Name: Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji bezkomórkowego DNA z cieczy szklistkowej i wodnistej do diagnostyki chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego. Technika ta umożliwia precyzyjne badania molekularne bez konieczności zachowania intaktywnych komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS i Helmut Weigelin, MLS(ASCP) odegrali kluczową rolę w ustanowieniu tej metody ekstrakcji w naszym laboratorium.

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad ludźmi i za zgodą instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) Uniwersytetu Michigan. Uzyskano w tym celu zrzeczenie się świadomej zgody od IRB. Nie ma odpowiednich kryteriów włączenia lub wykluczenia dla pacjentów biorących udział w badaniu.
1. Separacja komponentów komórkowych i bezkomórkowych
UWAGA: Do badań diagnostycznych VRL można otrzymać trzy rodzaje próbek: ciało szkliste (nierozcieńczone; płyn z witrektomii pobrany przed rozpoczęciem infuzji), rozcieńczone ciało szkliste w worku kasetowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), oraz ciecz wodnista (płyn z przedniej komory oka).
<ol>
	<li>W przypadku nierozcieńczonego płynu szklistego, który jest bardzo lepki, należy rozcieńczyć 3-5 ml PBS w celu ułatwienia pipetowania.</li>
	<li>W przypadku rozcieńczonego ciała szklistego w torbie kasety (rysunek uzupełniający 1) spuść płyn do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (jedna na każde 45 ml płynu).</li>
	<li>Ciecz wodnista ma bardzo małą objętość (<200 μL). Aby zapewnić maksymalny odzysk komórek, przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml, przepłucz oryginalną probówkę mikrowirówkową o pojemności 500 μl, w której pobrano próbkę, o równej objętości PBS i dodaj do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować płyn szklisty lub wodny o sile 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA ze składnika komórkowego
<ol>
	<li>Dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek (300 μl dla małych granulek, 1 ml lub więcej dla większych osadów) (patrz Tabela materiałów). Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Po całkowitej lizie dodać 1/3 całkowitej objętości roztworu osadu białkowego (100 μl na 300 μl lizatu) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wiruj energicznie przez 20-30 s. Wiruj przez 3 minuty w temperaturze 3 000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować 300 μl izopropanolu do czystej probówki do mikrowirówki. Ostrożnie odpipetować supernatant z poprzedniego kroku do probówki z izopropanolem.</li>
	<li>Dodać 1,5 μl glikogenu 20 mg/ml (dla 300 μl lizy) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dobrze wymieszać przez odwrócenie, a następnie umieścić próbkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 1 godzinę do nocy, aby wspomóc wytrącanie DNA.</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml przez 5 minut przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej. Odpipetować izopropanol.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 70% etanolu i odwróć probówkę, aby umyć granulkę.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę w temperaturze 3 000 x g w temperaturze pokojowej i zdekantować etanol. Powtórz płukanie etanolem raz.</li>
