Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Moje badania koncentrują się na mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej jako nowym podejściu do leczenia, związanym lub nie związanym z innymi terapiami, w celu poprawy stanu zapalnego w kilku chorobach. Wykazaliśmy, że stosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w połączeniu z prazykwantelem znacząco kontrolowało odczyn ziarniniakowy w zakażeniu Schistosoma mansoni, podkreślając korzyści płynące z tego skojarzonego podejścia do leczenia. Nasz protokół zajmuje się luką badawczą w skrupulatnym pobieraniu tkanki tłuszczowej najądrza w warunkach aseptycznych, szczegółowym przetwarzaniu fizycznym obejmującym energiczne potrząsanie i określa optymalny czas na wykorzystanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Nasz protokół oferuje znaczące korzyści, w szczególności dużą dostępność i potencjalną prostą izolację mezenchymalnych komórek macierzystych. Ponadto mezenchymalne komórki macierzyste mają silne właściwości terapeutyczne, w tym przeciwzapalne i generujące tkanki. Na początek umieść uśpioną mysz na tablicy korkowej brzuszną stroną skierowaną do góry.

Za pomocą pęsety podnieś ogoloną skórę na środku brzucha i wykonaj nacięcie sterylnymi nożyczkami. Rozetnij skórę, aby oderwać ją od otrzewnej. Następnie podnieś warstwę otrzewnej i przetnij ją.

Dzięki nowemu zestawowi sterylnych pęset i nożyczek delikatnie chwyć, unieś i przetnij całą tkankę tłuszczową naskórka znajdującą się nad jądrami. Umieść wycięty tłuszcz w 50-mililitrowej sterylnej stożkowej probówce zawierającej podłoże podstawowe na lodzie. Następnie umyj tkankę najądrza PBS.

Za pomocą sterylnej pęsety przenieś tkankę tłuszczową najądrza do probówki zawierającej od 15 do 20 mililitrów roztworu trawiącego. Pokrój tkankę na fragmenty sterylnymi nożyczkami. Następnie inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Rozcieńczyć próbkę w równej objętości podłoża podstawowego w celu dezaktywacji kolagenazy. Odwirować zawiesinę o sile 250 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża podstawowego.

Następnie zasiej studzienkę sześciodołkowej płytki zawierającej trzy mililitry podłoża podstawowego z izolowanymi komórkami. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj trzy mililitry podłoża podstawowego do komórek przemytych PBS.

Komórki wyekstrahowane z tkanki tłuszczowej wykazywały zgodność morfologii mezenchymalnych komórek macierzystych. Aby przeprowadzić funkcjonalną charakterystykę mysich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej poprzez różnicowanie osteogenne, należy najpierw odłączyć komórki za pomocą trypsyny EDTA. Zbierz trypsynizowane komórki do stożkowej probówki.

Następnie zasiej komórki w dołkach sześciodołkowej płytki z podłożem podstawowym. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenku węgla. Po 24 godzinach zastąp pożywkę pożywką osteogenną.

Następnie wybarwić komórki barwnikiem von Kossa, aby ocenić zmineralizowane guzki. Przemyć komórki dwa razy PBS po zassaniu pożywki. Utrwal komórki w dwóch mililitrach 70% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj dwa mililitry 5% roztworu azotanu srebra do studzienek. Po umyciu komórek wodą destylowaną inkubować komórki w dwóch mililitrach 5% tiosiarczanu sodu przez pięć minut. Przeciwbarwić umyte komórki dwoma mililitrami eozyny przez 40 sekund.

Po zmyciu plamy umieść płytkę pod mikroskopem optycznym, aby zobaczyć wybarwione komórki. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej wykazywały wielomoc różnicowania się w osteoblasty, adipoblasty i chondroblasty. Barwienie von Kossy wykazało obecność zmineralizowanych guzków, charakterystycznych dla osteoblastów.

Komórki adipogenne wykazały obecność wakuoli lipidowych w cytoplazmie komórek macierzystych, podczas gdy barwienie Alcian Blue ujawniło obecność glikozaminoglikanu w macierzy zewnątrzkomórkowej.