Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego
12 stycznia 2024
Procedura ekstrakcji bezkomórkowego DNA z ciała szklistego i cieczy wodnistej w celu przeprowadzenia badań molekularnych w celu diagnozowania chłoniaka szklistego jest tutaj. Metoda ta daje możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNA ze składnika komórkowego próbki lub zarezerwowania go do badań pomocniczych.
W ramach tych badań próbujemy wykorzystać testy molekularne ciała szklistego pobranego z oka za pomocą witrektomii w celu zdiagnozowania chłoniaka witreoretinalnego lub VRL, który jest agresywną chorobą, której objawy pokrywają się z objawami powszechnych stanów zapalnych oczu. Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne to obecnie stosowane metody diagnozowania VRL. Opublikowana czułość metod niemolekularnych wynosi od 44 do 90% dla cytopatologii i od 50 do 60% dla cytometrii przepływowej.
Cytopatologia, cytometria przepływowa i badania molekularne z komórkowym DNA wymagają nienaruszonych komórek nowotworowych. Stanowi to problem w próbkach ciała szklistego, ponieważ objętość i komórkowość tych próbek jest niska, a komórki mogą ulec degradacji przez apoptozę, a także pobieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek. Odkryliśmy, że bezkomórkowe DNA wyekstrahowane z próbek płynu szklistego stanowi kolejne źródło DNA z testów molekularnych, które nie wymagają nienaruszonych komórek, a także wykazują dowody na VRL i mogą być wykorzystane do zdiagnozowania tego chłoniaka.
Bezkomórkowa ekstrakcja DNA oferuje badania molekularne bez nienaruszonych komórek nowotworowych. Pozwala to na maksymalizację użyteczności próbek ciała szklistego, ponieważ nienaruszone komórki mogą być zarezerwowane do cytopatologii i cytometrii przepływowej, przy jednoczesnym wykorzystaniu pozostałego płynu supernatantowego, który w przeciwnym razie zostałby odrzucony do badań molekularnych. Na początek rozcieńczyć lepki płyn szklisty trzema do pięciu mililitrami PBS, aby ułatwić pipetowanie.
Spuść rozcieńczony płyn szklisty otrzymany w torbie kasetowej do 50-mililitrowych probówek. W przypadku cieczy wodnistej o małej objętości przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie przepłucz oryginalną probówkę wirówkową o pojemności 500 mikrolitrów równą objętością PBS. Dodaj roztwór płuczący do 1,5 mililitrowej probówki.
Na koniec odwirować płyn szklisty o sile 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odpipetować supernatant do nowej probówki, nie naruszając przy tym osadu komórkowego. Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA, należy najpierw dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek do osadu komórkowego uzyskanego z humoru komórkowego.
Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie go wymieszać. Gdy komórki zostaną całkowicie zalone, dodaj roztwór osadu białkowego do uzupełnienia 1/3 całkowitej objętości. Teraz wiruj i energicznie mieszaj przez 20 do 30 sekund.
Następnie wiruj przez trzy minuty w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. W międzyczasie wszyscy przenieś 300 mikrolitrów izopropanolu do czystej probówki do mikrowirówki. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odpipetować supernatant do probówki zawierającej izopropanol.
Następnie dodaj 1,5 mikrolitra glikogenu do probówki i odwróć probówkę, aby dokładnie wymieszać. Umieść probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w zamrażarce na godzinę lub na noc, aby ułatwić wytrącanie się DNA. Po zamrożeniu odwirować probówkę po pięciu minutach w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej.
Następnie odpipetować izopropanol. Aby umyć granulkę, dodaj 0,5 mililitra 70% etanolu. Delikatnie odwróć rurkę, aby zapewnić równomierne pranie.
Następnie wirować probówkę przez minutę w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Teraz odwróć rurkę na czystej gazie, aby spuścić roztwór i wysuszyć granulkę.
Po szybkim odwirowaniu w mikrowirówce użyj jednorazowej końcówki do pipety z cienką końcówką, aby odpipetować pozostałą kroplę etanolu. Następnie dodaj 45 mikrolitrów roztworu hydratującego DNA do wysuszonego osadu DNA. Następnie umieść rurkę w bloku grzewczym ustawionym na 50 stopni Celsjusza.
Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.
Na początek dodaj 70 mikrolitrów buforu kondycjonującego na każdy mililitr bezkomórkowej frakcji supernatantu humoru oka. Zmieszaj kulki czyszczące, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj koraliki do próbki.
Następnie zwirować mieszaniny próbki i kulek. Odwirować tę mieszaninę w temperaturze 3 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie usuwając osadu, ekstrahować sklarowany szwadron.
Następnie dodaj równą objętość buforu do trawienia moczu do osadu. Odpipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad. Teraz dodaj proteinazę K do zawieszonej mieszaniny osadów.
Inkubuj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość genomowego buforu do lizy do mieszaniny wytrawiającej. Dokładnie wymieszaj roztwór, aby dobrze go wymieszać.
Teraz umieść dostępną w handlu kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do przygotowania DNA moczu do kolumny wirowej. Odwirować przy 16 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.
Teraz odpipetuj 700 mikrolitrów buforu do przemywania DNA moczu do kolumny i odwiruj, jak pokazano Po odrzuceniu przepływu, przenieś kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNAzy-RNAzy. Na koniec dodaj odpowiednią objętość buforu elucji DNA bezpośrednio do matrycy kolumny i pozostaw na trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować, aby uzyskać bezkomórkowe DNA.
Wydajność DNA zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych składników płynów ocznych była podobna. Przeprowadzono analizę PCR komórkowych i bezkomórkowych składników mutacji związanej z chłoniakiem szklistkowo-siatkówkowym. Wyższy wskaźnik mutacji był obecny w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy obniżony próg cyklu.
Przegląd
Niniejsze badanie ustanawia procedurę izolacji wolnokrążącego DNA z ciała szklistego oraz cieczy wodnistej w celu wsparcia diagnostyki molekularnej chłoniaka witreoretinalnego (VRL). Metoda ta umożliwia jednoczesną ekstrakcję DNA z komponentów komórkowych lub ich zachowanie do dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Okulistyka
- Biologia molekularna
- Onkologia
Wstęp
- Chłoniak witrętno-siatkówkowy (VRL) jest agresywną chorobą o objawach przypominających powszechne stany zapalne oka.
- Obecne metody diagnostyczne obejmują cytopatologię, cytometrię przepływową oraz badania molekularne, które wymagają obecności nienaruszonych komórek nowotworowych.
- Próbki ciała szklistego często charakteryzują się niską komórkowością i zdegradowanymi komórkami, co utrudnia diagnozę.
- Wolnokrążące DNA (cfDNA) stanowi alternatywne źródło do badań molekularnych bez konieczności wykorzystania nienaruszonych komórek.
Cel badania
- Opracowanie metody izolacji wolnego DNA z ciała szklistego w celu diagnostyki VRL.
- Poprawa dokładności diagnostycznej poprzez wykorzystanie DNA, które nie wymaga obecności nienaruszonych komórek.
- Zapewnienie niezawodnego podejścia do testów molekularnych w diagnostyce VRL.
Zastosowane metody
- Izolacja wolnego DNA (cfDNA) z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej.
- Porównanie wyników testów molekularnych z tradycyjnymi metodami diagnostycznymi.
- Ocena obecności VRL poprzez analizę molekularną wyizolowanego DNA.
- Ocena skuteczności nowej metody izolacji.
Główne wyniki
- Wolnokomórkowe DNA wyekstrahowane z próbek ciała szklistego wykazuje obecność VRL.
- Nowa metoda stanowi realną alternatywę dla badań molekularnych w próbkach o niskiej komórkowości.
- Wyniki wskazują na poprawę możliwości diagnostycznych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Badanie wykazuje potencjał wykorzystania wolnokomórkowego DNA w diagnostyce agresywnych chorób oczu.