	<li>Odwróć rurkę na czystej gazie, aby spuścić roztwór i wysuszyć granulkę lub dekantację. Szybko odwiruj DNA w mikrowirówce i odpipetuj pozostałą kroplę etanolu za pomocą jednorazowej końcówki z cienką końcówką (gdy w probówce nie pozostaną żadne resztki etanolu, DNA powinno być suche i gotowe do uwodnienia w ciągu 5-10 minut).</li>
	<li>Dodać 45 μl roztworu hydratującego DNA (patrz tabela materiałów) do wysuszonego osadu DNA.</li>
	<li>Umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 50 °C i pozostawić do rozpuszczenia przez 1-2 godziny. Pipetować DNA w górę i w dół, aby przyspieszyć proces nawodnienia. 
	UWAGA: Dodaj więcej roztworu hydratującego DNA, jeśli próbka wydaje się zbyt lepka.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja DNA bez komórek
<ol>
	<li>Ilość supernatantu z kroku 1.5 jest zmienna. Dodać 70 μl buforu kondycjonującego (patrz tabela materiałów) na każdy mililitr supernatantu.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj kulki czyszczące przez wirowanie. Dodać 10 μl kulek czyszczących w przypadku przetwarzania <14 ml bezkomórkowego supernatantu, 20 μl w przypadku przetwarzania 14-40 ml.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj mieszaninę próbki/kulki przez wirowanie. Wirować przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nie naruszając osadu, odpipetować supernatant, pozostawiając 100 μl, jeśli stosuje się 10 μl kulek czyszczących, i 200 μl, jeśli stosuje się 20 μl kulek czyszczących.</li>
	<li>Dodać równą objętość buforu do wytrawiania osadów moczu (patrz Tabela materiałów) do osadu i dobrze zawiesić osad przez wirowanie lub pipetowanie.</li>
	<li>Dodaj proteinazę K (5% (v/v)) do zawieszonego osadu (np. dodaj 10 μl proteinazy K do 200 μl mieszaniny) i dobrze wymieszaj, delikatnie wirując.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę osadów w temperaturze 55 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać jedną objętość genomowego buforu do lizy (patrz tabela materiałów) do mieszaniny wytrawiającej (np. 210 μl buforu do lizy genomowej na 210 μl mieszaniny wytrawiającej) i wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Przenieść dostępną w handlu kolumnę wirującą (patrz Tabela materiałów) do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do przygotowania DNA moczu do kolumny wirowej, odwirować przy ≥16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu do przemywania DNA moczu do kolumny, odwirować przy ≥16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odlać przepływ.</li>
	<li>Powtórz ten krok z 200 μl buforu do przemywania DNA moczu.</li>
	<li>Przenieść kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNaz/RNaz.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość buforu elucji DNA (w oparciu o testy molekularne, które należy wykonać) bezpośrednio na matrycę kolumny i pozostawić na 3-5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W przykładowych przypadkach użyto 30 μl buforu elucyjnego. Jeśli wymagane są dodatkowe badania, stosuje się więcej buforu elucyjnego.</li>
	<li>Wirować przy ≥16 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby uzyskać bezkomórkowe DNA.</li>
</ol>

