Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach
18 sierpnia 2023
Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.
Chociaż podjęto próby przetestowania urządzeń do implantacji siatkówki przy użyciu tej realnej metody, pomyślałem, że brakuje szczegółowego protokołu od uwagi próbki do analizy danych. Dzięki tym pracom zamierzamy wypełnić tę lukę, zapewniając naukowcom z różnych środowisk niezbędne narzędzia, aby pewnie rozpocząć eksperymenty ze stymulacją neuronalnej siatkówki. Obrazowanie wapnia jest popularną techniką badania aktywności neuronalnej, która ma kilka zalet w porównaniu z metodami nanocząsteczkowymi.
Zapewnia rozdzielczość komórkową i może celować w określone typy komórek. Jest to szczególnie przydatne do testowania nowych obrazów, ponieważ umożliwia rozróżnienie między aktywnymi i nieaktywnymi komórkami podczas stymulacji elektrycznej. Wprowadzamy solidną metodologię badania odpowiedzi neuronów siatkówki za pomocą obrazowania wapnia.
Takie podejście może dostarczyć informacji na temat selektywnego wzbudzania komórek. Jest to kluczowy krok w kierunku opracowania lepszych protokołów stymulacji, poprawy wydajności implantów i postępu w dziedzinie najnowszych osiągnięć. Nasze laboratorium koncentruje się na opracowywaniu zaawansowanych technik mikroskopowych.
Obecnie pracujemy nad rejestrowaniem dynamiki wapnia w 3D, aby lepiej zrozumieć interakcję w całej tkance. 2 do 3 tygodni przed obrazowaniem do ciała szklistego znieczulonego oka szczura wstrzykuje się cząsteczki wirusa niosące genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia. Za pomocą kopii dna oka i tomografii komputerowej bada się strukturę siatkówki pod kątem działań niepożądanych po wstrzyknięciu wskaźnika wapniowego.
Dwa tygodnie po wstrzyknięciu warstwa komórek zwojowych lub GCL wykazywała emisję fluorescencji. Następnie rozpoczyna się wycięcie siatkówki od szczura, który został poddany eutanazji. Weź oczy z ekspresją AAV o wadze dwóch kg camp 5G i usuń całą tkankę otaczającą gałkę oczną za pomocą małych zakrzywionych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych.
Następnie weź kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach trzy na trzy centymetry. Umieść go na pokrywie naczynia o średnicy 3,5 cm i nasącz bibułę filtracyjną pożywką Amesa. Umieść gałkę oczną na papierze tak, aby przedni segment był skierowany w stronę operatora.
Użyj pary prostych kleszczy, aby przytrzymać gałkę oczną pod kątem około 45 stopni od powierzchni naczynia. Użyj szczeliny między prostymi kleszczami, aby poprowadzić nacięcie ostrzem, a następnie zanurz gałkę oczną w medium Amesa. Użyj prostych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.
Ostrożnie zdejmij soczewkę za pomocą dwóch par prostych kleszczyków i odłącz siatkówkę od twardówki. Za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w twardówce w kierunku nerwu wzrokowego i tnij, aż siatkówka zostanie pomyślnie oddzielona od oka. Filiżanka. Przenieś wycięty kawałek siatkówki na membranę montażową za pomocą plastikowej pipety z odciętą końcówką.
Następnie użyj pary prostych kleszczyków, aby płasko zamontować siatkówkę, upewniając się, że warstwa komórek zwojowych jest skierowana do góry. Następnie użyj plastikowej pipety wyposażonej w końcówkę do pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby usunąć pożywkę, ułatwiając przyleganie elementu siatkówki do porowatej membrany. Następnie odwróć zespół na układ mikroelektrod lub miarę, umieszczając gxl na elektrodach, a następnie napełnij kąpiel próbki natlenionym podłożem Amesa.
Umieść siatkówkę szczura z ekspresją 5G w obozie G zamontowaną na meaa, tak aby GCL był skierowany w stronę elektrod na stoliku mikroskopu. Podłączyć system perfuzyjny i ustawić parametry tak, aby stale perfundować kąpiel próbki natlenionym podłożem Amesa. Następnie zbadaj siatkówkę za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w lampę fluorescencyjną, filtr cytowy i kamerę CMOs.
