Name: Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 26 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową optogenetykę w drożdżach przy użyciu zautomatyzowanej platformy Lustro. Ta metoda umożliwia niezawodną, czasową charakteryzację systemów optycznych z automatyzacją pomiarów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R35GM128873 grantów National Institutes of Health oraz granty National Science Foundation 2045493 (przyznane M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. otrzymała nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund. Projekt Z.P.H. otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego NHGRI dla Programu Szkoleniowego Nauk Genomicznych 5T32HG002760. Doceniamy owocne dyskusje z członkami laboratorium McClean, a w szczególności jesteśmy wdzięczni Kieranowi Sweeneyowi za udzielenie komentarzy do manuskryptu.

Szczepy drożdży użyte w tym badaniu są udokumentowane w Tabeli Materiałów. Szczepy te wykazują silny wzrost w zakresie temperatur od 22 °C do 30 °C i mogą być uprawiane w różnych standardowych pożywkach drożdżowych.
1. Konfiguracja stacji roboczej automatyzacji
<ol>
	<li>Wyposaż zautomatyzowaną stację roboczą w zrobotyzowane ramię chwytakowe (RGA, patrz tabela materiałów) zdolne do przesuwania płytek mikrodołkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zainstaluj wytrząsarkę do mikropłytek (patrz tabela materiałów) w zautomatyzowanej stacji roboczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1(1)) z automatycznym mechanizmem blokującym płytkę, który zapewnia dostęp RGA.</li>
	<li>Umieść czytnik mikropłytek w pobliżu zautomatyzowanej stacji roboczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1(2)), zapewniając dostępność RGA.</li>
	<li>Dołącz urządzenie do oświetlania mikropłytek (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1(3)), które umożliwia wygodny dostęp do RGA. Przykładami są optoPlate8 (użyty w tym badaniu) lub LITOS9 (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia oświetleniowego
<ol>
	<li>Zbuduj i skalibruj optoPlate (lub alternatywne urządzenie oświetleniowe) zgodnie z ustalonymi metodami8,10,11.</li>
	<li>Użyj adaptera na urządzeniu oświetleniowym, aby umożliwić dostęp do RGA.</li>
	<li>Zaprogramuj optoPlate za pomocą arkusza kalkulacyjnego input10 lub interfejsu graficznego12. Wykonaj krok 3, aby uruchomić programy stymulacji światłem.</li>
</ol>
3. Projektowanie programu stymulacji światłem
<ol>
	<li>Określ pożądane warunki oświetleniowe dla eksperymentu.</li>
	<li>Wprowadź żądane warunki oświetleniowe, w tym natężenie światła, czas rozpoczęcia światła, długość impulsu, numer impulsu i czas trwania impulsu, w arkuszu kalkulacyjnym. 
	UWAGA: Wprowadź te informacje do optoPlate, korzystając z instrukcji podanych w repozytorium GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Należy pamiętać, że płytka próbki nie będzie świecić, gdy znajduje się w czytniku mikropłytek lub na wytrząsarce grzałki. Czas trwania i częstotliwość tych zdarzeń może wymagać optymalizacji w oparciu o określone wymagania eksperymentalne.</li>
	<li>Uwzględnij ciemne warunki dla każdej odmiany, aby umożliwić prawidłowe pomiary tła.</li>
	<li>Do wstępnych eksperymentów charakteryzacyjnych w celu oceny funkcjonalności transformantu należy użyć światła o wysokim natężeniu. 
	UWAGA: Natężenie światła powinno być zoptymalizowane dla bardziej czułych eksperymentów, ponieważ nadmierne światło może być fototoksyczne dla drożdży13.</li>
</ol>
4. Przygotowanie czytnika mikropłytek
<ol>
	<li>Skonfiguruj czytnik mikropłytek tak, aby mierzył żądaną ilość zainteresowania przed przeprowadzeniem eksperymentów. 
	UWAGA: W tym przykładzie czytnik mikropłytek został skonfigurowany do pomiaru fluorescencji z reportera wyrażonej przez odkształcenie będące przedmiotem zainteresowania. Inne wyjścia, takie jak luminescencja lub gęstość optyczna, mogą być stosowane w zależności od wymagań eksperymentalnych.</li>