Wnioski
- Ustanowiona procedura ekstrakcji wolnego od komórek DNA jest skuteczna w diagnostyce VRL.
- Metoda ta zwiększa możliwość prowadzenia badań molekularnych bez konieczności użycia nienaruszonych komórek.
- Przyszłe badania mogą dodatkowo potwierdzić użyteczność wolnego od komórek DNA w warunkach klinicznych do diagnostyki VRL.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ekstrakcja wolnokrążącego DNA (cfDNA) z ciała szklistego i cieczy wodnistej rozwiązuje krytyczny problem w diagnostyce chłoniaka witreoretinalnego (VRL), w którym niska komórkowość i degradacja komórek ograniczają możliwości tradycyjnych analiz molekularnych i cytologicznych. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie testów molekularnych bez konieczności polegania na nienaruszonych komórkach nowotworowych, co wspiera wcześniejszą i bardziej wiarygodną walidację celów w procesach onkologii okulistycznej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w kluczowym momencie diagnostycznym, optymalizując użyteczność próbek dla interdyscyplinarnych zespołów badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia molekularną analizę mutacji związanych z VRL w próbkach o niskiej komórkowości.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów w sytuacjach, gdy nienaruszone komórki są niedostępne lub zdegradowane.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wykrywaniu biomarkerów specyficznych dla danej choroby w onkologii okulistycznej.
- Ułatwia triage portfolio poprzez maksymalizację uzysku diagnostycznego z ograniczonych próbek klinicznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane próbki DNA do dalszych analiz molekularnych i analizy mutacji.
- Standaryzuje przetwarzanie próbek w celu poprawy powtarzalności i wyników ilościowych.
- Umożliwia skalowalne procesy pracy dla rzadkich lub niskowolumenowych próbek okulistycznych.
- Wspiera wiarygodną ocenę markerów molekularnych w trudnych matrycach próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki molekularne z wolnego DNA z biomarkerami istotnymi dla VRL.
- Zapewnia ciągłość od etapu diagnostycznego odkrycia do przedklinicznej walidacji w modelach chłoniaka oka.
- Redukuje ryzyko biologiczne poprzez umożliwienie wiarygodnej detekcji mutacji w materiale nieoptymalnym.
- Wspiera badania translacyjne dzięki wykorzystaniu frakcji supernatantu, które w przeciwnym razie zostałyby odrzucone.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda ekstrakcji wolnego DNA (cfDNA) integruje etapy diagnostyczne i wczesne etapy translacyjne, łącząc pobieranie próbek z analizą molekularną w badaniach i rozwoju VRL.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w chłoniaku oka poprzez umożliwienie analizy mutacji bez konieczności posiadania nienaruszonych komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy DNA z próbek o niskiej objętości i niskiej komórkowości, zapewniając powtarzalność testów molekularnych.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowej PCR oraz progi detekcji mutacji do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia spójność biomarkerów i ciągłość od materiału klinicznego do walidacji modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia protokół wielokrotnego użytku w celu maksymalizacji wydajności diagnostycznej z ograniczonych lub zdegradowanych próbek oka.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w diagnostyce VRL.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ekstrakcję DNA z trudnych próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go) poprzez maksymalizację danych molekularnych z każdej próbki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów onkologii oka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w ekstrakcji molekularnej oraz w pracy z lepkimi próbkami o małej objętości.
- Wymaga dostępu do wirówki, urządzeń do PCR oraz aparatury do kwantyfikacji DNA.
- Wymaga standaryzacji procesów przetwarzania próbek i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Można dostosować zarówno do ciała szklistego, jak i cieczy wodnistej, jednak inne matryce mogą wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczony przez objętość materiału oraz potencjalną zmienność wydajności DNA pomiędzy próbkami.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
Separation of Cellular and Cell‐Free Fractions of the Vitreous and Aqueous Humor for DNA Extraction
2:18
Extraction and Analysis of DNA from the Cellular Component of the Eye Humor
4:22
Cell‐Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor
