Name: Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Poznaj metodę kriokonserwacji ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z zachowaniem parametrów bioenergetycznych. Standardizowany protokół umożliwia niezawodne przechowywanie próbek do badań immunologicznych w wielu ośrodkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować zespołowi klinicznemu Szpitala Uniwersyteckiego Giessen-Marburg za pobranie krwi. Praca ta została sfinansowana przez uniwersytet Justusa Liebiga.

PBMC Collection and Cryostorage for Mitochondrial Bioenergetics Analysis

<ol><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cognitive+impairment%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).</li>
<li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+aging+and+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging.</a> Biology. 8 (2), 48(2019).</li>
<li>Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleiveland%2C+CR+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health.+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).</li>
<li>Silaidos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-associated+differences+in+mitochondrial+function+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMCs%29+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Sex+Differ%22%5BJournal%5D)">Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain.</a> Biol Sex Differ. 9 (1), 34(2018).</li>
<li>Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+human+samples+for+assessment+of+mitochondrial+bioenergetics%3A+Gold+standards%2C+limitations%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives.</a> Life. 11 (9), 949(2021).</li>
<li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroMol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of aging.</a> NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).</li>
<li>Migliore, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+the+role+and+the+most+suitable+biomarkers+of+oxidative+stress+in+Alzheimer%27s+disease+and+in+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).</li>
<li>Leutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+trophic+support+enhances+apoptosis+in+PC12+cells+expressing+Alzheimer%E2%80%99s+APP+mutation+and+sensitizes+cells+to+staurosporine-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death.</a> J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Leuner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%3A+Focus+on+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes.</a> Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).</li>
<li>Leuner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+apoptosis%2C+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+lymphocytes+as+potential+biomarkers+for+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+Suppl%22%5BJournal%5D)">Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease.</a> J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).</li>
<li>Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Indoleamine+2%2C3-Dioxygenase+production+and+its+association+to+inflammatory+cytokines+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+culture+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tryptophan+Res%22%5BJournal%5D)">Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus.</a> Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236(2020).</li>
<li>Cortez-Espinosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD39+expression+on+Treg+and+Th17+cells+is+associated+with+metabolic+factors+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes.</a> Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).</li>
<li>Mahmoud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Diabetea+tea+%E2%84%A2+consumption+on+inflammatory+cytokines+and+metabolic+biomarkers+in+type+2+diabetes+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients.</a> J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).</li>
<li>Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+modulation+of+immune+function+by+%CE%B2-glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Dietary modulation of immune function by β-glucans.</a> Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).</li>
<li>Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+lymphocyte+activation+marker+expression+and+cytokine+secretion+profile+in+stimulated+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%3A+an+in+vitro+model+to+monitor+cellular+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function.</a> J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).</li>
<li>Otaegui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+micro+RNA+expression+in+PBMC+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients.</a> PLoS One. 4 (7), e6309(2009).</li>
<li>Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+complex+interplay+between+T+cell+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function.</a> Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).</li>
<li>Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuel+feeds+function%3A+energy+metabolism+and+the+T-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response.</a> Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+dysfunctions+of+blood+mononuclear+cells+link+with+cardiac+disturbance+in+patients+with+early-stage+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure.</a> Sci Rep. 5, 10229(2015).</li>
<li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+pediatric+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock.</a> Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).</li>
<li>Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+global+transplant+laboratory+standard+operating+procedures+for+blood+collection%2C+PBMC+isolation%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage.</a> Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function+in+permeabilized+and+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells.</a> J Vis Exp. (120), e54985(2017).</li>
<li>Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%E2%80%99s+disease%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 30(2020).</li>
<li>Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases of the brain.</a> Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten zapewnia sposób izolacji i kriokonserwacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej w sposób odpowiedni do analiz bioenergetycznych. Opisana metoda daje możliwość delikatnego izolowania PBMC w dużych ilościach, o wysokiej żywotności i wystarczającej liczbie komórek do pomiarów bioenergetycznych. Ma to tę wadę, że nawet przy minimalnych przerwach dochodzi do długich izolacji, ale późniejsza kriokonserwacja pozwala na niezależny od czasu pomiar bioenergetyki. Dzięki tej metodzie próbki mo...

Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs) są używane do różnych zastosowań w wielu dziedzinach nauki, w tym do badania zagadnień immunologicznych i bioenergetycznych, takich jak te związane z procesami starzenia lub chorobami zwyrodnieniowymi1,2. PBMC mają niejednorodny skład i składają się z limfocytów (limfocytów B, limfocytów T i komórek NK), monocytów i komórek dendrytycznych. Komórki czasami wykazują duże indywidualne różnice i różnice w obrębie badanego, dlatego wymagane są ustandaryzowane procedury postępowania z tymi komórkami. Ważne parametry, takie jak żywotność i czystość izolacji, są podstawowymi wymaganiami dotyczącymi obchodzenia się z nią i dodatkowo wpływają na nie czynniki środowiskowe, takie jak czas pobrania, poziom melatoniny, to, czy badany jest na czczo i inne3,4.
Na podstawie badań nad bioenergetyką PBMC, opisujemy tutaj metodę izolacji, krioprezerwacji i hodowli PBMC, która jest odpowiednia również dla innych metod. Podczas gdy biopsja mięśni jest uważana za złoty standard metabolizmu energii mitochondrialnej5, badanie komórek krwi jest szybką, minimalnie inwazyjną procedurą. Ponadto coraz więcej badań sugeruje, że zmiany w funkcji mitochondriów w procesie starzenia się i choroby Alzheimera (AD) zachodzą nie tylko w mózgu, ale także na peryferiach6,7,8,9,10. Metoda ta pozwala również na badanie innych schorzeń i chorób, w tym cukrzycy i otyłości11,12,13. Można analizować wzorce ekspresji genów u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym lub funkcję immunologiczną i ogólnie na nią wpływy14,15,16.
PBMCs zazwyczaj polegają na fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w celu wytworzenia trifosforanu adenozyny (ATP)17,18. W związku z tym PBMC obejmują szeroki zakres zastosowań jako substytuty. W poprzednich raportach metabolizm energetyczny PBMC był wykorzystywany do rozwiązywania dysfunkcji narządów, takich jak wczesna niewydolność serca19, wstrząs septyczny20 lub różnice związane z płcią4 w funkcji mitochondriów. Uogólniona metoda krioprezerwacji, izolacji i hodowli PBMC miałaby zalety w zakresie porównywalności wyników uzyskanych w różnych instytutach. Istnieje wiele różnic w protokołach dla każdego kroku21,22, celem tej metody jest zapewnienie wytycznych dla pomiarów bioenergetycznych w PBMC.
W tym artykule opisujemy metodę pomiaru parametrów bioenergetycznych w PBMCs. Wyjaśniamy metody izolacji, kriokonserwacji i pomiaru bioenergetyki PBMC z ludzkiej krwi. Metoda ta może być stosowana do określania parametrów bioenergetycznych u pacjentów i oceny ich w kontekście klinicznym. Aby zastosować te pomiary, naukowcy potrzebują dostępu do populacji pacjentów, od której można pobrać świeże próbki krwi.

<table><tbody><tr><td>0,1 M bufor trietanoloamino-HCl (pH = 8,0)</td><td>Przygotowany</td> <td>samodzielnie-0,5</td><td></td></tr> <tr><td>M bufor trietanoloaminy-HCl</td><td>Przygotowany</td> <td>samodzielnie-1,0</td><td></td></tr> <tr><td>M bufor tris-HCl (pH = 8,1)</td><td>Przygotowany</td> <td>samodzielnie-1,01</td><td></td></tr> <tr><td>mM DTBB</td><td>Przygotowany</td> <td>samodzielnie-10</td><td></td></tr> <tr><td>% Triton X-100</td><td>Przygotowany</td> <td>samodzielnie-10</td><td></td></tr> <tr><td>mM szczawiacetat</td><td>Przygotowanie</td> <td>własne-14</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; 20 G sterylnych igieł do pobierania krwi Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly</td><td>Sarstedt</td><td>156353_v</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG-70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% Etanol (EtOH)</td><td></td><td>Samodzielnie</td> przygotowany-Acetylo-CoA <td></td></tr><tr><td></td><td>Aplikacja do trzustki</td><td>A3753</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki nasączone alkoholem</td><td></td><td></td><td>&nbsp;( 70% alkohol izopropylowy)</td></tr><tr><td>Antimycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Aqua (bidest.)</td><td>Z MilliQ Academic (własnej roboty)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6016949</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll Roztwór seperacyjny</td><td>Biochrom</td><td>6115</td><td></td></tr><tr><td>Biologiczny szafa bezpieczeństwa MSC Advantage Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbonylocyjanid-p-trifluorometoksy-fenylohydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Wirówka Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16 R</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube Cryo.S</td><td>Grainer Bio-One</td><td>126263-2DG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37008</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksydek (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>102952</td><td></td></tr><tr><td>Spray</td><td></td><td></td><td></td>do dezynfekcji</tr><tr><td>Rękawiczki jednorazowe lateksowe, guma lub winyl.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dyslikty (12,5 ml) DistriTips</td><td>Gilson</td><td>F164150</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS; 10x)</td><td>Gibco (Thermo Scientific)</td><td>15217168</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH 100%)</td><td>Carl ROTH GmbH & Co. KG</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Frezer (-80&deg; C)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt/adapter&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Midi 40 CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka iniekcyjna</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>MIR05</td><td>Samodzielnie przygotowany-Mr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Mroźny pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>10110051</tr><tr><td>Czytnik wielofunkcyjny CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lokalizator zbiorników azotu 6 plus</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Szczawiooctan</td><td>Sigma-Aldrich-Oxygraph-2k</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Orobororus Instrumenty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Wydajność Pipetor 10 &mu; L, 100 &mu; L, 1000 &mu; L</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)</td><td>Gibco (Thermo Scientific)</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl ROTH GmbH & Co. KG</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylofenylendiamina (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Opaska uciskowa / Mankiet</td><td></td><td></td><td></td>do pomiaru ciśnienia krwi</tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108382</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Biochrom</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Vaccubrand GmbH & Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViewPlate-96</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005181</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna WNB22</td><td>Memmert GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