	<li>Hoduj interesujący nas szczep (wraz z kontrolą niefluorescencyjną) w syntetycznym kompletnym (SC) pożywce14 (lub innym podłożu o niskiej fluorescencji) (patrz Tabela materiałów) do najwyższej gęstości komórek, jaką można zmierzyć. Przenieś kultury na płytkę mikrodołkową o czarnych ściankach ze szklanym dnem (patrz Tabela materiałów) i zmierz je w celu określenia optymalnych ustawień czytnika mikropłytek. 
	UWAGA: Zapewnij dokładne odczyty, prawidłowo wprowadzając wymiary płyty i mierząc płytkę od dołu.</li>
	<li>Zapoznaj się z bazą danych białek fluorescencyjnych (na przykład fpbase.org), aby uzyskać przybliżone widma absorpcji i emisji dla docelowego białka fluorescencyjnego15.</li>
	<li>Określ wartość Z (odległość między płytką a czytnikiem), wykonując skanowanie z na studzienkach zawierających szczepy fluorescencyjne i niefluorescencyjne. Wybierz wartość z, która daje najwyższy stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Zoptymalizuj widma absorpcyjne i emisyjne, przeprowadzając skany absorpcyjne i emisyjne na szczepach fluorescencyjnych i niefluorescencyjnych w celu określenia optymalnego stosunku sygnału do szumu.</li>
	<li>Zmierz odkształcenie fluorescencyjne z wzmocnieniem ustawionym na optymalnym poziomie, określając najwyższe wzmocnienie optyczne, które można zastosować bez powodowania błędu pomiaru przepełnienia. 
	UWAGA: To wzmocnienie optyczne powinno być ustawiane ręcznie konsekwentnie we wszystkich eksperymentach obejmujących ten sam szczep, aby zapewnić spójność wyników.</li>
	<li>Przygotuj skrypt pomiarowy (patrz Rysunek 2) w oprogramowaniu czytnika mikropłytek. Ten skrypt konfiguruje przyrząd do pomiaru gęstości optycznej kultur i widm fluorescencyjnych wszelkich białek fluorescencyjnych, które mają być mierzone. 
	UWAGA: Zmierz gęstość optyczną szczepów przy 600 nm, chyba że wykazują ekspresję czerwonych białek fluorescencyjnych. W przypadku szczepów wykazujących ekspresję białek czerwonej fluorescencji należy zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 700 nm, aby uniknąć odchylenia16.</li>
	<li>Ustaw skrypt pomiarowy tak, aby utrzymać wewnętrzną temperaturę inkubacji wynoszącą 30 °C podczas pomiarów.</li>
	<li>Skonfiguruj skrypt pomiarowy, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego lub plików ASCII, zgodnie z preferencjami.</li>
</ol>
5. Programowanie robota
<ol>
	<li>Skonfiguruj definicję stołu roboczego w oprogramowaniu zautomatyzowanej stacji roboczej w oparciu o fizyczny układ nośników (np. otrząsarki grzałek, platformy gniazdowe, urządzenia oświetleniowe) i sprzętu laboratoryjnego (np. płytki 96-dołkowej) (patrz tabela materiałów). Utwórz skrypt w oprogramowaniu stacji roboczej automatyzacji, aby wykonać indukcję światła i pomiary (Rysunek 3), postępując zgodnie z poniższymi krokami.</li>
	<li>Wyłącz wszystkie wewnętrzne źródła oświetlenia, aby zapobiec aktywacji systemów optogenetycznych w tle.</li>
	<li>Ustaw wytrząsarkę grzałki tak, aby utrzymywała temperaturę 30 °C. Gdy płyta nie znajduje się na wytrząsarce grzałki, będzie ona miała temperaturę otoczenia (22 °C).</li>
	<li>Wykorzystaj pętle, timer i zmienną zliczającą pętle, aby powtórzyć kroki indukcji i pomiaru komórek w regularnych odstępach czasu.</li>
	<li>Przed zapisaniem pomiarów należy wstrząsnąć płytką próbki, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie wszystkich komórek. 60-sekundowe wstrząsy przy 1,000 obr./min z orbitalem 2 mm są na ogół wystarczające do ponownego zawieszenia komórek S288C S. cerevisiae i uniknięcia błędu pomiarowego.</li>
	<li>Przenieś płytkę próbki do czytnika mikropłytek za pomocą ramienia robota i zdejmij pokrywę (jeśli dotyczy), aby zapobiec odchyleniom w pomiarze gęstości optycznej. Oprogramowanie sterujące automatycznie zdejmie i założy pokrywę do wyznaczonej pozycji, jeśli definicja nośnika czytnika mikropłytek jest ustawiona tak, aby nie zezwalała na pokrywy.</li>
	<li>Wykonaj skrypt pomiarowy czytnika mikropłytek zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Załóż pokrywę na płytkę próbki i przesuń płytkę do urządzenia oświetleniowego za pomocą ramienia robota.</li>
