Name: Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:25:00.000+00:00
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w siatkówkach szczurów poddanych stymulacji elektrycznej. Technika ta umożliwia badanie aktywności neuronów siatkówki z rozdzielczością komórkową, wspierając rozwój zaawansowanych protez wzrokowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandrze Ortonobés Larze i Alinie Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) za ich wsparcie techniczne, Annie Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) z grupy badawczej Ophthalmology Research za wsparcie przy iniekcjach doszklistkowych i obrazowaniu siatkówki in vivo.
Podmioty finansujące, które wsparły tę pracę to: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Program Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa dla centrów doskonałości w dziedzinie badań i rozwoju (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya w ramach programu CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr 871124); Fundacja La Caixa (LCF/HR19/52160003); oraz Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardowymi wytycznymi etycznymi dla zwierząt (Dyrektywa Wspólnot Europejskich 86/609/UE) i zatwierdzone przez lokalne komisje etyczne ds. zwierząt. Do niniejszego badania wykorzystano 8-tygodniowe szczury rasy Long Evans. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie nośników i montaż płaski
<ol>
	<li>Podłoże Amesa (1 L)
	<ol>
		<li>W szklanej butelce o pojemności 1 l wymieszaj proszek Ames' Medium, 1,9 g/l NaHCO3, 10 ml penicyliny/streptomycyny 100x i 1 l wody dejonizowanej (patrz tabela materiałów). Dostosuj pH do 7,4, a osmolarność do 280 mOsm za pomocą wody dejonizowanej lub NaHCO3. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr o wielkości porów 0,2 μm pod kapturem. 
		UWAGA: Wysterylizowane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie pozostaje stabilne i może być używane przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Membrany montażowe
	<ol>
		<li>Przymocuj jedną porowatą membranę PTFE (patrz Tabela materiałów) do podkładki za pomocą małych kropli kleju. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 15 minut.</li>
		<li>Aby uzyskać przezierność, zanurz membrany w 70% etanolu na 1 minutę.</li>
		<li>Przepłucz membrany dwukrotnie wodą dejonizowaną, aby całkowicie usunąć etanol. Przechowuj je w wodzie dejonizowanej, aby zapobiec zmętnieniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oznakowanie GCL i płaski montaż siatkówki szczura
UWAGA: Ta metoda etykietowania nie odróżnia RGC od przemieszczonych komórek amakrynowych. Jeśli pożądane jest selektywne znakowanie RGC, rozważ użycie AAV z promotorami specyficznymi dla RGC11 i/lub wstecznym znakowaniem przez nerw wzrokowy12. Aby rozróżnić klasy RGC ON- i OFF-center, sklasyfikuj RGC na podstawie ich reakcji na światło13,14 i wykorzystaj nowsze wersje genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, które oferują zwiększoną czułość i możliwość pomiaru potencjałów pojedynczej czynności15.
<ol>
	<li>Iniekcja doszklistkowa
	<ol>
		<li>Znieczulić 8-tygodniowego szczura rasy Long Evans 2% izofluranem/1%O2 do momentu, aż nie wystąpi odruch pedałowania, i utrzymać znieczulenie za pomocą maski nosowej dla szczurów (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Podczas znieczulenia ułóż zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
		<li>Podać jedną kroplę dostępnych w handlu kropli do oczu (patrz Tabela Materiałów) w celu rozszerzenia źrenicy.</li>
		<li>Przed przystąpieniem do operacji należy zbadać oko pod kątem nieprawidłowości za pomocą dna oka i optycznej koherentnej tomografii (OCT) z systemem obrazowania siatkówki in vivo. Nałóż jedną kroplę Methocel 2%, aby ułatwić kontakt rogówki z obiektywem (patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: Jeśli zostaną wykryte jakiekolwiek nieprawidłowości, nie wykonuj kolejnych kroków dla tego oka.</li>
		<li>Zastosuj jedną kroplę Prescaine jako środek znieczulający miejscowo. Przymocuj powiekę i spojówkę rąbkową za pomocą dostępnego w handlu włókna do szwów (patrz Tabela materiałów). Wykonać sklerotomię 1 mm 4 mm od rąbka za pomocą igły 30 G.
		<ol>
			<li>Przymocować igłę o sile 36 G do precyzyjnej strzykawki i wstrzyknąć cząstki AAV niosące genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia do ciała szklistego przez 30 sekund, pod kątem 45°. W tym badaniu użyliśmy AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml w HBSS) (patrz tabela materiałów). 
			UWAGA: Konstrukty AAV, które nie kodują potencjalnie rakotwórczych produktów genowych lub cząsteczek toksyn i są wytwarzane bez wirusa pomocniczego, mogą być przetwarzane w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1). W przeciwnym razie, jeśli zostanie uznany za materiał niebezpieczny biologicznie w ramach BSL-2, należy podjąć odpowiednie środki ostrożności16. Kodowanie AAV dla GCaMP jest uważane za BSL-1 i nie wymaga manipulacji w szafach bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stosować jedną kroplę leku Tobradex (patrz Tabela Materiałów) w celu zapobiegania stanom zapalnym i jako profilaktyka antybiotykowa.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórz kroki 2, 3 i 4 z drugim okiem. 
		UWAGA: Sprawdź zwierzęta 12-24 godziny po zabiegu, aby upewnić się, że nie ma żadnych działań niepożądanych.</li>
		<li>Trzy dni po wstrzyknięciu należy zbadać strukturę siatkówki za pomocą dna oka i OCT za pomocą systemu obrazowania siatkówki in vivo (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dwa tygodnie po wstrzyknięciu GCL powinien wydzielać fluorescencję. Ocena struktury siatkówki i ekspresji AAV za pomocą fluorescencyjnej dna oka przy użyciu systemu obrazowania siatkówki in vivo. 
		UWAGA: Według Weitz et al.12, fluorescencja z AAV2-CAG-GCaMP5G staje się zauważalna po 1 tygodniu od wstrzyknięcia i nasila się po 2 tygodniach. Począwszy od czwartego tygodnia, nadekspresja GCaMP indukuje cytochorobowość. Umierające komórki wykazują wysoki wyjściowy sygnał fluorescencyjny w jądrze i cytoplazmie, który nie ulega wahaniom w odpowiedzi na stymulację. W zdrowych komórkach ekspresja GCaMP jest ograniczona do cytoplazmy i wykluczona z jądra7,8,12,17,18. Cechy te można zaobserwować ex vivo podczas obrazowania mikroskopowego. Okno ekspresji genów może się różnić w zależności od wektora wirusowego i wybranego promotora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycięcie siatkówki i montaż płaski 
	UWAGA: Dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu, szczury, którym wstrzyknięto dożytkowo, są poddawane eutanazji bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu elektrofizjologicznego, zgodnie ze standardowymi wytycznymi etycznymi (dyrektywa Wspólnot Europejskich 86/609/UE) i zatwierdzone przez lokalne komisje etyczne. Wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ) jest stosowane jako metoda eutanazji w tym protokole.