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

<ol><li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+vitreoretinal+lymphoma%3A+a+report+from+an+International+Primary+Central+Nervous+System+Lymphoma+Collaborative+Group+symposium%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium.</a> Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).</li>
<li>Sagoo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+intraocular+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Primary intraocular lymphomas.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).</li>
<li>Coupland, S. E., Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+intraocular+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Understanding intraocular lymphomas.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).</li>
<li>Cassoux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+and+central+nervous+system+lymphoma%3A+clinical+features+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunology+and+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).</li>
<li>Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+masquerade+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic masquerade syndrome.</a> Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).</li>
<li>Carbonell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+the+diagnosis+of+vitreoretinal+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunology+and+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).</li>
<li>Demirci, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+humor-derived+MYD88+L265P+mutation+analysis+in+vitreoretinal+lymphoma%3A+a+potential+less+invasive+method+for+diagnosis+and+treatment+response+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+Retina%22%5BJournal%5D)">Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment.</a> Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).</li>
<li>Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrectomy%3A+a+pars+plana+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+-+American+Academy+of+Ophthalmology+and+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Vitrectomy: a pars plana approach.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).</li>
<li>Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reticulum+cell+sarcoma+of+the+retina+and+uvea.+Report+of+sex+cases+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature.</a> American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).</li>
<li>Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+intraocular+lymphoma+study+group.+clinical+features+and+diagnostic+significance+of+the+intraocular+fluid+of+217+patients+with+intraocular+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).</li>
<li>Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+testing+of+vitrectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic testing of vitrectomy specimens.</a> American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).</li>
<li>Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+intraocular+lymphoma+%28ocular+reticulum+cell+sarcoma%29+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management.</a> Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).</li>
<li>Tanaka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+accurate+diagnosis+of+vitreoretinal+lymphoma+using+a+combination+of+diagnostic+test+results%3A+a+prospective+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunology+and+Inflammation%22%5BJournal%5D)">More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).</li>
<li>Missotten, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometric+immunophenotyping+is+a+valuable+tool+for+detection+of+intraocular+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma.</a> Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).</li>
<li>Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+large+B-cell+lymphomas.+Flow+cytometric+pitfalls+and+pathologic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation.</a> American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).</li>
<li>Bonzheim, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+primary+and+secondary+vitreoretinal+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma.</a> Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+the+high+prevalence+of+MYD88+L265P+mutated+vitreoretinal+lymphoma+identified+by+droplet+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunology+and+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).</li>
<li>Bustamante, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+tracking+through+driver+mutations+as+a+liquid+biopsy-based+marker+for+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) jest agresywnym chłoniakiem z dużych komórek B 1,2,3, którego objawy mogą naśladować inne choroby witreoretinalne 4,5. Badania molekularne ciała szklistego, a ostatnio także cieczy wodnistej, stały się kluczową metodą diagnozy VRL lub jej wykluczenia. Jednak płyny te mają bardzo małą objętość i często mają niską komórkowość. Wiele komórek w tych płynach może również ulec uszkodzeniu podczas zbierania, przechowywania i przetwarzania 13,14,15. W rezultacie plony DNA z tych próbek są często niskie. Ponadto komórki z tych płynów muszą być współdzielone z innymi metodami diagnostycznymi, w tym cytopatologią i cytometrią przepływową. Bezkomórkowe DNA (cfDNA) w tych płynach stanowi kolejne źródło DNA, które nie wymaga nienaruszonych komórek.
Protokół ten oddziela komórkowe i bezkomórkowe składniki płynu szklistego lub wodnego. Płyn szklisty rozcieńcza się PBS, aby umożliwić pipetowanie ze względu na jego lepkość. Płyn wodny jest traktowany w celu zapewnienia maksymalnego odzysku tego płynu o bardzo małej objętości.
Porównanie wydajności DNA tych dwóch składników pokazuje, że ze składnika bezkomórkowego można uzyskać znaczne dodatkowe kwasy nukleinowe. Testy molekularne cfDNA, takie jak PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu MYD88 L265P, pokazują, że VRL można wykryć w bezkomórkowym komponencie ciała szklistego i wodnistego, a także w komponencie komórkowym. W wielu przypadkach względna ilość VRL jest wyższa w komponencie bezkomórkowym niż w komponencie komórkowym (ryc. 1).
Ekstrakcja bezkomórkowego składnika płynu szklistego i wodnego umożliwia ocenę molekularną składnika tych płynów, który w przeciwnym razie zostałby wyrzucony. Ponieważ VRL jest reprezentowany w komponentach komórkowych i bezkomórkowych, DNA komórkowe i cfDNA można połączyć, aby zmaksymalizować dostępne DNA z tych ograniczonych próbek. Alternatywnie, bezkomórkowy składnik tych płynów może być używany do testów molekularnych, a składnik komórkowy może być używany do testów, które wymagają nienaruszonych komórek, tj. cytopatologii i cytometrii przepływowej. Takie podejście pozwoliłoby uniknąć przydzielania oddzielnych podwielokrotności tych płynów do każdego testu, co mogłoby zagrozić czułości każdego testu pod kątem wykrywania VRL. Biorąc pod uwagę sukces tej metody w próbkach szklistych i wodnych, metoda ta może być również przydatna w innych ograniczonych płynach w celu zwiększenia ilości DNA dostępnego do badań molekularnych.