	<li>Ustaw skrypt tak, aby czekał, aż czasomierz osiągnie określony przedział czasu (np. 30 minut pomnożone przez zmienną zliczającą pętlę), a następnie powtórz całą pętlę dla żądanej liczby iteracji (np. 48 razy dla eksperymentu 24-godzinnego).</li>
	<li>Rozwiązywanie problemów z potencjalnymi błędami i zapewnienie prawidłowego działania definicji nośnika i sprzętu laboratoryjnego, a także zdolności RGA do dokładnego podnoszenia i umieszczania płytki poprzez wielokrotne przepuszczanie pustej płytki przez pętlę skryptu.</li>
	<li>Skonfiguruj alerty użytkownika, aby powiadamiać użytkownika o wszelkich zmianach stanu urządzenia lub błędach, które mogą wystąpić podczas wykonywania protokołu.</li>
</ol>
6. Ustawianie płytki próbkowania
<ol>
	<li>Hoduj szczepy drożdży na płytkach z bogatymi mediami, takimi jak YPD agar17 (patrz Tabela materiałów). Uwzględnij kontrolę niefluorescencyjną (negatywną).</li>
	<li>Wybierz kolonie z płytek i zaszczep je w 3 ml pożywki SC 14 (lub innej pożywki o niskiej fluorescencji, takiej jak LFM18) w szklanych probówkach hodowlanych. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym, trzymając je w ciemności lub w warunkach braku reakcji na światło (np. światło czerwone w przypadku systemów reagujących na światło niebieskie).</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną kultur nocnych, rozcieńczając 200 μl każdej kultury w 1 ml pożywki SC i rejestrując gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru lub czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą nocną kulturę do OD600 0,1 w szklanych probówkach hodowlanych. W celu przeprowadzenia testów odkształceń o wyższej przepustowości należy wykonać automatyczne rozcieńczenia w płytkach mikrodołkowych.</li>
	<li>Odpipetować rozcieńczone kultury do płytki 96-dołkowej. Należy uwzględnić trzy studzienki dla każdego warunku (tj. trzy identyczne studzienki o tym samym naprężeniu i warunkach światła), aby uwzględnić różnice techniczne. Uwzględnij studzienki z ślepymi pożywkami i komórkami niefluorescencyjnymi jako kontrole ujemne do pomiaru fluorescencji tła i gęstości optycznej.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C, wytrząsając przez 5 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu z indukcją światła. W razie potrzeby dostosuj ilości rozcieńczenia i czasy inkubacji, aby zoptymalizować je pod kątem określonych szczepów i warunków eksperymentalnych.</li>
</ol>
7. Przeprowadzanie eksperymentu
<ol>
	<li>Umieść sample płytki na wytrząsarce grzałki i zainicjuj skrypt automatyzacji, jak opisano w kroku 5.</li>
	<li>Rozpocznij program stymulacji światłem zgodnie z opisem w kroku 3 po zarejestrowaniu początkowego pomiaru na czytniku płytek.</li>
	<li>Jeśli stanowisko pracy automatyki nie znajduje się w ciemnym pomieszczeniu, zakryj je zasłoną zaciemniającą, aby uniknąć oświetlenia tła.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Utwórz mapę arkusza kalkulacyjnego na potrzeby eksperymentu, odzwierciedlającą układ 8 x 12 płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że mapa zawiera nazwy odkształceń mierzonych w jednej siatce oraz opisy warunków oświetleniowych używanych w innej siatce.</li>
	<li>Wykorzystaj skrypt Pythona lub inny preferowany język programowania do analizy wyeksportowanych danych. Zaimportuj arkusz kalkulacyjny mapy do tablicy, kojarząc nazwy szczepów i nazwy warunków z każdym dołkiem płyty. 
	UWAGA: Przykładowy kod do analizy można znaleźć pod adresem: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternatywnie można użyć aplikacji do analizowania danych z różnych czytników tabliczek19.</li>
	<li>Wczytaj dane z wyeksportowanego arkusza kalkulacyjnego eksperymentu do innej tablicy.</li>
	<li>Wygeneruj wykresy wartości gęstości optycznej i wartości fluorescencji dla każdego szczepu i stanu w czasie, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 4.</li>
	<li>Zbadaj wykresy gęstości optycznej, aby określić etapy wykładniczego wzrostu lub nasycenia kultur. Informacje te pomogą w wyborze odpowiednich punktów czasowych do porównania pomiarów fluorescencji między szczepami lub warunkami, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 5.</li>
</ol>