	<ol>
		<li>Wyłuszczenie oka
		<ol>
			<li>Delikatnie dociśnij zewnętrzną stronę oczodołu za pomocą pary zakrzywionych kleszczy, aby lekko wystawać oko z oczodołu.</li>
			<li>Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć mięśnie trzymające oko i wyłuszczyć je, uważając, aby nie przebić gałki ocznej. 
			UWAGA: Zaczynając od tego kroku, przeprowadź sekcję siatkówki pod mikroskopem stereoskopowym w natlenionym (95% O2 / 5% CO2) pożywce Amesa.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wycięcie siatkówki
		<ol>
			<li>Użyj pary małych zakrzywionych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych, aby usunąć całą otaczającą tkankę z gałki ocznej.</li>
			<li>Weź kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach około 3 cm x 3 cm i umieść go na pokrywce naczynia o średnicy 3,5 cm. Namocz papier pożywką Amesa.</li>
			<li>Umieść gałkę oczną na papierze, tak aby przedni segment był skierowany w stronę operatora. Użyj pary prostych kleszczy, aby przytrzymać gałkę oczną, umieszczając je na górze ora serrata pod kątem około 45° od powierzchni naczynia. Wykonaj małe cięcie ostrzem, wykorzystując przestrzeń między prostymi kleszczami jako odniesienie.</li>
			<li>Zwróć uwagę na gałkę oczną do Medium Amesa. Użyj prostych kleszczy i cienkich nożyczek sprężynowych, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.</li>
			<li>Ostrożnie zdejmij soczewkę za pomocą dwóch par prostych kleszczy. Następnie oddziel siatkówkę od twardówki.</li>
			<li>Przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej.</li>
			<li>Użyj stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zidentyfikować obszar siatkówki o najlepszym wskaźniku wapnia. 
			UWAGA: Zakres rozprzestrzeniania się wirusa zależy od powodzenia wstrzyknięcia do ciała szklistego. Osiągnięcie fluorescencji w dużych częściach siatkówki może wymagać praktyki. Doświadczenie badacza odgrywa kluczową rolę w uzyskiwaniu optymalnych wyników.</li>
			<li>Za pomocą plastikowej pipety z odciętą końcówką przenieś wybrany fragment siatkówki na membranę montażową (etapy montażu membran). Użyj pary prostych kleszczy, aby płasko zamontować siatkówkę z GCL skierowanym do góry.</li>
			<li>Za pomocą plastikowej pipety przymocowanej do końcówki pipety o pojemności 100 μl usuń pożywkę, aby umożliwić przyleganie elementu siatkówki do porowatej membrany. Odwróć zespół na MEA tak, aby GCL spoczywał na elektrodach.</li>
			<li>Wypełnić kąpiel próbki natlenionym roztworem Amesa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie wapnia ex vivo po stymulacji elektrycznej
UWAGA: W tej pracy użyto MEA dowodu koncepcji do eksperymentów ex vivo. Niestandardowe MEA zostały wytworzone z porowatych elektrod na bazie grafenu o średnicy 25 μm na szkle borokrzemianowym o grubości 500 μm ze śladami Ti/Au, a następnie zaizolowane azotkiem krzemu i fotorezystem SU-8 klasa <sup="xref">12. Jednak metody obrazowania wapnia są ważne niezależnie od materiału elektrody użytego do stymulacji.
<ol>
	<li>Ustawić system perfuzyjny w taki sposób, aby natlenione podłoże Amesa stale ukrwiało kąpiel próbki w temperaturze 33 °C przy stałym natężeniu przepływu 5 ml/min.</li>
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w lampę fluorescencyjną, kostkę filtra FITC i kamerę CMOS, sprawdź siatkówkę pod kątem obszaru, w którym widoczne są elektrody stymulujące i fluorescencja z komórek wykazujących ekspresję GCaMP. W tym badaniu użyto obiektywu powietrznego 20x NA 0,75. 
	UWAGA: Aby skutecznie stymulować (i rejestrować) komórki za pomocą elektrod, siatkówka i elektroda muszą być w bliskim kontakcie. W ten sposób ogniwa znajdują się w widocznej tej samej płaszczyźnie ogniskowej co elektrody. Jeśli tak nie jest, powtórz etapy wycinania siatkówki od kroku 8. W przypadku korzystania z siatkówki ze zdrowych modeli zwierzęcych (z działającymi fotoreceptorami) należy pamiętać, że za każdym razem, gdy lampa fluorescencyjna jest włączana, światło generuje pewne wywołane reakcje, ponieważ siatkówka jest wrażliwa na światło o długości fali używanej do wzbudzania czujnika GCaMP. Te wywołane światłem zmiany wapnia można wykorzystać do oceny stanu zdrowia tkanki. Aby uniknąć mieszania światła z reakcjami wywołanymi elektrycznie, włącz świetlówkę co najmniej 1 minutę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.</li>
	<li>Aby wywołać reakcje wywołane elektrycznie w GCL, wybierz elektrodę do wysyłania impulsów sterowanych prądem. Ustaw parametry stymulacji elektrycznej w oprogramowaniu generatora impulsów, takie jak: kształt, amplituda, czas trwania, opóźnienie fazowe i częstotliwość impulsów, które mają być zastosowane. 
	UWAGA: Efektywne parametry bodźca mogą się znacznie różnić od szerokości impulsu od 50 μs do 100 ms, przy amplitudach w zakresie od 0,1 μA do 10 μA. Parametry te, wraz z częstotliwością bodźca, polaryzacją bodźca, liczbą impulsów i opóźnieniami międzyfazowymi, mogą wpływać na odpowiedź czasoprzestrzenną obserwowaną przez obrazowanie wapniowe19,20,21,22. Ciąg 40 dwufazowych impulsów dostarczających stymulację 1 ms, 2 μA często generuje widoczną odpowiedź w znakowanych neuronach.</li>
	<li>Aby zsynchronizować akwizycję obrazu z dostarczaniem stymulacji, użyj generatora impulsów jako zewnętrznego wyzwalacza do sterowania początkiem akwizycji obrazu. Połącz kamerę (patrz tabela materiałów) z generatorem impulsów za pomocą wyjściowego sygnału wyzwalającego i ustaw "Tryb przechwytywania" w oprogramowaniu kamery na "Zewnętrzny wyzwalacz startowy". Naciśnij przycisk Start w oprogramowaniu aparatu, aby poczekał na uruchomienie zewnętrznego wyzwalacza. Rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą oprogramowania generatora impulsów. 
