January 12th, 2024
Procedura ekstrakcji bezkomórkowego DNA z ciała szklistego i cieczy wodnistej w celu przeprowadzenia badań molekularnych w celu diagnozowania chłoniaka szklistego jest tutaj. Metoda ta daje możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNA ze składnika komórkowego próbki lub zarezerwowania go do badań pomocniczych.
W ramach tych badań próbujemy wykorzystać testy molekularne ciała szklistego pobranego z oka za pomocą witrektomii w celu zdiagnozowania chłoniaka witreoretinalnego lub VRL, który jest agresywną chorobą, której objawy pokrywają się z objawami powszechnych stanów zapalnych oczu. Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne to obecnie stosowane metody diagnozowania VRL. Opublikowana czułość metod niemolekularnych wynosi od 44 do 90% dla cytopatologii i od 50 do 60% dla cytometrii przepływowej.
Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne z komórkowym DNA wymagają nienaruszonych komórek nowotworowych. Stanowi to problem w próbkach ciała szklistego, ponieważ objętość i komórkowość tych próbek jest niska, a komórki mogą ulec degradacji przez apoptozę, a także pobieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek. Odkryliśmy, że bezkomórkowe DNA wyekstrahowane z próbek płynu szklistego stanowi kolejne źródło DNA z testów molekularnych, które nie wymagają nienaruszonych komórek, a także wykazują dowody na VRL i mogą być wykorzystane do zdiagnozowania tego chłoniaka.
Bezkomórkowa ekstrakcja DNA oferuje badania molekularne bez nienaruszonych komórek nowotworowych. Pozwala to na maksymalizację użyteczności próbek ciała szklistego, ponieważ nienaruszone komórki mogą być zarezerwowane do cytopatologii i cytometrii przepływowej, przy jednoczesnym wykorzystaniu pozostałego płynu supernatantowego, który w przeciwnym razie zostałby odrzucony do badań molekularnych. Na początek rozcieńczyć lepki płyn szklisty trzema do pięciu mililitrami PBS, aby ułatwić pipetowanie.
Spuść rozcieńczony płyn szklisty otrzymany w torbie kasetowej do 50-mililitrowych probówek. W przypadku cieczy wodnistej o małej objętości przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie przepłucz oryginalną probówkę wirówkową o pojemności 500 mikrolitrów równą objętością PBS. Dodaj roztwór płuczący do 1,5 mililitrowej probówki.
Na koniec odwirować płyn szklisty o sile 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odpipetować supernatant do nowej probówki, nie naruszając przy tym osadu komórkowego. Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA, należy najpierw dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek do osadu komórkowego uzyskanego z humoru komórkowego.
Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie go wymieszać. Gdy komórki zostaną całkowicie zalone, dodaj roztwór osadu białkowego do uzupełnienia 1/3 całkowitej objętości. Teraz wiruj i energicznie mieszaj przez 20 do 30 sekund.
Następnie wiruj przez trzy minuty w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. W międzyczasie wszyscy przenieś 300 mikrolitrów izopropanolu do czystej probówki do mikrowirówki. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odpipetować supernatant do probówki zawierającej izopropanol.
Następnie dodaj 1,5 mikrolitra glikogenu do probówki i odwróć probówkę, aby dokładnie wymieszać. Umieść probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce na godzinę lub na noc, aby ułatwić wytrącanie się DNA. Po zamrożeniu odwirować probówkę po pięciu minutach w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej.
Następnie odpipetować izopropanol. Aby umyć granulkę, dodaj 0,5 mililitra 70% etanolu. Delikatnie odwróć rurkę, aby zapewnić równomierne pranie.
Następnie wirować probówkę przez minutę w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Teraz odwróć rurkę na czystej gazie, aby spuścić roztwór i wysuszyć granulkę.
Po szybkim odwirowaniu w mikrowirówce użyj jednorazowej końcówki do pipety z cienką końcówką, aby odpipetować pozostałą kroplę etanolu. Następnie dodaj 45 mikrolitrów roztworu hydratującego DNA do wysuszonego osadu DNA. Następnie umieść rurkę w bloku grzewczym ustawionym na 50 stopni Celsjusza.
Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.
Na początek dodaj 70 mikrolitrów buforu kondycjonującego na każdy mililitr bezkomórkowej frakcji supernatantu humoru oka. Zmieszaj kulki czyszczące, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj koraliki do próbki.
Następnie zwirować mieszaniny próbki i kulek. Odwirować tę mieszaninę w temperaturze 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie usuwając osadu, ekstrahować sklarowany szwadron.
Następnie dodaj równą objętość buforu do trawienia moczu do osadu. Odpipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad. Teraz dodaj proteinazę K do zawieszonej mieszaniny osadów.
Inkubuj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość genomowego buforu do lizy do mieszaniny wytrawiającej. Dokładnie wymieszaj roztwór, aby dobrze go wymieszać.
Teraz umieść dostępną w handlu kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do przygotowania DNA moczu do kolumny wirowej. Odwirować przy 16 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.
Teraz odpipetuj 700 mikrolitrów buforu do przemywania DNA moczu do kolumny i odwiruj, jak pokazano Po odrzuceniu przepływu, przenieś kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNAzy-RNAzy. Na koniec dodaj odpowiednią objętość buforu elucji DNA bezpośrednio do matrycy kolumny i pozostaw na trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować, aby uzyskać bezkomórkowe DNA.
Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistkowo-siatkówkowym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.
To badanie ustanawia procedurę wyodrębniania DNA wolnego od komórek z ciała szklistego i goryczki wodnej w celu wspomagania molekularnej diagnozy chłoniaka ciała szklistego (VRL). Metoda ta pozwala na jednoczesne wyodrębnianie DNA z komponentów komórkowych lub zachowanie próbki do dalszych badań.
Cell-free DNA extraction from vitreous and aqueous humor addresses a critical bottleneck in diagnosing vitreoretinal lymphoma (VRL) where low cellularity and cell degradation limit traditional molecular and cytological assays. This method enables molecular testing without reliance on intact neoplastic cells, supporting earlier and more reliable target validation in ocular oncology pipelines. The approach enhances predictive confidence at the diagnostic inflection point, optimizing specimen utility for cross-functional R&D teams.
This cell-free DNA extraction method integrates at the diagnostic and early translational stages, bridging specimen acquisition to molecular analysis in VRL research and development.