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) jest agresywnym chłoniakiem związanym z pierwotnym chłoniakiem rozlanym z dużych komórek B ośrodkowego układu nerwowego1,2,3. VRL jest zazwyczaj śmiertelny ze względu na jego udział w ośrodkowym układzie nerwowym1,2. Chociaż rzadko1,4, VRL często objawia się objawami podobnymi do zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka i innych chorób szklistkowo-siatkówkowych4,5. W związku z tym pacjenci wykazujący objawy zapalenia błony naczyniowej oka wymagają diagnozy w celu potwierdzenia lub wykluczenia VRL.
Niedawno opublikowano kryteria konsensusu dotyczące diagnozowania VRL, które obejmują połączenie badania klinicznego i wyników laboratoryjnych6. Próbki powszechnie używane do diagnozowania VRL obejmują ciało szkliste, a ostatnio ciecz wodnistą7. Ciało szkliste uzyskuje się za pomocą zabiegu chirurgicznego zwanego witrektomią pars plana, który umożliwia dostęp do tylnego odcinka oka8.
W prezentowanym protokole, zarówno próbki cieczy wodnistej, jak i ciała szklistego zostały pobrane do ekstrakcji komórkowej i cfDNA. Po znieczuleniu pacjentów i umieszczeniu trokarów w odległości około 4 mm od rąbka rogówki, uzyskano próbkę cieczy wodnistej o objętości około 100-200 μl za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml w rąbku rogówki. U pacjentów z pseudofakią nierozcieńczone ciało szkliste otrzymywano poprzez wprowadzenie do naparu sterylnego powietrza, umożliwiającego pobranie większej ilości nierozcieńczonego ciała szklistego (do 3,5 ml). U pacjentów z fakijami usunięto około 500 do 1000 μl nierozcieńczonego ciała szklistego przed włączeniem naparu ze zrównoważonym roztworem soli. W niektórych przypadkach wtórnie rozcieńczone ciało szkliste (500 do 2 000 μl) pobrano poprzez zamianę naparu na płyn i umieszczenie witrektora w osłonie ciała szklistego w celu uzyskania tej próbki. Najbardziej rozcieńczoną frakcję ciała szklistego pobrano poprzez zakonserwowanie worka kasetowego (rysunek uzupełniający 1) pod koniec operacji. Gdy ten worek dotarł do oddziału patologii, rozcieńczone ciało szkliste uzyskano z spuszczenia płynu z tego worka do stożkowych probówek w celu późniejszej ekstrakcji DNA.
Cytopatologia płynu szklistego jest często uważana za złoty standard9. Jednak kilka badań wykazało ograniczoną czułość ze względu na przetwarzanie i minimalną komórkowość10,11,12. Cytometria przepływowa może pomóc w identyfikacji klonalnych komórek B, ale może być również ograniczona przez niską komórkowość i kruchość dużych komórek chłoniaka13,14,15. Zarówno cytopatologia, jak i cytometria przepływowa wymagają nienaruszonych całych komórek. Wiele z tych komórek ulega zniszczeniu podczas pobierania, przechowywania i przetwarzania. Kiedy testy molekularne są wykonywane przy użyciu DNA wyekstrahowanego z nienaruszonych komórek (DNA komórkowe), cierpi na to samo ograniczenie. Ponadto podzielenie ograniczonej próbki ciała szklistego do wszystkich tych testów zmniejsza ilość materiału dostępnego dla każdego testu.
Bezkomórkowe DNA (cfDNA) stanowi kolejne źródło DNA, które nie wymaga nienaruszonych komórek. cfDNA z próbek ciała szklistego zostało użyte do wykrywania VRL16,17 oraz czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej18. W tym protokole komórkowe i bezkomórkowe DNA jest ekstrahowane z płynu szklistego i wodnego w celu wykrycia VRL.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol (Izopropanol)</td><td>Fischer</td><td>A415-500</td><td></td></tr><tr><td>DNA Czysty & Koncentrator-10</td><td>Zymo Research</td><td>D4011</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Roztwór do lizy komórek</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Roztwór do hydratacji DNA</td><td>Qiagen</td><td>158916</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Roztwór do wytrącania białek</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P-4417</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Zestaw do moczu</td><td>Zymo Research</td><td>D3061</td><td>Bufor kondycjonujący; zawiera również kulki czyszczące, proteinazę K i kolumny wirowe</td></tr><tr><td>Ultraczysty glikogen, 20 i mikro; g/&mikro; L (20 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher/Invitrogen</td><td>10814010</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa ekstrakcja dna z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) reprezentuje agresywnego chłoniaka, często klasyfikowanego jako pierwotny chłoniak rozlany z dużych komórek B ośrodkowego układu nerwowego. Aby zdiagnozować VRL, pobiera się próbki, takie jak ciecz ciała szklistego, a ostatnio ciecz wodnista. Testy diagnostyczne w kierunku VRL na tych próbkach obejmują cytologię, cytometrię przepływową i testy molekularne. Jednak zarówno cytopatologia, jak i cytometria przepływowa, wraz z badaniami molekularnymi z wykorzystaniem DNA komórkowego, wymagają nienaruszonych całych komórek. Wyzwanie polega na tym, że ciało szkliste i wodnista zazwyczaj mają niską komórkowość, a wiele komórek ulega zniszczeniu podczas pobierania, przechowywania i przetwarzania. Co więcej, próbki te stwarzają dodatkowe trudności w testach molekularnych ze względu na wysoką lepkość ciała szklistego i małą objętość zarówno ciała szklistego, jak i cieczy wodnistej. W badaniu tym zaproponowano metodę ekstrakcji bezkomórkowego DNA z próbek szklistych i wodnych. Podejście to uzupełnia ekstrakcję DNA komórkowego lub pozwala na wykorzystanie składnika komórkowego tych próbek do innych metod diagnostycznych, w tym cytologii i cytometrii przepływowej.

