Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
20 października 2023
Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.
Za pomocą tej metody chcemy opisać procedurę, która jest odpowiednia do krioprezerwacji PBMC w taki sposób, aby po rozmrożeniu parametry bioenergetyczne pozostały niezmienione. Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych związanych z krioprezerwacją jest to, że proces zamrażania i rozmrażania może uszkodzić PBMC, co wpływa na następujące pomiary bioenergetyczne. W naszym protokole staramy się pokazać sposób na niezawodne zachowanie PBMC bez uszkodzenia komórek, tak aby nie miało to wpływu na mierzone parametry bioenergetyczne.
Możliwość zachowania PBMC pozwala na pobieranie próbek z różnych ośrodków i pomiary w jednym miejscu. Sprawia również, że pomiar jest bardziej niezależny od czasu. Kriokonserwacja PBMC pozwala na jednoczesne prowadzenie badań w wielu miejscach, w których komórki są zbierane i konserwowane.
Pobrane próbki mogą być następnie mierzone centralnie. Usprawnia to proces i planowanie badań. Na początek dodaj osiem mililitrów DPBS do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Do tego dodaj osiem mililitrów krwi i użyj trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura, aby dobrze wymieszać zawartość. Dodaj 15 mililitrów pożywki do izolacji limfocytów do innej stożkowej probówki. Przechyl rurkę o 20 do 30 stopni.
Następnie za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura delikatnie nałożyć pierwszą warstwę mieszanki DPBS krwi na podłoże izolacyjne. Pozostałą mieszaninę ostrożnie ułóż na bocznej ściance tuby. Powoli ustaw probówkę w pozycji pionowej, aby nałożyć pozostałą krew na warstwę krwi.
Odwirować probówkę o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w wahadłowym wiadrze przy wyłączonych hamulcach. Mieszanina krwi i PBMC rozdzieli się na cztery odrębne warstwy. Za pomocą pipety Pasteura usuń 2/3 warstwy osocza, a następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zebrać PBMC.
Przenieś PBMC do nowej 50-mililitrowej tuby, aż cała warstwa zostanie zebrana. Następnie uzupełnij objętość do 25 mililitrów za pomocą DPBS, aby usunąć resztki pożywki izolacyjnej i inne pozostałości. Odwirować probówkę o sile 100 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z włączonymi hamulcami.
Następnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej. Następnie ponownie zawieś granulat w jednomililitrowym DPBS i dodaj więcej DPBS, aby uzupełnić objętość do 25 mililitrów, aby umyć i ponownie zawiesić granulkę. Schłodzić pojemnik do zamrażania do czterech stopni Celsjusza.
Następnie umieść płodową surowicę bydlęcą na lodzie. Zawiesić osad komórkowy zawierający wyizolowane PBMC w jednym mililitrze płodowej surowicy bydlęcej. Następnie wymieszaj DMSO ze schłodzonym serum na lodzie w proporcji 1:5.
Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowych oznakowanych probówek kriogenicznych, używając jednej probówki na probówkę zbiorczą. Dzięki automatycznemu licznikowi komórek określ liczbę komórek i żywotność. Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby wrzucić jeden mililitr mieszaniny DMSO/FBS do probówki.
Następnie umieść probówki we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieść pojemnik w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia wyjmij probówki z zamrażarki i przechowuj je w fazie gazowej ciekłego azotu.
Liczba komórek i żywotność były spójne przed i po krioprezerwacji, co wskazuje na udaną izolację i konserwację.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia standaryzowaną metodę przygotowania i krioprezerwacji komórek krwi obwodowej jednojądrzastych (PBMC). Protokół ma na celu utrzymanie parametrów bioenergetycznych po rozmrożeniu, zapewniając wiarygodne pomiary w badaniach nad funkcją układu odpornościowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Bioenergetyka
Tło
- PBMC są kluczowe dla analizy funkcji i zaburzeń układu odpornościowego.
- Krioprezerwacja pozwala na niezależną od czasu analizę próbek.
- Mrożenie i rozmrażanie mogą uszkodzić komórki, wpływając na wyniki eksperymentów.
- Standaryzowane metody poprawiają powtarzalność badań.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu krioprezerwacji dla PBMC.
- Zabezpieczenie, że parametry bioenergetyczne pozostaną niezmienione po rozmrożeniu.
- Ułatwienie badań wieloośrodkowych poprzez zachowanie próbek na późniejszą analizę.
Zastosowane metody
- Standaryzowane przygotowanie PBMC z krwi pełnej.
- Kontrolowane techniki krioprezerwacji.
- Ocena parametrów bioenergetycznych po rozmrożeniu.
- Porównanie wyników z różnych miejsc pobierania próbek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie zachowuje PBMC bez ich uszkodzenia.
- Pomiar bioenergetyczny pozostaje spójny po rozmrożeniu.
- Próbki mogą być pobieranie z różnych lokalizacji i analizowane razem.
Wnioski
- Wiarygodna krioprezerwacja PBMC poprawia zdolności badawcze.
- Standaryzowane metody poprawiają jakość badań nad funkcją układu odpornościowego.
- To podejście wspiera współpracę badawczą w wielu ośrodkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and bioenergetic evaluation of PBMCs enable consistent, multi-site sample collection and centralized analysis, addressing logistical and temporal challenges in translational research. This approach supports high-confidence mitochondrial function assessment, critical for metabolic disease and aging studies. Standardized PBMC workflows enhance predictive value and portfolio decision-making in early discovery and biomarker research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of mitochondrial function in minimally invasive human samples.
- Supports biological de-risking by ensuring bioenergetic parameters remain stable post-cryopreservation.
- Facilitates predictive confidence in target validation for metabolic and age-related disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated PBMC preparations for reproducible downstream bioenergetic assays.
- Ensures assay standardization and comparability across fresh and cryopreserved samples.
- Enables scalable, multi-center sample collection for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns PBMC-based bioenergetic measurements with disease-relevant translational biomarkers.
- Maintains continuity from clinical sample collection to preclinical mitochondrial function analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by minimizing sample variability.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through translational research, enabling centralized analysis of PBMC mitochondrial function from multi-site clinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in human-derived samples.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative bioenergetic outputs for assay development.
- Analytics: Provides consistent measurements of cell viability, ATP levels, and respiratory chain activity.
- Translational Research: Bridges clinical sample collection with preclinical bioenergetic evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable PBMC cryopreservation protocol for diverse studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of PBMC workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling centralized, high-quality data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and aging-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PBMC isolation, cryopreservation, and bioenergetic analysis.
- Needs access to cell counters, controlled-rate freezers, and analytical platforms for mitochondrial function.
- Demands cross-site standardization of sample handling and storage protocols.
- Adaptation may be needed for different blood volumes or disease cohorts.
- Comparability between fresh and cryopreserved samples must be routinely verified.
