zapewnia wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary fluorescencji i wzrostu w celu przeprowadzenia rzetelnego przesiewu.
- Umożliwia skalowalną ocenę parametrów systemu optogenetycznego, takich jak cykl pracy i intensywność.
- Wspiera niezawodną ocenę związków lub konstruktów w formatach multipleksowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje wydajność systemu optogenetycznego do zachowań komórkowych istotnych dla danej choroby, gdy jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do przedklinicznej walidacji programowalnych systemów ekspresji genów.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie bodźca świetlnego z ilościowymi wynikami fenotypowymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Lustro integruje się z procesem od odkrycia do identyfikacji wiodącego związku poprzez automatyzację charakterystyki systemów optogenetycznych i umożliwienie wyboru konstruktów w oparciu o dane na potrzeby dalszego rozwoju.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez programowalną stymulację światłem oraz pomiary w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne i ilościowe wyniki w celu selekcji konstruktów.
- Analityka: Zapewnia rozdzielone w czasie dane dotyczące fluorescencji i wzrostu, umożliwiając porównanie odpowiedzi optogenetycznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia zachowanie ciągłości dla systemów programowalnych rozwijanych pod kątem modeli przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy platformę automatyzacji wielokrotnego użytku dla iteracyjnych cykli pracy w biologii syntetycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niepewność mechanistyczną w rozwoju systemów optogenetycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje testy optogenetyczne, minimalizując interwencje manualne oraz błędy.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i optymalizuje alokację zasobów w portfelach biologii syntetycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów programowalnych systemów komórkowych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie optogenetyki, programowania automatyzacji oraz projektowania analiz ilościowych.
- Zależy od zintegrowanego instrumentarium: urządzenia oświetlającego, czytnika płytek, wytrząsarki i ramienia robotycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów i formatów danych między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać modyfikacji sprzętowych i protokołów.
- Przepustowość i stopień złożoności analizy są ograniczone konfiguracją platformy i formatem płytek.