Opisane metody ekstrakcji przeprowadzono na ograniczonej liczbie przypadków, aby zapewnić odpowiednią wydajność i możliwość amplifikacji wolnego DNA (cfDNA) w porównaniu z DNA komórkowym z próbek ciała szklistego (cztery) i cieczy wodnistej (cztery). W tych próbkach wydajność DNA z komponentu wolnego tych płynów jest zbliżona do wydajności komponentu komórkowego (Tabela 1). DNA komórkowe oraz cfDNA z tych próbek oceniono również za pomocą testów molekularnych, np. w kierunku mutacji MYD88 L265P związanej z VRL. Alelowo specyficzna reakcja PCR w czasie rzeczywistym dla MYD88 L265P (Rycina 1) ilustruje detekcję tej mutacji związanej z VRL zarówno w DNA komórkowym, jak i w cfDNA. W tym przykładzie obciążenie chorobowe wydaje się być wyższe w komponencie wolnym, co obrazuje niższy próg cyklu (Ct). Dane te pokazują, że cfDNA wyekstrahowany z ciała szklistego i cieczy wodnistej za pomocą tej metody stanowi źródło DNA, które może być również wykorzystane w diagnostycznych testach molekularnych.
<img alt="Wykres amplifikacji PCR; Delta Rn vs Cykl; wolne od komórek vs komórkowe, porównawcza analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65708/65708fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu L265P genu MYD88. Reprezentatywny wykres amplifikacji przedstawiający PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu L265P genu MYD88 dla DNA komórkowego i wolnego od komórek (każda reakcja PCR przeprowadzona w duplikacie). Próg dla cyklu progowego (Ct) jest zaznaczony zieloną linią. Oznaczono punkty, w których amplifikacja cfDNA (ślady niebieski i brązowy) oraz DNA komórkowego (ślady czerwony i zielony) – każda przeprowadzona w duplikacie – osiąga próg. Fluorescencja tła występuje w pobliżu 1.00e-003. Wyższe obciążenie mutacyjne występuje w komponencie wolnym od komórek, co wykazano poprzez niższą wartość Ct. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65708/65708fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Komórkowy</td>
			<td>Bezkomórkowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciało szkliste 1</td>
			<td>130.5</td>
			<td>67.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciało szkliste 2</td>
			<td>337.5</td>
			<td>105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciało szkliste 3</td>
			<td>150</td>
			<td>168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciało szkliste 4</td>
			<td>1816</td>
			<td>654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór wodny 1</td>
			<td>58.5</td>
			<td>40.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodny 2</td>
			<td>153</td>
			<td>225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodny 3</td>
			<td>117</td>
			<td>454.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór wodny 4</td>
			<td>TL</td>
			<td>27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wydajność ekstrakcji DNA komórkowego i wolnokomórkowego. Wydajność DNA (w ng) dla czterech nierozcieńczonych próbek ciała szklistego i czterech próbek cieczy wodnistej (przedniej komory oka) od czterech różnych osób na podstawie fluorometrycznego oznaczania ilości DNA. TL = zbyt niska ilość do oznaczania. 
Rycina dodatkowa 1: Worek kasetki do ciała szklistego. Przykład worka kasetki do ciała szklistego zawierającego rozcieńczony płyn ciała szklistego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65708/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Procedura ekstrakcji bezkomórkowego DNA z ciała szklistego i cieczy wodnistej w celu przeprowadzenia badań molekularnych w celu diagnozowania chłoniaka szklistego jest tutaj. Metoda ta daje możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNA ze składnika komórkowego próbki lub zarezerwowania go do badań pomocniczych.

Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...

W ramach tych badań próbujemy wykorzystać testy molekularne ciała szklistego pobranego z oka za pomocą witrektomii w celu zdiagnozowania chłoniaka witreoretinalnego lub VRL, który jest agresywną chorobą, której objawy pokrywają się z objawami powszechnych stanów zapalnych oczu. Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne to obecnie stosowane metody diagnozowania VRL. Opublikowana czułość metod niemolekularnych wynosi od 44 do 90% dla cytopatologii i od 50 do 60% dla cytometrii przepływowej.Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne z komórkowym DNA wymagają nienaruszonych komórek nowotworowych. Stanowi to problem w próbkach ciała szklistego, ponieważ objętość i komórkowość tych próbek jest niska, a komórki mogą ulec degradacji przez apoptozę, a także pobieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek. Odkryliśmy, że bezkomórkowe DNA wyekstrahowane z próbek płynu szklistego stanowi kolejne źródło DNA z testów molekularnych, które nie wymagają nienaruszonych komórek, a także wykazują dowody na VRL i mogą być wykorzystane do zdiagnozowania tego chłoniaka.Bezkomórkowa ekstrakcja DNA oferuje badania molekularne bez nienaruszonych komórek nowotworowych. Pozwala to na maksymalizację użyteczności próbek ciała szklistego, ponieważ nienaruszone komórki mogą być zarezerwowane do cytopatologii i cytometrii przepływowej, przy jednoczesnym wykorzystaniu pozostałego płynu supernatantowego, który w przeciwnym razie zostałby odrzucony do badań molekularnych. Na początek rozcieńczyć lepki płyn szklisty trzema do pięciu mililitrami PBS, aby ułatwić pipetowanie.Spuść rozcieńczony płyn szklisty otrzymany w torbie kasetowej do 50-mililitrowych probówek. W przypadku cieczy wodnistej o małej objętości przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie przepłucz oryginalną probówkę wirówkową o pojemności 500 mikrolitrów równą objętością PBS. Dodaj roztwór płuczący do 1,5 mililitrowej probówki.Na koniec odwirować płyn szklisty o sile 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odpipetować supernatant do nowej probówki, nie naruszając przy tym osadu komórkowego. Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA, należy najpierw dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek do osadu komórkowego uzyskanego z humoru komórkowego.Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie go wymieszać. Gdy komórki zostaną całkowicie zalone, dodaj roztwór osadu białkowego do uzupełnienia 1/3 całkowitej objętości. Teraz wiruj i energicznie mieszaj przez 20 do 30 sekund.Następnie wiruj przez trzy minuty w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. W międzyczasie wszyscy przenieś 300 mikrolitrów izopropanolu do czystej probówki do mikrowirówki. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odpipetować supernatant do probówki zawierającej izopropanol.Następnie dodaj 1,5 mikrolitra glikogenu do probówki i odwróć probówkę, aby dokładnie wymieszać. Umieść probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce na godzinę lub na noc, aby ułatwić wytrącanie się DNA. Po zamrożeniu odwirować probówkę po pięciu minutach w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej.Następnie odpipetować izopropanol. Aby umyć granulkę, dodaj 0,5 mililitra 70% etanolu. Delikatnie odwróć rurkę, aby zapewnić równomierne pranie.Następnie wirować probówkę przez minutę w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Teraz odwróć rurkę na czystej gazie, aby spuścić roztwór i wysuszyć granulkę.Po szybkim odwirowaniu w mikrowirówce użyj jednorazowej końcówki do pipety z cienką końcówką, aby odpipetować pozostałą kroplę etanolu. Następnie dodaj 45 mikrolitrów roztworu hydratującego DNA do wysuszonego osadu DNA. Następnie umieść rurkę w bloku grzewczym ustawionym na 50 stopni Celsjusza.Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.Na początek dodaj 70 mikrolitrów buforu kondycjonującego na każdy mililitr bezkomórkowej frakcji supernatantu humoru oka. Zmieszaj kulki czyszczące, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj koraliki do próbki.Następnie zwirować mieszaniny próbki i kulek. Odwirować tę mieszaninę w temperaturze 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie usuwając osadu, ekstrahować sklarowany szwadron.Następnie dodaj równą objętość buforu do trawienia moczu do osadu. Odpipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad. Teraz dodaj proteinazę K do zawieszonej mieszaniny osadów.Inkubuj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość genomowego buforu do lizy do mieszaniny wytrawiającej. Dokładnie wymieszaj roztwór, aby dobrze go wymieszać.Teraz umieść dostępną w handlu kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do przygotowania DNA moczu do kolumny wirowej. Odwirować przy 16 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.Teraz odpipetuj 700 mikrolitrów buforu do przemywania DNA moczu do kolumny i odwiruj, jak pokazano Po odrzuceniu przepływu, przenieś kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNAzy-RNAzy. Na koniec dodaj odpowiednią objętość buforu elucji DNA bezpośrednio do matrycy kolumny i pozostaw na trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować, aby uzyskać bezkomórkowe DNA.Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistkowo-siatkówkowym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.