Fizjologiczne funkcje komórek eukariotycznych opierają się głównie na energii dostarczanej głównie przez mitochondria. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z chorobami metabolicznymi i starzeniem się. Fosforylacja oksydacyjna odgrywa decydującą rolę, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy energetycznej. PBMC zostały zidentyfikowane jako minimalnie inwazyjna próbka do pomiaru funkcji mitochondriów i wykazano, że odzwierciedlają stany chorobowe. Jednak pomiar funkcji bioenergetycznych mitochondriów może być ograniczony przez kilka czynników w próbkach ludzkich. Ograniczeniami są ilość pobranych próbek, czas pobierania próbek, który często jest rozłożony na kilka dni, oraz lokalizacje. Kriokonserwacja pobranych próbek może zapewnić spójne pobieranie i pomiar próbek. Należy dołożyć starań, aby mierzone parametry były porównywalne między kriokonserwowanymi a świeżo przygotowanymi komórkami. Tutaj opisujemy metody izolowania i kriokonserwacji PBMC z próbek ludzkiej krwi w celu analizy bioenergetycznej funkcji mitochondriów w tych komórkach. Kriokonserwacja PBMC zgodnie z opisanym tutaj protokołem wykazuje jedynie niewielkie różnice w liczbie komórek i żywotności, poziomie trifosforanu adenozyny i zmierzonej aktywności łańcucha oddechowego w porównaniu ze świeżo pobranymi komórkami. Do opisanych preparatów potrzeba tylko 8-24 ml krwi ludzkiej, dzięki czemu możliwe jest wieloośrodkowe pobieranie próbek podczas badań klinicznych i określenie ich bioenergetyki na miejscu.

Żywotność i liczba komórek 
Aby uzyskać pomyślną izolację i kriokonserwację, liczba oraz żywotność komórek powinny być jak najwyższe. Przed i po kriokonserwacji komórki są przeliczane, a ich żywotność jest określana w celu zapewnienia zdrowia i jakości komórek. Rycina 3 stanowi reprezentacyjną ilustrację PBMC przed i po kriokonserwacji, gdzie liczba i żywotność komórek prawie się nie różnią. Wskazuje to na skuteczną izolację i przechowywanie PBMC.
<p class="jove_conte...

Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...