	UWAGA: Sterowanie zewnętrznym spustem może być skonfigurowane w różny sposób dla różnych kamer. To badanie zazwyczaj rejestrowało obrazy (512 x 512 pikseli, 16-bitowa skala szarości) z prędkością 10 klatek na sekundę przez 1 minutę, zapewniając jednocześnie impulsy dwufazowych ciągów impulsów co 10 s. Dostarczanie impulsu rozpoczyna się po 10 sekundach, więc pierwsze klatki we wszystkich eksperymentach odpowiadają spontanicznej aktywności. W zależności od czujnika GCaMP i analizy, którą zostanie przeprowadzona, może być konieczne dostosowanie szybkości zapisu zgodnie z czasami narastania i zaniku wskaźnika wapnia8. Weź pod uwagę czułość wykrywania potencjałów czynnościowych pojedynczego wskaźnika wapnia15.</li>
	<li>Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera zastosowane parametry stymulacji elektrycznej, takie jak [Numer elektrody]_[Amplituda impulsu]_[Czas trwania impulsu]_[Częstotliwość impulsu]_Image001.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>ImageJ/FIJI w celu wyodrębnienia profilu intensywności fluorescencji w czasie i współrzędnych przestrzennych z somy komórkowej
	<ol>
		<li>Podziel obszar zainteresowania na segmenty (ROI) za pomocą "Narzędzi wyboru obszaru" i dodaj go do Menedżera ROI (Analizuj narzędzia > > Menedżer ROI > Dodaj). Z menu Menedżer ROI zapisz go jako folder .zip (Więcej > Zapisz). 
		UWAGA: Zazwyczaj te same ROI można zastosować do wszystkich eksperymentów stymulacyjnych, ponieważ odpowiadają one temu samemu polu widzenia.</li>
		<li>Wybierz "Średnią wartość szarości" jako parametr do wyodrębnienia (Analizuj > Ustaw pomiary).</li>
		<li>Wyodrębnij "Średnią wartość szarości" z somy komórek, klikając Więcej > wielu miar. Pojawi się okno dialogowe. Włącz opcje Zmierz wszystkie 600 wycinków i Jeden wiersz na wycinek, aby uzyskać pojedynczą tabelę, w której kolumny odpowiadają zwrotom z inwestycji, a wiersze odpowiadają ramom czasowym. Zapisz wygenerowaną tabelę jako .xls arkusz kalkulacyjny.</li>
		<li>Wybierz "Centroid" jako parametr do wyodrębnienia (Analizuj > Ustaw pomiary).</li>
		<li>Wyodrębnij "Centroid" z ROI, klikając przycisk Zmierz. Wygenerowana tabela odpowiada współrzędnym (X,Y) ROI. Zapisz go jako .xls arkusz kalkulacyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Niestandardowy skrypt do identyfikacji komórek, które reagują na bodźce 
	UWAGA: W tym miejscu użyto MATLABA (patrz Tabela materiałów), ale opisane kroki można wykonać w dowolnym języku programowania. Użytkownicy mogą uzyskać nasz niestandardowy skrypt, prosząc o odpowiedniego autora.
	<ol>
		<li>Korekcja efektu fotowybielania: Aby złagodzić efekt tła i fotowybielania, weź 15-20 klatek z okresów niestymulujących przed każdą serią i dopasuj je do krzywej liniowej [fit (poly1)]. 
		UWAGA: W tym przypadku, dla filmu składającego się z 600 klatek, w którym okresowe impulsy były wysyłane co 10 s, klatki 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 zostały uznane za okresy niestymulujące.</li>
		<li>Normalizuj za pomocą wzoru: (X-min) / (max-min)</li>
		<li>Identyfikacja komórek reagujących
		<ol>
			<li>Oblicz średnią kwadratową (RMS) okresów niestymulujących na podstawie znormalizowanych danych. Będzie to traktowane jako sygnał bazowy.</li>
			<li>Oblicz maksimum okresów stymulujących (ramy między okresami niestymulującymi). W tym przypadku, dla łącznego filmu składającego się z 600 klatek, w którym okresowe impulsy były wysyłane co 10 sekund, klatki 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 zostały uznane za okresy stymulujące.</li>
			<li>Jeśli maksymalna wartość przekracza sygnał linii bazowej 2,5 raza dla określonego zwrotu z inwestycji, oznacz komórkę jako reagującą na ten okres stymulacji. Jeśli komórka reaguje na trzy z pięciu okresów stymulacji, sklasyfikuj ją jako komórkę reagującą.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

<ol><li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+causes+of+vision+loss+in+high-income+countries+and+in+Eastern+and+Central+Europe+in+2015%3A+Magnitude%2C+temporal+trends+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections.</a> British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).</li>
<li>Li, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+incidence+of+age-related+macular+degeneration+in+Europe%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).</li>
<li>Roska, B., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring vision.</a> Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).</li>
<li>Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornig%2C+R+%22Implantable+Sensor+Systems+for+Medical+Applications%22">Implantable Sensor Systems for Medical Applications</a>. , Elsevier. 469-496 (2013).</li>
<li>Lewis, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+implantable+bionic+devices+for+blindness%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in implantable bionic devices for blindness: a review.</a> ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).</li>
<li>Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+retina+to+produce+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+gene+delivery+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The ocular gene delivery landscape.</a> Biomolecules. 11 (8), 1135(2021).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+retinal+ganglion+cell+promoter+for+utility+in+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+diversity+of+retinal+ganglion+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse.</a> Nature. 529, 345-350 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> Nature. 615, 884-891 (2023).</li>
<li>Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Guidelines+April+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">NIH Guidelines April 2019.</a> Applied Biosafety. 24, Preprint at https://doi.org/10.1177/1535676019871146 (2019).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+expression+in+retinal+ganglion+cells+characterized+using+a+low-cost+fundus+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018(2017).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+spatial+resolution+of+epiretinal+implants+by+increasing+stimulus+pulse+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration.</a> Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).</li>
<li>Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+strategies+for+selective+activation+of+retinal+ganglion+cell+soma+and+threshold+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction.</a> Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017(2019).</li>
<li>Im, M., Fried, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+properties+of+network-mediated+responses+to+repetitive+stimuli+are+dependent+upon+retinal+ganglion+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type.</a> Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002(2016).</li>
<li>Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thresholds+for+activation+of+rabbit+retinal+ganglion+cells+with+relatively+large%2C+extracellular+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).</li>
<li>Ramos, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-reported+complications+after+intravitreal+injection+and+their+predictive+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+Retina%22%5BJournal%5D)">Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors.</a> Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viral+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy.</a> Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).</li>
<li>Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+new+vectors+for+retinal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing new vectors for retinal gene therapy.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291(2023).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Hellström, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+tropism+and+transduction+properties+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+in+adult+retina+after+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection.</a> Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+calcium+sensor+GCaMP-X+overcomes+the+calcium+channel+perturbations+induced+by+the+calmodulin+in+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP.</a> Nature Communications. 9, 1504(2018).</li>
<li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+adeno-associated+viral+%28AAV%29+vector-mediated+transgene+expression+in+retinal+ganglion+cells%3A+comparison+of+five+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters.</a> Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).</li>
<li>Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuronal+cultures+to+detect+and+study+new+pathogenic+antibodies+involved+in+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 184, e63829(2022).</li>
<li>Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+epiretinal+prosthesis+is+not+limited+by+electrode+size%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień, które mogliby dodać do manuskryptu.

Opisany tutaj protokół służy do badania dynamiki wapnia występującej w GCL siatkówki szczura po stymulacji elektrycznej dostarczonej MEA. Jest to niezawodna i łatwa do opanowania metoda, ale wymaga pewnego treningu, szczególnie w celu równomiernego i skutecznego oznakowania GCL oraz prawidłowego zamontowania siatkówki w celu zapewnienia optymalnego kontaktu tkanka-elektroda. Protokół ten jest specyficzny dla gryzoni i musi zostać dostosowany, jeśli zostanie zastosowany do innego gatunku laboratoryjnego. Szczegółowo przedstawiono punkty krytyczne, modyfikacje i ograniczenia metodologii.
Iniekcje doszklistkowe Zastrzyki są szeroko stosowane do dostarczania genów do oka, przy czym preferowaną procedurą są zastrzyki doszklistkowe. Udowodniono, że są one bezpieczniejsze i mniej inwazyjne w porównaniu z iniekcjami podsiatkówkowymi, które wprowadzają interesujące cząsteczki bezpośrednio między fotoreceptory a nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), ryzykując odwarstwienie siatkówki10. Istnieją jednak ograniczenia, zwłaszcza podczas wykonywania tych iniekcji w modelach gryzoni. Ciało szkliste jest galaretowate, co utrudnia dyfuzję wirusa. Co więcej, soczewka w oczach gryzoni jest duża, dzięki czemu włożenie igły bez jej zarysowania jest nietrywialne. Igły do precyzyjnych strzykawek są delikatne i wymagają częstej wymiany. Aby zapobiec niedrożności, myj je wodą dejonizowaną przed i po każdym użyciu i regularnie wymieniaj. Dodatkowo należy wstrzykiwać zawartość powoli, aby zapobiec refluksowi roztworu i zmianom ciśnienia wewnątrzgałkowego. Uzyskanie dużej i jednolitej fluorescencji w siatkówce może wymagać praktyki.
Transdukcja komórek siatkówki Wektory wirusowe są doskonałą metodą dostarczania genów in vivo, a AAV są szeroko stosowane do transdukcji komórek siatkówki10. Zostały one zatwierdzone do leczenia niektórych retinopatii powodujących ślepotę u ludzi24. Ich zdolność nośna jest jednak ograniczona do 5 kb, z uwzględnieniem wymaganych elementów regulacyjnych (np. promotora)10,25. Dostępnych jest wiele serotypów, z których każdy ma inny tropizm. Wybierz najbardziej odpowiedni AAV w oparciu o geny, które mają zostać dostarczone, i komórki, które mają zostać transdukowane26. Do oznaczania RGC zaleca się stosowanie AAV227.
Okno ekspresji genów Optymalna ekspresja wirusa dla AAV2-CAG-GCaMP5G wynosi od 2 do 3 tygodni po wstrzyknięciu12,18. Po przekroczeniu tego czasu jądra z transfekowanych komórek stają się fluorescencyjne, komórki przestają reagować na bodźce i ostatecznie umierają 7,28,29. Wynika to z nadekspresji wskaźnika GCaMP, który ulega translokacji do jądra. Okno czasowe dla optymalnej ekspresji genów będzie się różnić w zależności od wektora wirusowego i wybranego promotora30 i musi zostać określone eksperymentalnie przed przystąpieniem do tego protokołu.
Kontakt tkanka-elektroda Dla uzyskania optymalnych i powtarzalnych wyników kluczowe znaczenie ma uzyskanie dobrego kontaktu tkanka-elektroda. Słaby kontakt jest zwykle spowodowany naturalną krzywizną siatkówki. Jednym ze sposobów jest pocięcie siatkówki na ćwiartki, zamontowanie i zobrazowanie jednej sekcji na raz. Małe fragmenty siatkówki mogą być lepiej spłaszczone, co skutkuje bardziej efektywnym kontaktem z powierzchnią MEA. Innym potencjalnym powodem słabego kontaktu jest obecność ciała szklistego. Podczas przeprowadzania eksperymentów stymulacyjnych symulujących implant nadsiatkówkowy ważne jest, aby ostrożnie usunąć ciało szkliste podczas wycinania siatkówki, ponieważ może ono działać jako izolator prądu. W tym miejscu opisano prostą metodę sprawdzania, czy kontakt jest wystarczający, poprzez wizualizację elektrody i ogniw w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
Alternatywą dla pomiarów siatkówki ex vivo jest hodowanie neuronów bezpośrednio na powierzchni elektrod. Pierwotna hodowla neuronów, takich jak neurony hipokampa31, może być przydatna do wstępnych testów w celu oceny funkcjonalności nowego urządzenia stymulującego. Jednak takie podejście nadal wymaga wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i nie reprezentuje złożoności sieci siatkówkowej, która jest ważna dla oceny odpowiedzi synaptycznych na stymulację.
Do wizualizacji ogniw pod elektrodą i śladami elektrod można użyć MEA wykonanych z przezroczystych materiałów, takich jak tlenek indu i cyny (ITO) 19,20,32. Oprócz pomiarów optycznych, aktywność GCL po stymulacji elektrycznej można ocenić za pomocą zapisów elektrycznych. MEA może być używany do rejestrowania lokalnego potencjału pola (LFP) tkanki. Wpływa to jednak negatywnie na rozdzielczość przestrzenną, ponieważ każda elektroda przechwytuje aktywność z wielu ogniw jednocześnie (w zależności od wymiarów elektrody). Zapis optyczny pokonuje to ograniczenie i oferuje mapowanie w wyższej rozdzielczości przestrzennej. Jego główną zaletą jest możliwość rozróżnienia komórek aktywnych i nieaktywnych przy jednoczesnym pomiarze dużego pola widzenia z rozdzielczością pojedynczej komórki. Spośród wszystkich reporterów aktywności komórkowej wskaźniki wapnia są dobrze opisane i najczęściej stosowane33.

Siatkówka zawiera fotoreceptory, które są komórkami odpowiedzialnymi za wykrywanie światła. Wychwytują fotony i przekształcają je w impulsy nerwowe. Impulsy te są następnie przetwarzane w siatkówce i przekazywane do kory wzrokowej, co skutkuje powstaniem obrazu wizualnego1. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) to choroby zwyrodnieniowe charakteryzujące się postępującą utratą fotoreceptorów. Te retinopatie są jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie1, dotykając miliony osób i powodując znaczące konsekwencje medyczne, osobiste i społeczno-ekonomiczne dla pacjentów, systemów opieki zdrowotnej i społeczeństwa jako całości. Co więcej, wraz ze starzeniem się populacji przewiduje się, że liczba przypadków AMD wzrośnie o 15% do 2050 roku2.
Obecnie prowadzone są liczne badania mające na celu przywrócenie wzroku pacjentom dotkniętym tymi schorzeniami3. Jednym z obiecujących podejść jest zastosowanie protez siatkówki, które wykazały skuteczność w częściowym przywracaniu wzroku4,5. Urządzenia te wychwytują światło ze sceny wizualnej i przekształcają je w impulsy elektryczne. Impulsy te są dostarczane przez elektrody w układzie mikroelektrod (MEA) wszczepionym do oka, stymulując neurony, które przeżyły, i omijając funkcję utraconych fotoreceptorów. Aktywowane komórki zwojowe siatkówki (RGC) przekazują dane wyjściowe do mózgu, gdzie są interpretowane jako percepcja wzrokowa. Jednak główne ograniczenia obecnych implantów leżą w rozdzielczości interfejsu elektroda-tkanka6 oraz nieselektywnej stymulacji różnych typów komórek. Dlatego, aby zoptymalizować konstrukcję nowych urządzeń wszczepialnych w celu bardziej efektywnego przywracania wzroku, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób można opracować paradygmaty stymulacji w celu selektywnej aktywacji komórek w bliskiej odległości od elektrod.
Obrazowanie wapnia jest powszechnie stosowaną techniką badania aktywności neuronalnej, oferującą kilka zalet w porównaniu z metodami nieoptycznymi7,8. Po pierwsze, zapewnia rozdzielczość komórkową i subkomórkową. Po drugie, markery wapnia mogą być ukierunkowane na określone typy komórek. Po trzecie, pozwala na długoterminowe śledzenie, a po czwarte, umożliwia obserwację całych populacji komórek przy jednoczesnym rozróżnieniu komórek aktywnych i nieaktywnych. Metoda ta dostarcza pośrednich dowodów na aktywność komórkową z rozdzielczością czasową w zakresie setek milisekund. Genetycznie kodowane fluorescencyjne wskaźniki wapnia, takie jak czujniki GCaMP, ulegają zmianie konformacyjnej po związaniu z wapniem, co skutkuje zwiększoną fluorescencją9. Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) są skutecznym sposobem transdukcji komórek siatkówki za pomocą GCaMP10.
Ten protokół przedstawia efektywną metodę, która wykorzystuje obrazowanie wapnia do testowania protokołów stymulacji implantów siatkówki. W szczególności koncentrujemy się na tkance siatkówki szczura ex vivo i zapewniamy szczegółowe instrukcje krok po kroku, od pobrania próbki po analizę danych. Oferując ten obszerny przewodnik, naukowcy z różnych środowisk mogą bez obaw rozpocząć eksperymenty ze stymulacją elektryczną.

<table><tbody><tr><td>20x NA 0,75 S Fluor obiektyw powietrzny</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20X-3,5</td><td></td></tr> <tr><td>cm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Nunc</td><td>12-565-90-30</td><td></td></tr> <tr><td>G igła</td><td>VWR</td><td>613-5373-36</td><td></td></tr> <tr><td>G igła</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2-6</td><td></td></tr> <tr><td>cm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Nunc</td> 12-565-94-AAV2-CAG-GCaMP5G <td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vector Biolabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420-Blade</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Swann-morton</td><td>0308-Kamera</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0-Carbogen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Air liquide</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Zakrzywione-kleszcze&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>91501-09-FITC</td><td></td></tr> <tr><td>kostka filtra</td><td>Nikon</td><td>Standard</td><td></td></tr> series-Świetlówka <tr><td></td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C-HGFI-Fluorescencyjny</td><td></td></tr> <tr><td>mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ25-HBSS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Koziorożec</td><td>HBSS-1A-ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>/FIDŻI&nbsp;</td><td>NIH</td><td>v1.50i-System</td><td></td></tr> <tr><td>obrazowania siatkówki in vivo&nbsp;</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td></td> <td>Micron III-Odwrócony</td></tr> <tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse</td><td></td></tr> <tr><td>Ti-Isofluorane</td><td>Arrane Baxter Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Long-Evans rat</td><td>Janvier</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-MATLAB (wersja R2021b)&nbsp;</td><td>Mathworks</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Filtry mediów</td><td>Merckmillipore</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SCGPS02RE-Methocel 2%</td> <td>Omni Vision</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Matryca mikroelektrod (MEA)</td><td>-</td><td>Wykonane</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermofisher</td><td>42427-Penicylina</td><td></td></tr><tr><td>/Streptomycyna 100x</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>- </td></tr><tr><td>Fenylefryna</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratoria</td><td>653437.3</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Pipeta plastikowa</td><td>VWR</td><td>612-1793-Porowata</td><td></td></tr> <tr><td>membrana</td><td>Merckmillipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#JVWP01300-Precyzyjna strzykawka</td><td>World Precision Instruments</td><td>10 &micro; l</td> Nanofil-Prescaina <td></td></tr><tr><td>Llorens-Chlorohydrat</td><td></td> <td>oksybuprokainy (2 mg/ml), znieczulenie miejscowe</td><td></td></tr> <tr><td>Maska nosowa dla szczurów</td><td>Xenotec</td><td>XRK-RA-Małe</td><td></td></tr> <tr><td>zakrzywione kleszcze&nbsp;</td><td>Bbraun</td><td></td><td></td> AESCBD311R-Nożyczki-sprężynowe</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FST</td><td>15040-11-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-Kleszcze</td><td></td></tr> <tr><td>proste&nbsp;</td><td>FST</td><td>11252-20-Nitka</td><td></td></tr> <tr><td>do szwów</td><td>Vitrex Medical</td><td>4328</td><td>Nilon monofilament, 7/0, DS12</td></tr><tr><td>Tobradex</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratoria</td> <td>-</td> <td>Tobramycyna (3 mg / ml) i deksametazon (1 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Tropicamid</td><td>Alcon Cus&iacute; Laboratoria</td><td>653486</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Myjka</td><td>Thorlabs</td><td>W8S038</td><td>-</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Dystrofie siatkówki są główną przyczyną ślepoty na całym świecie. Trwają intensywne prace nad opracowaniem zaawansowanych protez siatkówki, które mogą ominąć upośledzone komórki fotoreceptorów światłoczułych w zdegenerowanej siatkówce, mając na celu częściowe przywrócenie wzroku poprzez indukcję percepcji wzrokowej. Jednym z powszechnych kierunków badań jest projektowanie i produkcja wszczepialnych urządzeń o elastycznej strukturze fizycznej, zawierających dużą liczbę elektrod. Umożliwia to sprawne i precyzyjne generowanie percepcji wizualnych. Jednak wraz z każdym postępem technologicznym pojawia się zapotrzebowanie na niezawodną i łatwą w obsłudze metodę ex vivo w celu weryfikacji funkcjonalności urządzenia przed przejściem do eksperymentów in vivo, w których w grę wchodzą czynniki wykraczające poza działanie urządzenia. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki (GCL) po stymulacji elektrycznej. W szczególności przedstawiono następujące kroki: (1) fluorescencyjne znakowanie siatkówki szczura za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, (2) przechwytywanie sygnału fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy zastosowaniu wyraźnych wzorców stymulacji elektrycznej oraz (3) ekstrakcja i analiza śladów wapnia z poszczególnych komórek w GCL. Postępując zgodnie z tą procedurą, naukowcy mogą skutecznie testować nowe protokoły stymulacji przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo.