Poszukaj obszaru, w którym elektrody stymulujące i fluorescencja z komórek ekspresyjnych G.Camp są widoczne w generatorach impulsów. Oprogramowanie konfiguruje parametry stymulacji elektrycznej, takie jak kształt, amplituda, czas trwania, opóźnienie fazowe i częstotliwość impulsów do aplikacji. Podłącz kamerę do generatora impulsów za pomocą wyjściowego sygnału wyzwalającego i ustaw tryb przechwytywania oprogramowania kamery na zewnętrzny wyzwalacz startowy.
Naciśnij przycisk start w oprogramowaniu aparatu, aby poczekał na uruchomienie zewnętrznego wyzwalacza. Rozpocznij proces akwizycji obrazu za pomocą oprogramowania generatora impulsów i zapisz przechwycone obrazy, upewniając się, że nazwa pliku zawiera wszystkie zastosowane parametry stymulacji elektrycznej. Teraz otwórz obraz J i podziel obszar zainteresowania na segmenty za pomocą narzędzi do zaznaczania obszarów.
Dodaj go do menedżera ROI i zapisz jako folder zip za pomocą menu menedżera ROI. Wyodrębnij średnią wartość szarości z komórki soma, przechodząc do pozycji więcej i klikając pozycję Wiele miar. Umożliwia pomiar wszystkich 600 wycinków i precyzyjnych opcji jednego wiersza, aby uzyskać pojedynczą tabelę, w której kolumny odpowiadają ROI, rozmiarowi i wierszom.
Odpowiadają ramom czasowym. Następnie wyodrębnij środek ciężkości z rozmiaru ROI za pomocą polecenia pomiaru, aby skorygować efekt wybielania zdjęć i zminimalizować tło. Wybierz około 15 do 20 klatek z interwałów niestymulujących przed każdą serią i dopasuj te klatki do krzywej liniowej, aby zapewnić optymalną analizę danych.
Pokazano ślady wapnia w komórkach somy po pięciu impulsach co 10 sekund podczas akwizycji obrazu z lat 60. Kadry z okresów niestymulujących służą do korekcji efektu wybielania zdjęć. Zależność między prądem wymaganym do aktywacji ogniw a odległością od elektrody stymulującej wykazała, że ogniwa znajdujące się bliżej elektrody stymulującej wymagały niższych wartości prądu, aby wywołać odpowiedź.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia szczegółowy protokół badania aktywności wapniowej w komórkach zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej, co ma kluczowe znaczenie dla rozwoju protez siatkówki. Badacze wykorzystują obrazowanie wapniowe jako metodę badania aktywności neuronalnej, co pozwala na uzyskanie informacji na temat selektywnego pobudzenia neuronów siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia siatkówki
- Obrazowanie wapniowe
Wstęp
- Protezy siatkówki mogą generować percepcje wzrokowe.
- Do skutecznego testowania tych urządzeń niezbędne są metody ex vivo.
- Obrazowanie wapnia zapewnia rozdzielczość komórkową niezbędną do badania aktywności neuronalnej.
- Protokół ten uzupełnia braki w kompleksowych metodologiach testowania.
Cel badania
- Zapewnienie badaczom solidnej metodologii prowadzenia eksperymentów związanych ze stymulacją neuronów siatkówki.
- Umożliwienie testowania nowych urządzeń do protez siatkówki przed ich implantacją.
- Pogłębienie zrozumienia odpowiedzi komórkowych w warstwie komórek zwojowych siatkówki.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie preparatów siatkówki ex vivo od znieczulonych szczurów do oceny dynamiki wapnia.
- Wskaźniki wapnia są wstrzykiwane do ciała szklistego na 2-3 tygodnie przed obrazowaniem.
- Protokoły obejmują precyzyjne techniki chirurgiczne wycięcia i montażu siatkówki.
