Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit
9 lutego 2024
Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.
Naszym celem badawczym jest stworzenie metody hodowli struktur 3D z wykorzystaniem komórek jelitowych zwierząt podobnych do ludzi, a konkretnie psów. Morfogeneza komórek jelitowych została w dużej mierze zbadana za pomocą laboratoryjnych modeli zwierzęcych, które są kosztowne, czasochłonne i nie odzwierciedlają dokładnie procesów rozwojowych człowieka. Co więcej, konwencjonalne statyczne modele hodowli komórkowych 2D nie są w stanie naśladować złożonej organizacji przestrzennej architektury 3D abSerial.
Osiągnięcie przyłączenia pojedynczych komórek pochodzących z organoidów jelitowych do powierzchni PDMS pokrytej ECM stanowiło poważne wyzwanie. Jest to kluczowy krok w kierunku sprostania temu wyzwaniu, zarówno poprzez zapewnienie jednolitej powłoki ECM poprzez aktywację powierzchni, jak i umożliwienie jej wyschnięcia przez noc. Integracja technologii organoidów psów pochodzących od pacjentów z morfogenezą 3D in vitro oferuje obiecującą drogę do prowadzenia badań translacyjnych nad przewlekłymi chorobami wieloczynnikowymi, zgodnie z inicjatywą One Health.
Protokół IBD u psów, Gut-on-a-Chip, oferuje powtarzalny model dla medycyny porównawczej, umożliwiając badania nad morfogenezą jelit, interakcjami gospodarz-mikrobiom, infekcjami, badaniami przesiewowymi leków i probiotyków oraz ma zastosowanie międzygatunkowe. Na początek umieść urządzenie Gut-on-a-Chip w suchym piekarniku ustawionym na 60 stopni Celsjusza na 30 minut, aby wyeliminować wilgoć. Następnie za pomocą generatora ozonu UV należy wystawić urządzenie na działanie promieniowania UV i ozonu przez 60 minut.
Zabezpiecz rurki wlotowe, obejściowe i wylotowe górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów. Clamp rurkę doprowadzającą do dolnego mikrokanału, a następnie odłącz rurkę wylotową dolnego mikrokanału. Upewnij się, że rurka obejściowa dolnego mikrokanału pozostaje otwarta.
Za pomocą mikropipety P100 dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu polietylenoiminy przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału. Podłącz ponownie rurkę wylotową dolnego mikrokanału. Zabezpiecz obejście wlotowe i rurkę wylotową dolnego mikrokanału, a następnie rurkę wlotową górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów.
Teraz odłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału, upewniając się, że rurka obejściowa pozostaje otwarta. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu polietylenoiminy przez otwór wylotowy górnego mikrokanału. Ponownie podłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału i pozwól urządzeniu inkubować go w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Powtórz procedurę z 0,1% aldehydem glutarowym, a następnie z wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar roztworu aktywującego powierzchnię, wysusz frytek przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku. Następnego dnia wyjmij frytki z piekarnika i pozwól mu ostygnąć w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 10 minut. Zabezpiecz rurki wlotowe, obejściowe i wylotowe górnego mikrokanału, w tym rurkę wlotową dolnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów.
Odłącz rurkę wylotową dolnego mikrokanału. Dodaj 20 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej lub mieszaniny ECM przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału. Następnie ponownie zamocuj rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
Zabezpiecz rurki wlotowe, obejściowe i wylotowe dolnego mikrokanału, w tym rurkę wlotową górnego mikrokanału, za pomocą zacisków do segregatorów. Po odłączeniu rurki wylotowej górnego mikrokanału, dodaj 20 mikrolitrów mieszaniny VCM przez otwór wylotowy górnego mikrokanału. Ponownie zamocuj rurkę wylotową górnego mikrokanału, a następnie wyjmij zacisk spinacza z rurki wylotowej dolnego kanału, upewniając się, że obie rurki wylotowe są otwarte.
Umieść chip w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Na początek przygotuj organoidową pożywkę hodowlaną zawierającą 10 mikromolowych Y-27632 i 2,5 mikromolowych CHIR99021. Po nałożeniu ECM na Gut-on-a-Chip, odłącz rurkę wylotową od górnego mikrokanału, pozostawiając otwartą rurkę obejściową górnego mikrokanału.
Za pomocą spinacza do segregatora zabezpiecz zarówno wlot, jak i wylot dolnego mikrokanału. Za pomocą mikropipety P100 dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do otworu wylotowego górnego mikrokanału. Zabezpiecz rurkę obejściową i wlotową górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów.
Ponownie przymocuj rurkę wylotową do otworu wylotowego górnego mikrokanału, upewniając się, że rurka pozostaje otwarta przez cały proces. Po zakończeniu stopniowo zabezpiecz rurkę wylotową górnego mikrokanału za pomocą spinacza do segregatora Następnie pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są równomiernie rozmieszczone w górnym mikrokanaliku. Umieść urządzenie Gut-on-a-Chip w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Podłączyć strzykawkę podłączoną do górnego mikrokanalika chipa do pompy strzykawkowej umieszczonej w inkubatorze. Ustaw natężenie przepływu na 30 mikrolitrów na godzinę i rozpocznij ciągły przepływ medium osadzającego dla górnego mikrokanału. W tym okresie należy pozostawić dolny mikrokanał zaciśnięty.
Dzień po wysiewie należy zastąpić pożywkę organoidową pożywką zawierającą tylko A8301. Po ustaleniu monowarstwy dla górnego mikrokanału, zainicjuj ciągły przepływ medium osadzającego do dolnego mikrokanału. Następnie wprowadź pożywkę do hodowli organoidów zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, aby zainicjować rozwój trójwymiarowej morfogenezy w chipie.