cell-free-dna-extraction-vitreous-aqueous-humor-specimens-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Technika sekcji ilustruje proces usuwania ciała szklistego, siatkówki oraz soczewki z oka myszy, ich rozdzielenie za pomocą wirowania oraz charakterystykę z wykorzystaniem analiz białkowych.

Ewisceracja ciała szklistego i siatkówki myszy do analiz proteomicznych

Celem tego protokołu jest pokazanie skutecznej techniki izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnych wyłuszczonych oczu świń.

Sekcja całego ciała szklistego do analizy witreodynamicznej

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Króliki są powszechnie wykorzystywane do badania farmakokinetyki leków podawanych wewnątrzgałkowo. Opisano metodę prowadzenia badań farmakokinetycznych leków wewnątrzgałkowych z wykorzystaniem oczu królika.

Zastosowanie oczu królika w badaniach farmakokinetycznych leków dogałkowych

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Woda to wysokowydajna płynna biopsja w leczeniu retinoblastomy, czyli raka wewnątrzgałkowego, którego nie można pobrać in vivo ze względu na ryzyko rozprzestrzeniania się przez zewnątrzoczne. Przedstawiono tutaj metodę bezpiecznego wyodrębniania wody za pomocą przezroczystej paracentezy rogówki oraz kroki analizy genomowej w celu identyfikacji prognostycznych biomarkerów.

Humor wodny jako biopsja płynna w leczeniu retinoblastomy: przezroczysta paracenteza rogówki i analiza genomowa

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę biorepozytorium do standaryzowanego zbierania, opisywania i biobankowania wysokiej jakości ludzkich biopsji cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.

Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.

Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

Poznaj metodę ekstrakcji bezkomórkowego DNA z cieczy szklistkowej i wodnistej do diagnostyki chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego. Technika ta umożliwia precyzyjne badania molekularne bez konieczności zachowania intaktywnych komórek nowotworowych.

Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego (Wideo) | JoVE Journal

Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego

Przeglądaj więcej filmów