Yeast Optogenetic Response Analysis Using the Lustro Automation Technique

<ol><li>Pérez, A. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+strategies+for+the+control+of+gene+expression+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts.</a> Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).</li>
<li>Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+for+transcriptional+programming+and+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering.</a> Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).</li>
<li>Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+in+vitro+and+in+vivo+Activities+of+Light+Inducible+Dimers%3A+a+Cellular+Optogenetics+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).</li>
<li>Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+signal+generators%3A+integrating+synthetic+biology+tools+and+in+silico+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control.</a> Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).</li>
<li>Harmer, Z. P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lustro%3A+High-throughput+optogenetic+experiments+enabled+by+automation+and+a+yeast+optogenetic+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit.</a> ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).</li>
<li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mScarlet%3A+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li>
<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LITOS%3A+a+versatile+LED+illumination+tool+for+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation.</a> Scientific Reports. 12 (1), 13139(2022).</li>
<li>Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li>
<li>Dunlop, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlop%2C+MJ+%22A+supplemental+guide+to+building+the+optoPlate-96%22">A supplemental guide to building the optoPlate-96</a>. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).</li>
<li>Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+graphical+user+interface+to+design+high-throughput+optogenetic+experiments+with+the+optoPlate-96%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96.</a> Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).</li>
<li>Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+alters+yeast+metabolic+rhythms+by+inhibiting+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).</li>
<li>Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+wavelengths+collide%3A+bias+in+cell+abundance+measurements+due+to+expressed+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).</li>
<li>YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Low-Fluorescence+Yeast+Nitrogen+Base+without+Riboflavin+and+Folic+Acid+Medium+%28LFM%29%22">Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM)</a>. 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).</li>
<li>Csibra, E., Stan, G. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parsley%3A+a+web+app+for+parsing+data+from+plate+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Parsley: a web app for parsing data from plate readers.</a> Zenodo. , (2023).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35363(2016).</li>
<li>Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cybergenetic+control+of+bacterial+co-culture+composition+via+optogenetic+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback.</a> Nature Communications. 13, 4808(2022).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7, 12546(2016).</li>
<li>Bertaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+bioreactor+arrays+for+automated+measurements+and+reactive+control+with+ReacSight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight.</a> Nature Communications. 13 (1), 3363(2022).</li>
<li>Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+closed-loop+feedback+control+of+the+unfolded+protein+response+optimizes+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production.</a> Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+feedback-enabled+optogenetic+stimulation+and+spectroscopy+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+beta-carotene+bioproduction+in+yeast+across+multiple+lab-scales%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268(2023).</li>
<li>Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction%3A+dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół Lustro automatyzuje procesy hodowli, oświetlenia i pomiaru, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe i charakteryzację systemów optogenetycznych6. Osiąga się to poprzez zintegrowanie urządzenia oświetleniowego, czytnika mikropłytek i urządzenia wytrząsającego ze stacją roboczą automatyzacji. Protokół ten w szczególności demonstruje przydatność Lustro do badań przesiewowych różnych konstruktów optogenetycznych zintegrowanych z drożdżami S. cerevisiae ...