Zwiększ natężenie przepływu do 50 mikrolitrów na godzinę, aby osiągnąć czysty stres 0,02 obiadu na centymetr kwadratowy w konstrukcji Gut-on-a-Chip. Korzystając z bioreaktora regulowanego komputerowo, zastosuj 10% cykliczne odkształcenie i częstotliwość 0,15 Hz do komórek hodowanych na urządzeniu Gut-on-a-Chip przez dwa do trzech dni, aby ustalić trójwymiarową morfogenezę. Po sześciu do dziewięciu dniach średniego przepływu zaobserwowano sporadyczne grupowanie trójwymiarowej morfogenezy komórek nabłonka jelitowego psów w całym mikrokanale.
Barwienie immunofluorescencyjne pozwoliło ocenić trójwymiarową strukturę monowarstw pochodzących z organoidów i struktur przypominających kosmki w chipach mikroprzepływowych. Funkcja bariery jelitowej mierzona za pomocą teer wykazała stabilne wartości teer w piątym dniu hodowli.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na integracji psich organoidów jelitowych z mikrofluidycznym systemem Gut-on-a-Chip, zapewniając odpowiedni model dla ludzkich chorób jelit. Opracowane protokoły ułatwiają morfogenezę 3D oraz dynamiczne modelowanie jelit in vitro, przyczyniając się do rozwoju metod leczenia chorób jelit zarówno u psów, jak i u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna porównawcza
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Morfogeneza komórkowa jelit jest kluczowa dla zrozumienia zdrowia układu pokarmowego.
- Tradycyjne modele często nie oddają precyzyjnie procesów zachodzących u ludzi.
- Modele psie stanowią bliższe przybliżenie chorób jelit u ludzi.
- Inicjatywa One Health podkreśla współzależność zdrowia ludzi i zwierząt.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego modelu do badania morfogenezy jelit.
- Zbadanie interakcji między gospodarzem a mikrobiomem oraz ich wpływu na zdrowie.
- Ułatwienie przesiewowych badań leków i probiotyków w kontekście porównawczym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie urządzenia Gut-on-a-Chip z powłoką ECM.
- Wsiewanie psich organoidów jelitowych do układu mikrofluidycznego.
- Zastosowanie ciągłego przepływu i cyklicznego rozciągania w celu odwzorowania warunków fizjologicznych.
- Barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny struktury 3D i funkcji barierowej.
Główne wyniki
- Skuteczne ustanowienie morfogenezy 3D w systemie mikrofluidycznym.
- Obserwacja struktur przypominających kosmki oraz funkcjonalnych barier jelitowych.
- Wykazany potencjał do prowadzenia badań porównawczych nad chorobami jelit.
- Walidacja modelu na potrzeby przyszłych badań translacyjnych.
Wnioski
- Model Gut-on-a-Chip jest obiecującym narzędziem do badania zdrowia jelit.
- Integracja organoidów psich zwiększa istotność uzyskanych wyników.
- Podejście to jest zgodne z perspektywą One Health, przynosząc korzyści zarówno dla zdrowia ludzi, jak i zwierząt.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja psich organoidów jelitowych z mikrofluidycznymi systemami Gut-on-a-Chip umożliwia tworzenie fizjologicznie istotnych, dynamicznych modeli in vitro do badań nad chorobami jelit. Podejście to niweluje ograniczenia tradycyjnych modeli statycznych oraz modeli zwierzęcych, zapewniając platformę do predykcyjnych badań translacyjnych zarówno w kontekście weterynaryjnym, jak i ludzkim. Powstałe modele wspierają pozyskiwanie wiedzy międzygatunkowej, usprawniając walidację celów terapeutycznych i zmniejszając ryzyko na wczesnym etapie odkrywania leków na schorzenia jelit.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków istotnych dla przebiegu choroby z wykorzystaniem pierwotnych komórek pobranych od psów z przypadkami samoistnej IBD.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez odtworzenie 3D morfogenezy jelit oraz funkcji barierowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej obserwacji interakcji między nabłonkiem a mikrobiomem gospodarza.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do przesiewania leków i probiotyków w dynamicznym środowisku jelitowym.
- Dostarcza danych ilościowych, takich jak pomiary TEER, służących do oceny integralności bariery.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do skalowalnej oceny związków oraz porównań międzygatunkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami w zakresie biomarkerów translacyjnych poprzez modelowanie spontanicznego przebiegu choroby w ramach koncepcji One Health.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem fizjologicznie relewantnych modeli psich.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, łącząc badania nad chorobami jelit u zwierząt i ludzi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół Gut-on-a-Chip sytuuje się na styku wczesnego etapu odkrywania, identyfikacji związków wiodących oraz badań przedklinicznych w ramach programów dotyczących chorób jelit.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Screening: Potwierdza gotowość i powtarzalność testów dla analiz funkcjonalnych oraz analiz barierowych.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów, takich jak TEER oraz immunofluorescencyjna analiza strukturalna.
- Badania translacyjne: Zapewnia międzygatunkową platformę do dopasowania biomarkerów i badań porównawczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku system mikrofluidyczny, który można dostosować do różnych modeli chorób jelit.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelowaniu chorób jelit.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy dla testów opartych na organoidach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapeutyków jelitowych w ujęciu międzygatunkowym.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli organoidów, mikrofluidyki oraz pracy z tkankami psimi.
- Wymagany jest dostęp do powłok ECM, instrumentarium mikrofluidycznego oraz infrastruktury do pomiarów TEER.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności powlekania ECM i wysiewu komórek.
- Adaptacja do innych gatunków lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują wyzwania techniczne w zakresie jednorodnego przylegania komórek oraz utrzymania morfogenezy 3D.