Protokół opisany w niniejszym badaniu opiera się na badaniach obrazowania fluorescencyjnego i stymulacji elektrycznej przeprowadzonych przez Weitz i wsp.12. Protokół składa się z trzech głównych części: (1) znakowania fluorescencyjnego GCL i montażu siatkówki na płasko na MEA (Rycina 1-lewa), (2) wizualizacji aktywności wapniowej w GCL podczas stymulacji elektrycznej (Rycina 1-środek) oraz (3) ekstrakcji, przetwarzania i interpretacji danych obrazowych (Rycina 1-prawa).
Najpierw, jak przedstawiono w Rysunek 1– po lewej stronie, szczurom Long Evans podano domięśniowo do ciała szklistego AAV2-CAG-GCaMP5G przed sesją obrazowania. Optymalna ekspresja wirusa dla tego wektora występuje od 2 do 3 tygodni po iniekcji12,18Po pełnym znieczuleniu zwierzęcia, za pomocą igły 30 G wykonuje się otwór pilotażowy, a następnie 5 µL AAV2-CAG-GCaMP5G jest powoli wstrzykiwane do ciała szklistego za pomocą tępej igły 36 G przymocowanej do precyzyjnej strzykawki, aby zapobiec cofaniu się preparatu. Podczas ekspresji wirusa, an in vivo System obrazowania siatkówki jest wykorzystywany do oceny stanu siatkówki po operacji, przy czym obrazy OCT zapewniają szczegółową wizualizację warstw siatkówki. Po uzyskaniu ekspresji genu siatkówkę ostrożnie wyekstrahowuje się z oczodołu, używając stereomikroskopu i precyzyjnych narzędzi do dyssekcji. Od tego momentu tkanką manipuluje się w mediach natlenionych, aby zachować próbkę. Wycięta siatkówka, warstwą komórek zwojowych (GCL) skierowaną do góry, jest następnie mocowana na platformie przeznaczonej do montażu na płasko (flat-mounting), aby zapewnić stabilność i zapobiec unoszeniu się próbki. Próbkę mocuje się na powierzchni MEA, kierując GCL w stronę elektrod.
Następnie MEA jest montowana na płycie interfejsu w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym (Rysunek 1-środek). Próbka siatkówki jest perfundowana natlenionym medium w temperaturze 33 °C przy użyciu systemu perfuzji. Próbka może być utrzymywana w tej konfiguracji przez kilka godzin. Programowany jest pożądany schemat stymulacji, a obrazy są rejestrowane z częstotliwością 10 klatek na sekundę. Zaleca się nazywanie plików wideo zgodnie z zastosowanymi parametrami stymulacji elektrycznej. Akwizycja obrazów powinna rozpocząć się przed inicjacją stymulacji, aby uzyskać kilka klatek bazowych bez stymulacji, które posłużą jako kontrola negatywna.
Wreszcie, jak pokazano na Rysunku 1 (po prawej), dane są ekstrahowane z obrazów time-lapse poprzez segmentację som celluli. Efekty fotoblkowania są korygowane poprzez dopasowanie danych, a następnie identyfikuje się komórki responsywne. Komórki responsywne definiuje się jako takie, w których szczyty fluorescencji podczas stymulacji przekraczają ich poziom bazowy 2,5-krotnie. Jeśli komórka reaguje na trzy z pięciu serii stymulacji, uznaje się ją za responsywną na tę konkretną sekwencję stymulacji.
<img alt="Znakowanie GCL, montaż siatkówki, obrazowanie wapnia ex vivo, segmentacja ROI; eksperyment mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd badania. Schematyczna ilustracja protokołu dla (po lewej) fluorescencyjnego znakowania GCL siatkówki i montażu próbek, (na środku) przygotowania układu do rejestracji ex vivo ze stymulacją elektryczną za pomocą MEA oraz (po prawej) analizy danych obrazowania wapnia w celu zaklasyfikowania komórek responsywnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Siatkówka po wstrzyknięciu do ciała szklistego 
Częstość występowania powikłań związanych z wstrzyknięciami do ciała szklistego jest bardzo niska. Mogą jednak wystąpić powikłania wynikające z samego zabiegu, niezależnie od podanego składnika. Powikłania te obejmują powstanie zaćmy, krwotok do ciała szklistego, wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego oraz zapalenie wnętrza gałki ocznej23. Aby ustalić, czy powikłania te są spowodowane zabiegiem, zwierzę musi zostać poddane ocenie przed procedurą za pomocą funduskopii i OCT. Kontrolę zwierząt należy przeprowadzić trzy dni po wstrzyknięciu. Na Rysunku 2A-D przedstawiono siatkówkę zdrowego zwierzęcia po wstrzyknięciu. Po dwóch tygodniach od wstrzyknięcia komórki zwojowe siatkówki (RGC) zaczynają wykazywać fluorescencję, którą można zwizualizować za pomocą funduskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2B,C). Obrazy OCT zapewniają szczegółową wizualizację rozmieszczenia i grubości warstw siatkówki (Rysunek 2D), oferując wyższą rozdzielczość w porównaniu do funduskopii, szczególnie przy ocenie odwarstwienia siatkówki. Po przygotowaniu preparatu siatkówki metodą flat-mount i obrazowaniu za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego możliwe staje się rozróżnienie komórek i pęczków aksonów. W przeciwieństwie do innych wskaźników wapnia, wskaźnik GCaMP jest ograniczony do cytoplazmy7, a fluorescencja nie występuje w jądrze komórkowym (Rysunek 2E).