Optogenetyka to potężna technika, która wykorzystuje białka wrażliwe na światło do kontrolowania zachowania komórek z dużą precyzją1,2,3. Jednak prototypowanie konstruktów optogenetycznych i określanie optymalnych warunków oświetlenia może być czasochłonne, co utrudnia optymalizację systemów optogenetycznych4,5. Wysokoprzepustowe metody szybkiego badania przesiewowego i charakteryzowania aktywności systemów optogenetycznych mogą przyspieszyć cykl projektowania-budowa-testowanie prototypów konstruktów i badania ich funkcji.
Platforma Lustro została opracowana jako technika automatyzacji laboratorium przeznaczona do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i charakteryzacji systemów optogenetycznych. Integruje czytnik mikropłytek, urządzenie oświetleniowe i urządzenie wytrząsające ze stacją roboczą automatyzacji6. Lustro łączy zautomatyzowaną hodowlę i stymulację świetlną komórek na płytkach mikrodołkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i Rysunek Uzupełniający 1), umożliwiając szybkie badania przesiewowe i porównanie różnych systemów optogenetycznych. Platforma Lustro jest wysoce elastyczna i można ją uogólnić do pracy z innymi robotami automatyki laboratoryjnej, urządzeniami oświetleniowymi, czytnikami płytek, typami komórek i systemami optogenetycznymi, w tym reagującymi na różne długości fal światła.
Ten protokół demonstruje konfigurację i użycie Lustro do charakteryzowania systemu optogenetycznego. Optogenetyczna kontrola rozszczepionych czynników transkrypcyjnych u drożdży jest używana jako przykładowy system do zilustrowania funkcji i użyteczności platformy poprzez badanie związku między sygnałami świetlnymi a ekspresją fluorescencyjnego genu reporterowego, mScarlet-I7. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą usprawnić optymalizację systemów optogenetycznych i przyspieszyć odkrywanie nowych strategii dynamicznej kontroli systemów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa szklana płyta dolna z&nbsp; #1,5 szklaną pokrywą</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>BioShake 3000-T elm (wytrząsarka grzałki)</td><td>QINSTRUMENTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza Fluent Automation</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LITOS (alternatywne urządzenie oświetleniowe)</td><td>Hohener, et al. Scientific Reports. 2022</td><td></td><td></td></tr><tr><td>optoPlate-96 (urządzenie oświetleniowe)</td><td>Bugaj i in. Protokoły natury. 2019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zrobotyzowane ramię chwytaka</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spark (czytnik płytek)</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Complete Media</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1250</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Connect (aplikacja ostrzegająca użytkownika)</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yMM1734 (BY4741 Mat&alpha; ura3&Delta; 0::5' Homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homologia Ura 3'&nbsp; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td><td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yMM1763 (BY4741 Mat&alpha; ura3&Delta; 0::5' homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologia&nbsp; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td><td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yMM1765 (BY4741 Mat&alpha; ura3&Delta; 0::5' homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homologia Ura 3'&nbsp; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td><td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td><td></td><td></td></tr><tr><td>YPD Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1500</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy lustro

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetyka oferuje precyzyjną kontrolę nad zachowaniem komórek, wykorzystując genetycznie kodowane białka wrażliwe na światło. Jednak optymalizacja tych systemów w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności często wymaga wielu cykli projektowania, budowy i testów, co może być czasochłonne i pracochłonne. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy Lustro, platformę, która łączy stymulację światłem z automatyzacją laboratorium, umożliwiając wydajne, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i charakteryzację systemów optogenetycznych.
Lustro wykorzystuje stację roboczą automatyki wyposażoną w urządzenie oświetleniowe, urządzenie do wytrząsania i czytnik płytek. Wykorzystując ramię robota, Lustro automatyzuje ruch płytki mikrodołkowej między tymi urządzeniami, umożliwiając stymulację szczepów optogenetycznych i pomiar ich odpowiedzi. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący stosowania Lustro do charakteryzowania systemów optogenetycznych do kontroli ekspresji genów w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokół obejmuje konfigurację komponentów Lustro, w tym integrację urządzenia oświetleniowego ze stacją roboczą automatyki. Zawiera również szczegółowe instrukcje dotyczące programowania urządzenia oświetleniowego, czytnika płytek i robota, zapewniając płynną pracę i gromadzenie danych w całym procesie eksperymentalnym.