Za pomocą tej metody chcemy opisać procedurę, która jest odpowiednia do krioprezerwacji PBMC w taki sposób, aby po rozmrożeniu parametry bioenergetyczne pozostały niezmienione. Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych związanych z krioprezerwacją jest to, że proces zamrażania i rozmrażania może uszkodzić PBMC, co wpływa na następujące pomiary bioenergetyczne. W naszym protokole staramy się pokazać sposób na niezawodne zachowanie PBMC bez uszkodzenia komórek, tak aby nie miało to wpływu na mierzone parametry bioenergetyczne.Możliwość zachowania PBMC pozwala na pobieranie próbek z różnych ośrodków i pomiary w jednym miejscu. Sprawia również, że pomiar jest bardziej niezależny od czasu. Kriokonserwacja PBMC pozwala na jednoczesne prowadzenie badań w wielu miejscach, w których komórki są zbierane i konserwowane.Pobrane próbki mogą być następnie mierzone centralnie. Usprawnia to proces i planowanie badań. Na początek dodaj osiem mililitrów DPBS do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki.Do tego dodaj osiem mililitrów krwi i użyj trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura, aby dobrze wymieszać zawartość. Dodaj 15 mililitrów pożywki do izolacji limfocytów do innej stożkowej probówki. Przechyl rurkę o 20 do 30 stopni.Następnie za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura delikatnie nałożyć pierwszą warstwę mieszanki DPBS krwi na podłoże izolacyjne. Pozostałą mieszaninę ostrożnie ułóż na bocznej ściance tuby. Powoli ustaw probówkę w pozycji pionowej, aby nałożyć pozostałą krew na warstwę krwi.Odwirować probówkę o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w wahadłowym wiadrze przy wyłączonych hamulcach. Mieszanina krwi i PBMC rozdzieli się na cztery odrębne warstwy. Za pomocą pipety Pasteura usuń 2/3 warstwy osocza, a następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zebrać PBMC.Przenieś PBMC do nowej 50-mililitrowej tuby, aż cała warstwa zostanie zebrana. Następnie uzupełnij objętość do 25 mililitrów za pomocą DPBS, aby usunąć resztki pożywki izolacyjnej i inne pozostałości. Odwirować probówkę o sile 100 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z włączonymi hamulcami.Następnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej. Następnie ponownie zawieś granulat w jednomililitrowym DPBS i dodaj więcej DPBS, aby uzupełnić objętość do 25 mililitrów, aby umyć i ponownie zawiesić granulkę. Schłodzić pojemnik do zamrażania do czterech stopni Celsjusza.Następnie umieść płodową surowicę bydlęcą na lodzie. Zawiesić osad komórkowy zawierający wyizolowane PBMC w jednym mililitrze płodowej surowicy bydlęcej. Następnie wymieszaj DMSO ze schłodzonym serum na lodzie w proporcji 1:5.Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowych oznakowanych probówek kriogenicznych, używając jednej probówki na probówkę zbiorczą. Dzięki automatycznemu licznikowi komórek określ liczbę komórek i żywotność. Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby wrzucić jeden mililitr mieszaniny DMSO/FBS do probówki.Następnie umieść probówki we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieść pojemnik w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia wyjmij probówki z zamrażarki i przechowuj je w fazie gazowej ciekłego azotu.Liczba komórek i żywotność były spójne przed i po krioprezerwacji, co wskazuje na udaną izolację i konserwację.

cryopreservation-bioenergetic-evaluation-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do testu mikrojądrowego z blokiem cytokinezy na kriokonserwowanych próbkach krwi pełnej. Ta zoptymalizowana metoda kriokonserwacji krwi pełnej do analizy mikrojądrowej jest niezawodną techniką do pobierania próbek na dużą skalę i badań wieloośrodkowych i może być również stosowana do innych testów związanych z krwią.

Test mikrojądrowy na kriokonserwowanej krwi pełnej

Ten protokół przedstawia przystępny przewodnik do zbierania, przechowywania i rozmrażania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, odpowiedni do dalszych analiz i procesów takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Zademonstrowano również kolekcje płaszczy plazmowych i buffy.

Izolacja i kriokonserwacja wysoce żywotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej: przewodnik dla początkujących

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Jama otrzewnowa u ssaków zawiera różne populacje komórek odpornościowych, które są kluczowe dla wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Do biochemicznych i funkcjonalnych analiz tych komórek niezbędna jest wydajna metoda izolacji. W niniejszej pracy przedstawiamy kompleksową metodę izolacji komórek jamy otrzewnowej u myszy.

Izolacja komórek z jamy otrzewnej myszy

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Opisano metodę ekspansji limfocytów γδ T z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Limfocyty γδ T pochodzące z PBMC są stymulowane i namnażane przy użyciu zoledronianu oraz interleukiny-2 (IL-2). Wielkoskalowa ekspansja limfocytów γδ T może zostać zastosowana w autologicznej immunoterapii komórkowej nowotworów.

Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Poznaj metodę kriokonserwacji ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z zachowaniem parametrów bioenergetycznych. Standardizowany protokół umożliwia niezawodne przechowywanie próbek do badań immunologicznych w wielu ośrodkach.

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów