Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy
12 stycznia 2024
Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.
Moje badania koncentrują się na mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej jako nowym podejściu do leczenia, związanym lub nie związanym z innymi terapiami, w celu poprawy stanu zapalnego w kilku chorobach. Wykazaliśmy, że stosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w połączeniu z prazykwantelem znacząco kontrolowało odczyn ziarniniakowy w zakażeniu Schistosoma mansoni, podkreślając korzyści płynące z tego skojarzonego podejścia do leczenia. Nasz protokół zajmuje się luką badawczą w skrupulatnym pobieraniu tkanki tłuszczowej najądrza w warunkach aseptycznych, szczegółowym przetwarzaniu fizycznym obejmującym energiczne potrząsanie i określa optymalny czas na wykorzystanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.
Nasz protokół oferuje znaczące korzyści, w szczególności dużą dostępność i potencjalną prostą izolację mezenchymalnych komórek macierzystych. Ponadto mezenchymalne komórki macierzyste mają silne właściwości terapeutyczne, w tym przeciwzapalne i generujące tkanki. Na początek umieść uśpioną mysz na tablicy korkowej brzuszną stroną skierowaną do góry.
Za pomocą pęsety podnieś ogoloną skórę na środku brzucha i wykonaj nacięcie sterylnymi nożyczkami. Rozetnij skórę, aby oderwać ją od otrzewnej. Następnie podnieś warstwę otrzewnej i przetnij ją.
Dzięki nowemu zestawowi sterylnych pęset i nożyczek delikatnie chwyć, unieś i przetnij całą tkankę tłuszczową naskórka znajdującą się nad jądrami. Umieść wycięty tłuszcz w 50-mililitrowej sterylnej stożkowej probówce zawierającej podłoże podstawowe na lodzie. Następnie umyj tkankę najądrza PBS.
Za pomocą sterylnej pęsety przenieś tkankę tłuszczową najądrza do probówki zawierającej od 15 do 20 mililitrów roztworu trawiącego. Pokrój tkankę na fragmenty sterylnymi nożyczkami. Następnie inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Rozcieńczyć próbkę w równej objętości podłoża podstawowego w celu dezaktywacji kolagenazy. Odwirować zawiesinę o sile 250 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża podstawowego.
Następnie zasiej studzienkę sześciodołkowej płytki zawierającej trzy mililitry podłoża podstawowego z izolowanymi komórkami. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj trzy mililitry podłoża podstawowego do komórek przemytych PBS.
Komórki wyekstrahowane z tkanki tłuszczowej wykazywały zgodność morfologii mezenchymalnych komórek macierzystych. Aby przeprowadzić funkcjonalną charakterystykę mysich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej poprzez różnicowanie osteogenne, należy najpierw odłączyć komórki za pomocą trypsyny EDTA. Zbierz trypsynizowane komórki do stożkowej probówki.
Następnie zasiej komórki w dołkach sześciodołkowej płytki z podłożem podstawowym. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenku węgla. Po 24 godzinach zastąp pożywkę pożywką osteogenną.
Następnie wybarwić komórki barwnikiem von Kossa, aby ocenić zmineralizowane guzki. Przemyć komórki dwa razy PBS po zassaniu pożywki. Utrwal komórki w dwóch mililitrach 70% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj dwa mililitry 5% roztworu azotanu srebra do studzienek. Po umyciu komórek wodą destylowaną inkubować komórki w dwóch mililitrach 5% tiosiarczanu sodu przez pięć minut. Przeciwbarwić umyte komórki dwoma mililitrami eozyny przez 40 sekund.
Po zmyciu plamy umieść płytkę pod mikroskopem optycznym, aby zobaczyć wybarwione komórki. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej wykazywały wielomoc różnicowania się w osteoblasty, adipoblasty i chondroblasty. Barwienie von Kossy wykazało obecność zmineralizowanych guzków, charakterystycznych dla osteoblastów.
Komórki adipogenne wykazały obecność wakuoli lipidowych w cytoplazmie komórek macierzystych, podczas gdy barwienie Alcian Blue ujawniło obecność glikozaminoglikanu w macierzy zewnątrzkomórkowej.
Przegląd
To badanie koncentruje się na ekstrakcji, hodowli i charakterystyce komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs) z tkanki tłuszczowej epidydymalnej szwajcarskich myszy. Wyniki podkreślają potencjał ADSCs jako narzędzia terapeutycznego, szczególnie w zarządzaniu stanami zapalnymi związanymi z chorobami takimi jak infekcja Schistosoma mansoni.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Komórki macierzyste mezenchymalne pochodzenia tłuszczowego
- Kontrola stanów zapalnych
- Zastosowania terapeutyczne w infekcji
Tło
- Duży potencjał tkanki tłuszczowej jako źródła komórek macierzystych
- Reprezentuje obfite i łatwo dostępne źródło
- Definiuje protokół dokładnego pobierania i przetwarzania
Stosowane metody
- Izolacja i hodowlą ADSCs
- Szwajcarskie myszy jako model biologiczny
- Techniki charakteryzacji obejmujące barwienie i ocenę morfologiczną
Główne wyniki
- Wykazane potencjały różnicowania ADSCs w wielu liniach komórkowych
- Skuteczna kontrola reakcji ziarniniakowych w infekcji Schistosoma mansoni
- Charakterystyka potwierdziła morfologię i potencjał ADSCs
Wnioski
- To badanie zapewnia niezawodny protokół ekstrakcji i charakteryzacji ADSCs
- Podkreśla terapeutyczne perspektywy ADSCs w chorobach zapalnych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and expansion of mesenchymal stem cells (MSCs) from mouse epididymal adipose tissue enables robust preclinical modeling for cell-based therapy development. This protocol supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for immunomodulatory and regenerative medicine portfolios. The approach enhances predictive confidence in translational research by providing a standardized source of multipotent cells for functional characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of MSC immunomodulatory mechanisms in disease-relevant models.
- Supports biological de-risking by confirming multipotency and lineage differentiation.
- Facilitates functional target validation for cell-based therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of MSCs for assay standardization and downstream screening.
- Enables quantitative assessment of differentiation via lineage-specific staining and flow cytometry.
- Supports scalable expansion for high-throughput compound evaluation in cell-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant preclinical models for inflammation and tissue regeneration studies.
- Ensures continuity from in vitro characterization to in vivo functional validation.
- Reduces translational risk by enabling cross-platform comparison of MSC properties.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification in cell therapy research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven testing of MSC immunomodulatory and regenerative functions.
- Screening: Delivers standardized, multipotent cells for reproducible assay development and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative readouts through flow cytometry and lineage-specific staining for robust data comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo models for risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for generating MSCs across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell therapy research.
- Operational Value: Standardizes MSC isolation and expansion for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic tissue handling and cell culture techniques.
- Needs access to flow cytometry and staining infrastructure for phenotypic characterization.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell isolation and expansion.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or tissue sources.
- Functional outputs depend on rigorous differentiation and characterization protocols.