- Mikroskopia fluorescencyjna jest stosowana do wizualizacji aktywności neuronalnej podczas stymulacji elektrycznej.
Główne wyniki
- Obrazowanie wapnia pozwala na rozróżnienie między komórkami aktywnymi a nieaktywnymi podczas stymulacji.
- Ujawniono zależności między poziomami prądu a odległościami komórek od elektrod stymulujących.
- Szczegółowa metodologia umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi komórek siatkówki.
Wnioski
- Badanie ustanawia ramy dla analizy odpowiedzi neuronów siatkówki na stymulację elektryczną.
- Uzyskane informacje mogą usprawnić przyszłe projektowanie i funkcjonowanie protez siatkówki.
- Niniejszy protokół pogłębia zrozumienie mechanizmów neuronalnych istotnych dla protez wzroku.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne obrazowanie wapnia ex vivo elektrycznie stymulowanych siatkówek zamocowanych na płasko umożliwia wczesną walidację funkcjonalną urządzeń do protezowania siatkówki przed badaniami in vivo. Podejście to dostarcza cennych informacji na temat wzorców aktywacji neuronów, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększając pewność predykcyjną w procesie rozwoju urządzeń. Integracja ilościowych danych dotyczących odpowiedzi neuronalnej na tym etapie pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz priorytetyzację projektów w badaniach i rozwoju nad przywracaniem wzroku.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywacji neuronalnej w odpowiedzi na stymulację elektryczną.
- Wspiera funkcjonalną walidację sygnalizacji indukowanej przez urządzenie w tkance siatkówki istotnej dla przebiegu choroby.
- Zapewnia wyjaśnienie mechanistyczne selektywnego pobudzania komórek zwojowych siatkówki.
- Ułatwia predykcyjną ocenę wydajności urządzenia przed rozpoczęciem badań na zwierzętach.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Ustanawia powtarzalny test ex vivo do oceny protokołów stymulacji.
- Zapewnia ilościowe odczyty obrazowania wapnia do zestandaryzowanego porównania między urządzeniami.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie testu w celu iteracyjnej optymalizacji urządzeń.
- Umożliwia rozróżnienie między aktywnymi a nieaktywnymi populacjami neuronów w określonych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące odpowiedzi neuronalnej ex vivo z punktami końcowymi o znaczeniu translacyjnym dla rozwoju protez.
- Zapewnia ciągłość procesu od inżynierii urządzeń po przedkliniczną walidację aktywacji neuronalnej.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez potwierdzenie funkcji urządzenia w tkance istotnej fizjologicznie przed testami in vivo.
- Umożliwia dostosowanie postępów w rozwoju urządzeń kandydackich do poziomu ryzyka na podstawie ilościowych profili aktywacji neuronalnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół obrazowania wapnia stanowi ogniwo łączące inżynierię urządzeń z walidacją in vivo, umożliwiając przesiew funkcjonalny oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie aktywacji neuronalnej w celu przetestowania hipotez dotyczących urządzenia i wyjaśnienia dróg stymulacji.
- Przesiewanie: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych odczytów do porównywania protokołów i urządzeń.
- Analityka: Ekstrakcja śladów wapniowych oraz danych o aktywacji przestrzennej w celu optymalizacji urządzenia.
- Badania translacyjne: Łączenie wyników ex vivo z modelami przedklinicznymi poprzez walidację odpowiedzi neuronalnych indukowanych przez urządzenie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaoferowanie standaryzowanego przepływu pracy, który można dostosować do wielu potencjalnych urządzeń i paradygmatów stymulacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie działania urządzenia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje walidację ex vivo, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym opracowywanie urządzeń.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na protezy siatkówki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wycinania siatkówki, obrazowania wapniowego oraz stymulacji elektrofizjologicznej.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej, matryc mikroelektrod oraz oprogramowania analitycznego.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów stymulacji i protokołów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być konieczna adaptacja dla różnych modeli siatkówki lub geometrii urządzeń.
- Interpretacja danych musi uwzględniać relacje przestrzenne między elektrodami a komórkami docelowymi.