<img alt="Analiza obrazowania siatkówki; A-D: Skanowanie oka, E: Wynik OCT; Wizualizacja struktury siatkówki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy siatkówki po wstrzyknięciu do ciała szklistego. (A) Fundoskopia, (B) fundoskopia fluorescencyjna, (C) powiększenie obrazu fundoskopii fluorescencyjnej, (D) obraz OCT oraz (E) obraz epi-fluorescencyjny wyciętej siatkówki zamontowanej na niestandardowej macierzy MEA z elektrodami grafenowymi na borokrzemianowym szkle o grubości 500 µm. Na obrazie (E) czarne linie odpowiadają ścieżkom Ti/Au. Paski skali: 115 µm (D) i 100 µm (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Elektrody i kontakt z GCL 
Aby skutecznie wywołać odpowiedzi neuronalne, kluczowe jest zapewnienie ścisłego kontaktu siatkówki zamontowanej na płasko z powierzchnią MEA. Prostym sposobem weryfikacji jest wizualne potwierdzenie, czy komórki i elektrody znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania (Rycina 3A). Jeśli komórki nie znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania co elektrody (Rycina 3B), wskazuje to na nieoptymalny kontakt, co doprowadzi do mniej skutecznej stymulacji.
<img alt="Para obrazów mikroskopowych przedstawiająca okluzję mikrokrążenia siatkówki; analiza intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Elektrody i kontakt z GCL. (A) Komórki i elektroda (gwiazdka) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. (B) Komórki i elektrody nie znajdujące się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co wskazuje na nieoptymalny kontakt do stymulacji elektrycznej w tym obszarze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ex vivo obrazowanie wapnia po stymulacji elektrycznej za pomocą MEA 
Dane uzyskane z obrazowania wapnia składają się z obrazów poklatkowych monitorujących aktywność neuronalną setek komórek w odpowiedzi na stymulację elektryczną. Bodźce ponadprogowe powodują napływ wapnia do som komórkowych, co skutkuje nagłą zmianą intensywności fluorescencji (Video 1). Niniejszy protokół umożliwia określenie, czy elektroda, MEA i/lub algorytm stymulacji wywołują pożądaną odpowiedź w tkance nerwowej. Rozmiar i rozstaw elektrod na MEA, a także proporcja badanej tkanki, determinują wybór odpowiedniego powiększenia obiektywu. Zazwyczaj w przypadku badań stymulacji pojedynczą elektrodą o średnicy od 5 µm do 100 µm odpowiednie jest powiększenie obiektywu 20-25x (Figure 4A), co zapewnia pole widzenia (FOV) o wymiarach około 600 µm x 600 µm. W eksperymentach obejmujących stymulację wieloma elektrodami konieczne może być powiększenie obiektywu 4-10x w celu oceny szerszego obszaru o wymiarach około 2 mm x 2 mm. Komórki reagujące można łatwo zidentyfikować, generując projekcję obrazu odchylenia standardowego z filmu poklatkowego (Figure 4B i Video 1).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący aktywność neuronalną, przedstawiający obszary synaptyczne i łączność sieci." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazowanie wapnia w GCL przy stymulacji elektrycznej za pomocą elektrody o średnicy 25 µm. (A) Projekcja maksymalna z 60 s filmu poklatkowego oraz (B) projekcja odchylenia standardowego wyraźnie przedstawiająca komórki reagujące na bodźce elektryczne z porowatej elektrody na bazie grafenu o średnicy 25 µm. Elektrodę stymulującą oznaczono gwiazdką. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Analiza dynamiki wapnia w czasie po kontrolowanej stymulacji 
Dla każdego zidentyfikowanego ciała komórki wyekstrahowano średnie wartości intensywności w czasie. Rycina 5A przedstawia skorygowane pod kątem fotoblaknięcia ślady wapnia z komórek odpowiadających na bodziec. W tym przykładzie podczas 60 s akwizycji obrazu co 10 s (oznaczone czarnymi liniami) podano pięć serii dwufazowych pociągów impulsów (pierwszy impuls katodowy, 40 cykli, czas trwania 1 ms, amplituda 2 µA). W ramach danego eksperymentu stosuje się te same pięć pociągów impulsów, aby sprawdzić spójność odpowiedzi. Klatki zarejestrowane w okresach braku stymulacji (wyróżnione na czerwono) są wykorzystywane do wykonania dopasowania liniowego w celu korekcji efektu fotoblaknięcia.
Po zidentyfikowaniu komórek reagujących i wyznaczeniu ich współrzędnych (x,y) względem elektrody stymulującej, można zbadać zależność między natężeniem prądu wymaganym do aktywacji komórek a odległością od elektrody stymulującej (Rycina 5B). Zgodnie z przewidywaniami, komórki znajdujące się bliżej elektrody stymulującej wymagają niższych wartości natężenia prądu w celu wywołania odpowiedzi.
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji i tabela amplitud impulsów dla analizy pobudzenia optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65705/65705fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przedstawienie odpowiedzi wywołanych elektrycznie. (A) Ślady wapniowe som komórkowych po 5 seriach pociągów impulsów (dwufazowych, z pierwszym impulsem katodowym, 40 cykli, czas trwania 1 ms, amplituda 2 µA) co 10 s (linie czarne) podczas 60 s akwizycji obrazu. Pokazano okresy niestymulujące (ramki zaznaczone na czerwono) oraz okresy stymulujące (ramki zaznaczone na żółto). Ślady przekraczające sygnał bazowy (pierwiastnik średniej kwadratów z okresów niestymulujących) 2,5-krotnie są uznawane za odpowiedzi wywołane. Komórki reagujące w trzech z pięciu okresów stymulujących są klasyfikowane jako komórki reagujące. (B) Mapa rozkładu aktywności wapniowej pokazująca elektrodę stymulującą (koło z czarnym obrysem) i komórki (koła z szarym obrysem). Kod kolorystyczny reprezentuje minimalną amplitudę impulsu niezbędną do wywołania odpowiedzi komórkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/65705fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Obrazowanie wapnia w GCL przy stymulacji elektrycznej za pomocą elektrody o średnicy 25 µm. Film przedstawia różnice w intensywności fluorescencji wynikające ze stymulacji elektrycznej za pomocą porowatej elektrody na bazie grafenu o średnicy 25 µm. Po lewej stronie widoczny jest oryginalny film, a po prawej projekcja odchylenia standardowego, na której można łatwo zidentyfikować reagujące komórki. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65705/Figure_S1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Chociaż podjęto próby przetestowania urządzeń do implantacji siatkówki przy użyciu tej realnej metody, pomyślałem, że brakuje szczegółowego protokołu od uwagi próbki do analizy danych. Dzięki tym pracom zamierzamy wypełnić tę lukę, zapewniając naukowcom z różnych środowisk niezbędne narzędzia, aby pewnie rozpocząć eksperymenty ze stymulacją neuronalnej siatkówki. Obrazowanie wapnia jest popularną techniką badania aktywności neuronalnej, która ma kilka zalet w porównaniu z metodami nanocząsteczkowymi.Zapewnia rozdzielczość komórkową i może celować w określone typy komórek. Jest to szczególnie przydatne do testowania nowych obrazów, ponieważ umożliwia rozróżnienie między aktywnymi i nieaktywnymi komórkami podczas stymulacji elektrycznej. Wprowadzamy solidną metodologię badania odpowiedzi neuronów siatkówki za pomocą obrazowania wapnia.Takie podejście może dostarczyć informacji na temat selektywnego wzbudzania komórek. Jest to kluczowy krok w kierunku opracowania lepszych protokołów stymulacji, poprawy wydajności implantów i postępu w dziedzinie najnowszych osiągnięć. Nasze laboratorium koncentruje się na opracowywaniu zaawansowanych technik mikroskopowych.Obecnie pracujemy nad rejestrowaniem dynamiki wapnia w 3D, aby lepiej zrozumieć interakcję w całej tkance. 2 do 3 tygodni przed obrazowaniem do ciała szklistego znieczulonego oka szczura wstrzykuje się cząsteczki wirusa niosące genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia. Za pomocą kopii dna oka i tomografii komputerowej bada się strukturę siatkówki pod kątem działań niepożądanych po wstrzyknięciu wskaźnika wapniowego.Dwa tygodnie po wstrzyknięciu warstwa komórek zwojowych lub GCL wykazywała emisję fluorescencji. Następnie rozpoczyna się wycięcie siatkówki od szczura, który został poddany eutanazji. Weź oczy z ekspresją AAV o wadze dwóch kg camp 5G i usuń całą tkankę otaczającą gałkę oczną za pomocą małych zakrzywionych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych.Następnie weź kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach trzy na trzy centymetry. Umieść go na pokrywie naczynia o średnicy 3,5 cm i nasącz bibułę filtracyjną pożywką Amesa. Umieść gałkę oczną na papierze tak, aby przedni segment był skierowany w stronę operatora.Użyj pary prostych kleszczy, aby przytrzymać gałkę oczną pod kątem około 45 stopni od powierzchni naczynia. Użyj szczeliny między prostymi kleszczami, aby poprowadzić nacięcie ostrzem, a następnie zanurz gałkę oczną w medium Amesa. Użyj prostych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.Ostrożnie zdejmij soczewkę za pomocą dwóch par prostych kleszczyków i odłącz siatkówkę od twardówki. Za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w twardówce w kierunku nerwu wzrokowego i tnij, aż siatkówka zostanie pomyślnie oddzielona od oka. Filiżanka. Przenieś wycięty kawałek siatkówki na membranę montażową za pomocą plastikowej pipety z odciętą końcówką.Następnie użyj pary prostych kleszczyków, aby płasko zamontować siatkówkę, upewniając się, że warstwa komórek zwojowych jest skierowana do góry. Następnie użyj plastikowej pipety wyposażonej w końcówkę do pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby usunąć pożywkę, ułatwiając przyleganie elementu siatkówki do porowatej membrany. Następnie odwróć zespół na układ mikroelektrod lub miarę, umieszczając gxl na elektrodach, a następnie napełnij kąpiel próbki natlenionym podłożem Amesa.Umieść siatkówkę szczura z ekspresją 5G w obozie G zamontowaną na meaa, tak aby GCL był skierowany w stronę elektrod na stoliku mikroskopu. Podłączyć system perfuzyjny i ustawić parametry tak, aby stale perfundować kąpiel próbki natlenionym podłożem Amesa. Następnie zbadaj siatkówkę za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w lampę fluorescencyjną, filtr cytowy i kamerę CMOs.Poszukaj obszaru, w którym elektrody stymulujące i fluorescencja z komórek ekspresyjnych G.Camp są widoczne w generatorach impulsów. Oprogramowanie konfiguruje parametry stymulacji elektrycznej, takie jak kształt, amplituda, czas trwania, opóźnienie fazowe i częstotliwość impulsów do aplikacji. Podłącz kamerę do generatora impulsów za pomocą wyjściowego sygnału wyzwalającego i ustaw tryb przechwytywania oprogramowania kamery na zewnętrzny wyzwalacz startowy.Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu aparatu, aby poczekał na uruchomienie zewnętrznego wyzwalacza. Rozpocznij proces akwizycji obrazu za pomocą oprogramowania generatora impulsów i zapisz przechwycone obrazy, upewniając się, że nazwa pliku zawiera wszystkie zastosowane parametry stymulacji elektrycznej. Teraz otwórz obraz J i podziel obszar zainteresowania na segmenty za pomocą narzędzi do zaznaczania obszarów.Dodaj go do menedżera ROI i zapisz jako folder zip za pomocą menu menedżera ROI. Wyodrębnij średnią wartość szarości z komórki soma, przechodząc do pozycji więcej i klikając pozycję Wiele miar. Umożliwia pomiar wszystkich 600 wycinków i precyzyjnych opcji jednego wiersza, aby uzyskać pojedynczą tabelę, w której kolumny odpowiadają ROI, rozmiarowi i wierszom.Odpowiadają ramom czasowym. Następnie wyodrębnij środek ciężkości z rozmiaru ROI za pomocą polecenia pomiaru, aby skorygować efekt wybielania zdjęć i zminimalizować tło. Wybierz około 15 do 20 klatek z interwałów niestymulujących przed każdą serią i dopasuj te klatki do krzywej liniowej, aby zapewnić optymalną analizę danych.Pokazano ślady wapnia w komórkach somy po pięciu impulsach co 10 sekund podczas akwizycji obrazu z lat 60. Kadry z okresów niestymulujących służą do korekcji efektu wybielania zdjęć. Zależność między prądem wymaganym do aktywacji ogniw a odległością od elektrody stymulującej wykazała, że ogniwa znajdujące się bliżej elektrody stymulującej wymagały niższych wartości prądu, aby wywołać odpowiedź.

calcium-imaging-in-electrically-stimulated-flat-mounted-retinas

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Źródło: Zhilyakov, N. V. et al., Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia technikę obrazowania polegającą na rejestrowaniu szybkich stanów przejściowych wapnia na zakończeniach nerwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stymulując nerw i wychwytując zmiany fluorescencji spowodowane barwnikami wiążącymi wapń, wizualizuje dynamiczny napływ i usuwanie...

Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez &gt;24 godziny.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj metodę obrazowania wapnia w siatkówkach szczurów poddanych stymulacji elektrycznej. Technika ta umożliwia badanie aktywności neuronów siatkówki z rozdzielczością komórkową, wspierając rozwój zaawansowanych protez wzrokowych.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Przeglądaj więcej filmów