Rysunek 4A przedstawia wartości fluorescencji w czasie dla szczepu optogenetycznego wykazującego ekspresję fluorescencyjnego reportera kontrolowanego przez indukowany światłem rozdzielony czynnik transkrypcyjny. Różne warunki oświetlenia zastosowane w doświadczeniu są odzwierciedlone przez zmiany cyklu pracy, który reprezentuje procent czasu, w którym światło jest włączone. Zaobserwowano, że całkowity poziom fluorescencji jest proporcjonalny do cyklu pracy stymulacji świetlnej. <strong class...

Ten protokół przedstawia kroki do wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do przeprowadzenia wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych u drożdży.

Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

Obecnie dostępne są różne urządzenia, takie jak bioreaktory i oświetlacze płytek mikrostudzienkowych. Bioreaktory oferują dobrą rozdzielczość czasową, ale mają ograniczoną przepustowość. Urządzenia z płytkami mikrodołkowymi oferują wyższą przepustowość, ale brakuje im automatyzacji do niezawodnego rejestrowania wyników w czasie.Lustro oferuje niezawodną i wysokoprzepustową charakterystykę systemów optogenetycznych w czasie rzeczywistym. Może również współpracować z testami, które mogą być wykonywane przez roboty do obsługi cieczy. Systemy optogenetyczne są atrakcyjnym narzędziem ze względu na precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową, jaką oferują nad zachowaniem komórek.Możliwość szybszego projektowania, budowania i testowania systemów optogenetycznych utoruje drogę do lepszego zrozumienia i kontroli zachowań biologicznych. Zacznij od skonfigurowania stacji roboczej automatyzacji. Dołącz urządzenie do oświetlania mikropłytek, takie jak optopłytka, która umożliwia wygodny dostęp do ramienia chwytaka robota.Następnie przetwórz arkusz kalkulacyjny z dostępnym skryptem MATLAB, aby zaprogramować optoplate. Wykonaj program stymulacji światłem, na płytce optycznej. Aby zaprogramować robota, rozwiąż wszelkie potencjalne błędy, aby zapewnić prawidłowe działanie nośnika i definicji LabWare.Kilkakrotnie przepuść pustą płytkę przez pętlę skryptu, aby sprawdzić, czy ramię chwytaka robota jest w stanie dokładnie podnieść i umieścić płytkę. Następnie wybierz kolonie z płytek, aby ustawić płytkę próbki. Następnie zaszczepić je w trzech mililitrach syntetycznych kompletnych pożywek w szklanych probówkach hodowlanych.Inkubuj te kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bębnie rolkowym w ciemności. W kuwecie rozcieńczyć 200 mikrolitrów kultury w jednym mililitrze syntetycznego kompletnego podłoża. Zapisać jego gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.Następnie rozcieńczyć każdą kulturę przez noc do gęstości optycznej 0,1 w szklanych probówkach hodowlanych. Rozcieńczone kultury należy odpipetować na płytkę 96-dołkową. Uwzględnij studzienki z ślepą pożywką i niefluorescencyjnymi komórkami jako kontrole ujemne.Inkubować płytkę z próbką w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Teraz umieść płytkę próbki na wytrząsarce grzałki. Zainicjuj skrypt automatyzacji, klikając uruchom.Po zarejestrowaniu początkowego pomiaru na czytniku płytek należy uruchomić program stymulacji świetlnej, włączając listwę zasilającą urządzenia oświetleniowego. Wartości fluorescencji w czasie dla szczepu optogenetycznego wykazały, że ogólny poziom fluorescencji był proporcjonalny do cyklu pracy stymulacji świetlnej. Odpowiednie wartości gęstości optycznej były spójne, co sugeruje, że na wzrost nie miały wpływu zmienne warunki oświetleniowe.Różne szczepy optogenetyczne wykorzystywały różne reakcje na intensywność impulsów świetlnych, okres i zmiany cyklu pracy.

high-throughput-optogenetics-experiments-yeast-using-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj wysokoprzepustową optogenetykę w drożdżach przy użyciu zautomatyzowanej platformy Lustro. Ta metoda umożliwia niezawodną, czasową charakteryzację systemów optycznych z automatyzacją pomiarów.

Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro

Przeglądaj więcej filmów