Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

W naszym zespole badaliśmy mechanizmy komórkowe i molekularne rządzące rozwojem i naprawą mięśni. W rzeczywistości wiadomo, że specjalna dystrybucja cząsteczek mRNA reguluje różne procesy komórkowe. A tutaj używamy Drosophila jako modelu do zbadania, w jaki sposób mRNA jest przestrzennie rozmieszczone w tkance mięśniowej lotu.

Udowodniono, że dynamika ekspresji genów reguluje różne procesy biologiczne mięśni. Pojawienie się wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder umożliwiło kompleksowe zbadanie dynamiki transkrypcji. Jednym z istotnych ograniczeń klasycznych technik omicznych jest niezdolność do zapewnienia przestrzennego rozmieszczenia cząsteczek mRNA we włóknach mięśniowych Drosophila.

Cechę tę można zbadać za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ pojedynczej cząsteczki. Obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i rozkładu przestrzennego w syncytii mięśniowej Drosophila. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę wykrywania i ilościowego oznaczania poszczególnych cząsteczek mRNA we włóknach mięśniowych Drosophila z wysoką rozdzielczością procentową i skalami pojedynczych cząsteczek.

Aktualnym wyzwaniem w tej dziedzinie jest wizualizacja dynamiki regeneracji mięśni w czasie rzeczywistym i u żywych zwierząt. Dlatego staramy się opracować podejście do obrazowania na żywo, aby zobrazować zachowanie komórek macierzystych mięśni w ich naturalnym środowisku, a także odpowiedzieć na pytanie o ich tryb i zakres migracji, na przykład podczas regeneracji mięśni, a także ich różnicowanie, i to z niespotykaną dotąd rozdzielczością. Na początek opłucz larwy Drosophila w stadium L3 trzykrotnie przez pięć minut każda w zimnym PBS.

Za pomocą dwóch par ostrych kleszczy przytrzymaj przednią część larwy i usuń około 2/3 tkanek ciała. Przytrzymaj pierwszą 1/3 larwy jedną parą kleszczy i haczykami do ust drugą parą. Następnie schuj haczyki gębowe wewnątrz larwy, aż larwa zostanie całkowicie odwrócona.

Usuń krążki międzykręgowe nóg i mózg, aby uzyskać czystą, odwróconą tuszę larwalną z parą krążków skrzydeł przymocowanych do tchawicy. Przenieś tarcze skrzydełkowe do jednomililitrowej probówki wirówkowej. Utrwalić krążki skrzydełkowe w 4% paraformaldehydzie rozcieńczonym w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.

Po utrwaleniu próbki należy przemywać trzykrotnie przez pięć minut każda, 70% etanolem. Usuń głowy, brzuchy, nogi i skrzydła ze znieczulonych much i umieść wypreparowane klatki piersiowe w zimnym PBS. Umieść klatki piersiowe w 4% paraformaldehydzie rozcieńczonym w 1% trytonie przez 20 minut pod mieszaniem.

Następnie przemyć próbki trzykrotnie przez pięć minut każda, używając PBT pod mieszaniem. Umieść klatkę piersiową na dwustronnej taśmie na szklanym szkiełku podstawowym i przetnij je na pół za pomocą ostrego ostrza mikrotomowego, aby uzyskać dwie półkrwi. Utrwal półwody w 4% paraformaldehydzie przez 45 minut pod mieszaniem.

Przemyć próbki dwukrotnie przez 20 minut każda, używając PBT pod mieszaniem. Umieść półkrwi w zimnym PBS i użyj kleszczy, aby ostrożnie odizolować pośrednie mięśnie lotu od półkrwi. Przepuszczalność mięśni w 70% etanolu przez dwa do siedmiu dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po przepuszczalności przemyj IFM dwukrotnie przez 20 minut każdy za pomocą buforu A. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego i wstępnie hybrydyzuj mięśnie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w mieszalniku termicznym. Dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę i przeciwciało pierwszorzędowe. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin przy 300 obr./min w mieszalniku termicznym.

Po inkubacji przemyć próbki trzykrotnie, używając ciepłego buforu A przez 10 minut każda. Następnie inkubować próbki w przeciwciałie drugorzędowym i DAPI rozcieńczonym w buforze A w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przemyć próbki trzykrotnie buforem B przez 20 minut każda przed przeniesieniem ich na szkiełko mikroskopowe.

Zetrzyj resztki buforu B i dodaj 30 mikrolitrów podłoża montażowego na szkiełko. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na szkiełku podstawowym i uszczelnij je lakierem do paznokci. Po włączeniu mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy olejkowe 40x i 63x, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.

Aby zobrazować mięśnie progenitorowe związane z dyskiem skrzydła i mięśnie lotu pośredniego (IFM), ustaw DAPI ze wzbudzeniem 405 i emisją 450 nanometrów. Następnie wybierz Alexa Fluor 488 o wzbudzeniu 496 i emisji 519 nanometrów oraz Quasar 670 dla sond smFISH o wzbudzeniu 647 i emisji 670 nanometrów. Zlokalizuj próbkę za pomocą sygnału DAPI i lampy UV.

Zapisz przechwycone obrazy jako pliki TIF. Aby zobrazować dorosłe komórki macierzyste mięśni, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji dla DAPI i Alexa Fluor 88, jak pokazano wcześniej. Następnie ustaw długości fal dla Alexa Fluor 555 i Quasar 670 dla sond smFISH.

Zlokalizuj próbkę i zapisz przechwycone obrazy jako TIF. Uruchom ImageJ i przejdź do menu Wtyczki. Wybierz pozycję Makra, a następnie pozycję Edytuj, aby otworzyć kod źródłowy makr.

Aby określić ilościowo plamki Mef2 smFISH u larw, ustaw promień logarytmu na trzy, a jakość kłód na 20. Następnie segmentować jądra Mef2-dodatnie z rozmyciem dwóch, parametrem skali jądra 30, progiem jądra 8 i rozmiarem jądra 300. Zainicjuj makro, wykonując polecenie uruchom.

Makro automatycznie załaduje wszystkie obrazy z wyznaczonego folderu i sekwencyjnie określi je ilościowo. We włóknach mięśniowych ustaw promień logarytmu na 2,5, jakość logarytmu na 60, rozmycie na dwa, parametr skali jądra na 100, próg jądra na zero, a rozmiar jądra na 300. Zainicjuj makro, wykonując polecenie uruchom.

Makro automatycznie załaduje wszystkie obrazy z wyznaczonego folderu i sekwencyjnie określi je ilościowo. Po analizie sprawdź wyniki wyświetlane w pliku FISH_results i pliku nuclei_results. Transkrypty Mef2 i zfh1 zostały jednolicie wykryte w populacji AMP i kolokalizowane odpowiednio z białkami Mef2 i zfh1.

Większe powiększenie AMP rozróżniało ogniska miejsc transkrypcyjnych i dojrzałe mRNA rozproszone w cytoplazmie. Podobnie zbadano miejsce transkrypcji i dystrybucję mRNA Mef2 i zfh1 w zróżnicowanych dorosłych IFM i powiązanych komórkach macierzystych. Zbudowane przez nas makro ImageJ skutecznie wykrywało i segmentowało plamki Mef2 i jądra mięśniowe.

Analiza ilościowa mRNA Mef2 na jądra w dorosłych IFM i AMP nie różniła się istotnie. Kwantyfikacja rozkładu plamki Mef2 wykazała, że 92% mRNA Mef2 jest obecne w cytoplazmie, a 8% jest związanych z jądrami mięśniowymi.