Name: Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę aktywacji sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę szlaków BMP i Nodal, pomagając zrozumieć mechanizmy decyzji losu komórkowego we wczesnym rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego protokołu zostało zapewnione przez NICHD Intramural Program dla KWR (ZIA HD009002-01). Dziękujemy Jeffowi Farrellowi i jego laboratorium za pouczające opinie, Willowi Andersonowi za doskonałe wsparcie techniczne, Leanne Iannucci za testy warunków skrajnych protokołu i pomiar natężenia promieniowania, a także zakładowi NIH Shared Zebrafish za ciężką pracę nad utrzymaniem danio pręgowanego w zdrowiu.

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wstrzyknięcie mRNA jest obecną strategią dostarczania bOpto-BMP/Nodal do zarodków danio pręgowanego. Ta metoda ma kilka wad. Po pierwsze, odpowiednia ilość mRNA różni się w zależności od laboratorium. Użyta ilość powinna być wystarczająca do silnej aktywacji sygnalizacji przy ekspozycji na światło, ale bez niezamierzonej aktywacji ciemności. Dobrym pomysłem jest przetestowanie kilku ilości w celu znalezienia optymalnych poziomów mRNA, a po ustaleniu utwórz podwielokrotności mieszanki głównej, aby w powtarzalny sposób wprowadzić tę samą ilość mRNA. Po drugie, nierównomierne rozmieszczenie wstrzykniętego mRNA może prowadzić do nierównomiernej aktywacji sygnalizacji. Uważa się, że wstrzyknięcie do środka komórki (nie do żółtka) sprzyja równomiernej dystrybucji mRNA. Wreszcie, ponieważ wstrzyknięte mRNA ulega degradacji z czasem, podejście to może nie być odpowiednie do eksperymentów na starszych zarodkach. W przyszłości problemy te mogą zostać rozwiązane przez transgeniczne linie danio pręgowanego powszechnie wykazujące ekspresję bOpto-BMP/Nodal za pomocą promotora indukowanego przez matkę lub leki. Chociaż praca z potencjalnie wrażliwymi na światło dorosłymi danio pręgowanymi może być wyzwaniem w tym kontekście, udało się opracować transgeniczne danio pręgowane61,62 i Drosophila 22,34,35,63 wyposażone w narzędzia optogenetyczne.
Uniknięcie niezamierzonej fotoaktywacji jest ogólnym wyzwaniem związanym z narzędziami optogenetycznymi. Dla uproszczenia należy traktować wstrzyknięte zarodki starsze niż 1,5 hpf jako wrażliwe na światło. Niezamierzonej ekspozycji na światło można często uniknąć, po prostu owijając talerze lub naczynia folią aluminiową. Jednak w przypadku eksperymentów wymagających obserwacji wzrokowej żywych zarodków starszych niż 1,5 hpf możliwe jest użycie źródeł światła czerwonego lub pokrycie źródeł światła białego niedrogą bibułą filtracyjną w żelu, która blokuje długości fal dimeryzujących LOV (tabela materiałów).
Opisana tutaj kaseton świetlny jest przeznaczony do konkretnych zastosowań wymagających precyzyjnej kontroli nad poziomami natężenia promieniowania, dynamiką i długościami fal światła (ilustracja 2). Inne zalety tego kasetonu to równomierna ekspozycja na światło, znikome przypadkowe nagrzewanie próbki, dużo miejsca na wiele płytek 6-dołkowych oraz długowieczne, dobrze scharakteryzowane spektralnie źródła światła. Jednak w zależności od zastosowania badawczego preferowane mogą być różne strategie ekspozycji na światło. Wiele laboratoriów opracowało prostsze i bardziej opłacalne systemy jednolitej ekspozycji na światło o mniejszych rozmiarach, w tym wykładanie inkubatorów paskami LED, zawieszanie paneli LED nad próbkami lub umieszczanie diod LED w pokrywkach naczyń hodowlanych 32,38,39,40,64,65,66. Co ważne, kaseton zastosowany w tym protokole nie pozwala użytkownikom na samodzielną regulację poszczególnych studni (w przeciwieństwie do Bugaj i wsp.52) ani nie zapewnia przestrzennej kontroli nad ekspozycją na światło. Przestrzennie zlokalizowana aktywacja optogenetyczna została zademonstrowana za pomocą bOpto-BMP38 i bOpto-Nodal39 przy użyciu laserów w systemach SPIM lub konfokalnych, odpowiednio, a także została zrealizowana za pomocą wielu innych strategii optogenetycznych w różnych systemach modelowych (omówionych w Rogers i Müller12). Niektóre podejścia osiągnęły nawet subkomórkową rozdzielczość przestrzenną 29,30,31. Chociaż implementacja przestrzennie zlokalizowanych systemów ekspozycji na światło wykracza poza zakres tego protokołu, eksperymenty z aktywacją przestrzenną za pomocą bOpto-BMP/Nodal są teoretycznie możliwe przy użyciu specjalistycznego sprzętu, takiego jak cyfrowe urządzenia mikrolustrzane lub podejścia maskujące. Czytelnicy są zachęcani do zapoznania się z obszerną literaturą na temat kasetonów świetlnych DIY do eksperymentów optogenetycznych przed podjęciem decyzji o strategii ekspozycji na światło (patrz np. Gerhardt i wsp.51, Bugaj i wsp.52, Kumar i Khammash53 i więcej na https://www.optobase.org/materials/).
Molekularne strategie optogenetyczne często oferują wyższy stopień czasoprzestrzennej kontroli nad procesami biologicznymi w porównaniu z historycznymi podejściami, takimi jak mutanty, ektopowa ekspresja genów, rekombinowane białka i leki. Czytelnicy, którzy są zainteresowani korzyściami płynącymi z podejść optogenetycznych, mogą zapoznać się z innymi opublikowanymi narzędziami dostępnymi dla danio pręgowanego i innych organizmów. Należą do nich narzędzia do manipulowania dodatkowymi szlakami sygnałowymi 32,65,67,68, regulowania ekspresji genów 61,64,66,69,70,71, zmiany lokalizacji białek31,72 i aktywacji apoptozy62. Te i wiele innych narzędzi jest wygodnie skatalogowanych w OptoBase, wyselekcjonowanym zasobie internetowym dla podejść do optogenetyki molekularnej28. Dla tych, którzy zainspirowali się do stworzenia nowych narzędzi optogenetycznych, zasób zawiera również przydatne opisy białek reagujących na światło, które zostały wykorzystane w szerokim zakresie strategii, w tym białek reagujących na światło, które reagują na fale zielone, czerwone i bliskiej podczerwieni. Cieszymy się, że społeczność naukowa może w pełni wykorzystać potencjał optogenetycznych podejść molekularnych.

Szlaki sygnałowe pozwalają komórkom reagować na środowisko i koordynować działania w skali tkanek i organizmów. Sygnały kluczowe dla rozwoju embrionalnego obejmują członków nadrodziny TGF-beta białko morfogenetyczne kości (BMP) i Nodal1,2,3. Podczas embriogenezy szlaki regulowane przez te i inne sygnały kształtują plan organizmu, kontrolując ekspresję genów i dodatkowe procesy, aby zapewnić prawidłowy rozwój i interfejs różnych tkanek i narządów. Patologie, w tym wady wrodzone i nowotwory, mogą wystąpić, gdy sygnalizacja lub reakcje na sygnalizację są zaburzone4,5,6,7. Pomimo rygorystycznych badań nad sygnalizacją, wiele pozostaje do odkrycia na temat tego, jak poziomy i dynamika są dekodowane w różnych kontekstach8,9,10,11, zwłaszcza podczas rozwoju12,13,14,15,16,17,18,19.
Aby zrozumieć, jak dekodowane jest sygnalizacja, idealnym eksperymentem byłoby manipulowanie poziomami sygnalizacji, czasem i/lub dynamiką - z wysokim stopniem kontroli przestrzennej i czasowej - i ocena wyników. Na przykład, zaproponowano precyzyjne gradienty sygnalizacji przestrzennej do tworzenia wzorców rozwijających się tkanek20,21. Zmiana rozkładów przestrzennych gradientu sygnalizacji pomogłaby przetestować tę hipotezę22. Ponadto znaczenie dynamiki sygnalizacji w generowaniu różnorodnych odpowiedzi komórkowych staje się coraz jaśniejsze: ten sam szlak sygnałowy może instruować komórki, aby różnicowały się lub proliferowały w zależności od częstotliwości sygnalizacji, na przykład9,23. Paradygmaty eksperymentalne, w których można łatwo manipulować dynamiką sygnalizacji, będą cenne dla zbadania związku między dynamiką a decyzjami dotyczącymi losu komórki8,12,13,14,15.
Historycznie rzecz biorąc, wiele metod było używanych do manipulowania sygnalizacją w kontekstach rozwojowych, prowadząc do fundamentalnych odkryć1,2,3. Sygnalizacja może być zablokowana za pomocą mutantów utraty funkcji szlaku, ektopowej ekspresji inhibitora lub leków antagonistycznych. Metody aktywacji sygnalizacji obejmują leki agonistyczne, rekombinowane ligandy, ektopową ekspresję ligandów lub konstytutywnie aktywnych receptorów oraz mutanty powodujące utratę funkcji inhibitora szlaku. Metody te obejmują kontinuum kontroli eksperymentalnej. Na przykład, mutanty i ekspresja ektopowa mogą znajdować się po stronie młota kowalskiego kontinuum: przy tych podejściach dramatyczne, ogólnoustrojowe zmiany w aktywności szlaku mogą powodować przedwczesną śmierć i uniemożliwiać badania na późniejszych etapach lub z czasem mogą skutkować efektami plejotropowymi, które są trudne do rozplątania. Ponadto często trudno jest samodzielnie manipulować jedną cechą sygnalizacyjną na raz, taką jak poziom lub czas trwania. Na drugim końcu kontinuum niektóre metody oferują bardziej precyzyjną kontrolę eksperymentalną, takie jak urządzenia mikroprzepływowe, które wystawiają próbki na działanie leków lub rekombinowanych białek z kontrolą czasową, a czasem przestrzenną18,24,25, lub metody genetyczne, w tym promotory indukowane szokiem cieplnym i specyficzne tkankowo, które mogą oferować podobne korzyści16,26,27. Jednak metody te mogą być trudne do wykonania, mogą nie być odwracalne, mogą mieć stosunkowo niską kinetykę lub słabą rozdzielczość i mogą być niedostępne w niektórych systemach modelowych.
Molekularne podejścia optogenetyczne są potężnym dodatkiem do tego zestawu narzędzi. Podejścia te wykorzystują białka, które reagują na różne długości fal świetlnych, do manipulowania procesami biologicznymi, w tym sygnalizacją8,12,13,14,15, i były rozwijane przez dziesięciolecia do użytku w różnych systemach, od hodowli komórkowych po całe zwierzęta12,13,28. W porównaniu z historycznymi podejściami, optogenetyka molekularna może często oferować wyższy stopień czasoprzestrzennej kontroli nad procesami biologicznymi: Kontrolerem w systemach optogenetycznych jest światło, a kontrola długości fali, intensywności, czasu trwania i częstotliwości ekspozycji światła jest stosunkowo prosta. Dzięki zaawansowanym systemom, takim jak mikroskopy konfokalne i dwufotonowe, możliwa jest kontrola przestrzenna w zakresie subkomórkowym29,30,31. Narzędzia do optycznego manipulowania sygnalizacją zostały opracowane i zastosowane w kilku systemach, w tym opisanych w Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33, oraz Huang et al.34. Na przykład, wykorzystując kontrolę przestrzenną zapewnianą przez optogenetykę, strategia ta została niedawno wykorzystana do modyfikacji gradientu sygnałowego w zarodkach Drosophila, wykazując, że embriogeneza much jest zaskakująco odporna na zmiany w tym gradiencie22. Odwracalność i kinetyka szybkiego włączania/wyłączania optogenetycznych aktywatorów sygnalizacji sprawiły, że są one również atrakcyjnymi narzędziami do badania dekodowania dynamiki sygnalizacji8,12,13,14,15,34,35,36.
Wczesny zarodek danio pręgowanego to system in vivo dobrze nadający się do badań optogenetycznych, ponieważ jest zewnętrznie zapłodniony, przezroczysty, przyjazny dla mikroskopu i genetycznie podatny. Ekspozycja na światło jest łatwiejsza do dostarczenia do zarodków, które rozwijają się poza matką, światło może przenikać i uzyskiwać dostęp do ich nieprzezroczystych tkanek, żywe zarodki danio pręgowanego dobrze tolerują obrazowanie (oprócz tego, że są przezroczyste), a istniejące metody genetyczne zapewniają proste możliwości eksperymentów z knockdownem i nadekspresją, oprócz rozwoju użytecznych transgeników37.
Ostatnio opracowano narzędzia optogenetyczne do aktywacji BMP38 i Nodal39 sygnalizacji u embrionów danio pręgowanego z ekspozycją na niebieskie światło (Rysunek 1). Odnosimy się do tych narzędzi jako bOpto-BMP i bOpto-Nodal (b dla aktywowanego niebieskim światłem i Opto dla optycznego). bOpto-BMP/Nodal opierają się na podobnych mechanizmach aktywacji szlaku. Wiązanie ligandów BMP lub węzłowych z odpowiednimi receptorowymi kinazami serynowo-treoninowymi napędza interakcje domen kinazy receptorowej, które prowadzą do fosforylacji efektorów sygnałowych (Smad1/5/9 dla BMP i Smad2/3 dla węzłowych). Fosforylowane efektory sygnalizacyjne następnie przemieszczają się do jądra i regulują ekspresję docelowego genu3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,D). Te interakcje kinaz receptorowych mogą reagować na światło poprzez sprzęganie kinaz receptorowych z białkami dimeryzującymi reagującymi na światło: Pod wpływem światła te chimeryczne białka powinny ulegać dimeryzacji, powodując interakcję domen kinazy receptorowej i aktywację sygnalizacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C, E, F). Co ważne, w przeciwieństwie do receptorów endogennych, bOpto-BMP/Nodal nie zawierają zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligandy, zapewniając aktywność niezależną od liganda (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, F). Ta strategia aktywacji optogenetycznej została po raz pierwszy osiągnięta za pomocą receptorowych kinaz tyrozynowych40,41,42, a następnie zastosowana do receptorowych kinaz serynowo-treoninowych.
bOpto-BMP/Nodal używają reagującego na niebieskie światło (~450 nm) homodimeryzującego sensoru światło-tlenu-napięcia (LOV) z alg Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Konstrukty te składają się z motywu mirystoylacji ukierunkowanego na błonę, po którym następują domeny BMP lub kinazy receptora węzłowego, połączone z domeną LOV (<silna klasa = "xfig">Figura 1B, E). Ekspozycja na światło niebieskie powinna powodować homodimeryzację LOV, co skutkuje interakcjami domen kinazy receptorowej, które prowadzą do odpowiedniej fosforylacji Smad i aktywacji szlaku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, F). W przypadku bOpto-BMP stwierdzono, że połączenie konstruktów z domenami kinazy receptora typu I z Acvr1l (znanego również jako Alk8) i BMPR1aa (znanego również jako Alk3) oraz domeny kinazy receptorowej typu II z BMPR2a optymalnie aktywuje sygnalizację38 (Addgene #207614, #207615 i #207616). Dla bOpto-Nodal stosuje się kombinację konstruktów z domeną kinazy receptorowej typu I z Acvr1ba i domeną kinazy receptorowej typu II z Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal zostały wprowadzone do wczesnych zarodków danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie mRNA na etapie jednokomórkowym i wykorzystane do zbadania roli czasu trwania sygnalizacji w interpretacji węzłowej39, aby określić, dlaczego danio pręgowany traci zdolność do reagowania na Nodal45, oraz zbadać, jak docelowe geny BMP reagują na różne poziomy sygnalizacji BMP38. Jest prawdopodobne, że narzędzia te będą nadal przydatne w różnych przyszłych dochodzeniach. Jednak siła aktywatorów sygnalizacji optogenetycznej jest również ich słabością: próbki wrażliwe na światło muszą być traktowane ostrożnie, aby uniknąć niezamierzonej ektopowej aktywności sygnalizacyjnej. Ekspozycja na światło słoneczne w pomieszczeniu lub światło słoneczne może aktywować bOpto-BMP/Nodal.
Ten protokół dostarcza praktycznych sugestii dotyczących stosowania kodowanych przez mRNA BMP opartych na LOV i aktywatorów węzłowych we wczesnych zarodkach danio pręgowanego. Zaczyna się od wyszczególnienia jednej ze strategii budowy lightboxa do kontrolowania jednolitej ekspozycji na światło i temperatury (Rysunek 2, Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4, Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6, Plik uzupełniający 7, Plik uzupełniający 8). Następnie opisano dwa kluczowe eksperymenty kontrolne, które określają, czy aktywator sygnalizacji optogenetycznej zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami - tj. aktywuje aktywność szlaku tylko wtedy, gdy jest wystawiony na działanie światła (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Pierwszy test kontrolny polega na badaniu fenotypów w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu w zarodkach wystawionych na światło i nienaświetlonych (<silna klasa = "xfig">Figura 3A). Zarodki poddane wstrzyknięciu mRNA naświetlone światłem, ale nie zarodki nienaświetlone, powinny fenoskopować BMP lub nadekspresję węzłową (<silna klasa = "xfig">Figura 4A,B; W szczególności fenotypy BMP są wyraźnie rozróżnialne w tym momencie46). Ten test zapewnia szybki odczyt aktywności. W drugim teście kontrolnym, w celu określenia, czy fenotypy są spowodowane specyficznie przez nadmierną sygnalizację BMP lub sygnalizację węzłową i bezpośrednią obserwację zmiany poziomów sygnalizacji, barwienie immunofluorescencyjne stosuje się do wykrywania fosforylowanych efektorów sygnalizacyjnych (odpowiednio pSmad1/5/9 lub pSmad2/3) po 20-minutowej ekspozycji na światło w późnym stadium blastuli / wczesnej gastrulacji, gdy aktywność sygnalizacyjna została dobrze opisana12, 16,17,47,48,49,50 (Rysunek 3B i <silna klasa="xfig">Rysunek 4C). (Zauważ, że chociaż aktywacja zlokalizowana przestrzennie została zademonstrowana zarówno dla bOpto-BMP38, jak i bOpto-Nodal39, ten protokół opisuje tylko jednolitą ekspozycję na światło i strategie aktywacji sygnalizacji.) Zaleca się przeprowadzenie tych eksperymentów kontrolnych przed zastosowaniem bOpto-BMP/Nodal do konkretnych pytań badawczych w celu określenia idealnych lokalnych warunków eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td><mocny>Budowa kasetonu świetlnego i Protokół ekspozycji na światło</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#8 x 1" Wkręt samowiercący sześciokątny</td><td>McMaster-Carr</td><td>99663A222</td><td>1.4.5</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik mocy optycznej i energii Inkubator</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>1,7 4</td></tr><tr><td>(142 litry)</td><td>Boekel Scientific</td><td>139400</td><td>1.3.1</td></tr><tr><td>Inkubator do montażu panelowego (1/4" gruby akryl)</td> <td>Niestandardowy część / Piedmont Plastics</td><td>Incubator_panel</td><td>1.4.4</td></tr><tr><td>Wiertło stopniowe do rowków spiralnych HSS</td><td>CO-Z</td><td>SDB0001TA</td><td>1.3.2</td></tr><tr><td>Uszczelka soczewki LED, uszczelka inkubatora; 1/32" gruby silikon</td><td>McMaster-Carr</td><td>5812T12</td><td>1.4.3 1.4.4</td></tr><tr><td>Oświetlacz mikropłytek LED</td><td>Prizmatix</td><td>NA</td><td>1.1 1.4.3</td></tr><tr><td>M3 10mm Cube Standoff</td><td>Newark Eletronics</td><td>005.60.533</td><td>1.4.1</td></tr><tr><td>M3 x 10mm 316SS Śruba z płaskim</td><td>McMaster-Carr</td><td>91801A156</td><td>1.4.1</td></tr><tr><td>M6 x 10mm 316SS Śruba z płaskim</td><td>McMaster-Carr</td><td>91801A305</td><td>1.4.3</td></tr><tr><td>Termometr na kartę pamięci</td><td>Fisherbrand</td><td>15-081-111</td><td>1.9 3.2.1</td></tr><tr><td>Głowica czujnika miernika mocy suwaka mikroskopu (150 mW)</td><td>ThorLabs</td><td>S170C</td><td>1.7 4</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z czerwonym żelem #E106</td><td>Rosco / B& H Zdjęcie & Elektronika</td><td>110084014805-E106</td><td>4.2.1</td></tr><tr><td>Wsporniki boczne (1/4" gruby akryl)</td><td>Część niestandardowa / Piedmont Plastics</td><td>Side_bracket</td><td>1.4.2</td></tr><tr><td>Wspornik pionowy (1/4" gruby akryl)</td><td>Część niestandardowa / Piedmont Plastics</td><td>Vertical_bracket</td><td>1.4.1</td></tr><tr><td>Izolacja pogodowa: Lekka pianka EPDM, 1/2" wd 1/4" tk</td><td>McMaster-Carr</td><td>8694K12</td><td>1.8</td></tr><tr><td>Generating mRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA MicroElute Cycle Pure</td><td>Kit Omega</td><td>D6293-02</td><td>2.4</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Inkubator do mikropróbek (Hybex)</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>2</td></tr><tr><td>Inkubator do mikropróbek 1,5 ml blok probówek (Hybex)</td><td>SciGene</td><td>1057-34-0</td><td>2</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>2.4</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny NotI-HF</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R3189L</td><td>2.1</td></tr><tr><td>pCS2-Opto-Alk3</td><td>Addgene</td><td>207614</td><td>2</td></tr><tr><td>pCS2-Opto-Alk8</td><td>Addgene</td><td>207615</td><td></td></tr><tr><td>2 pCS2-Opto-BMPR2a</td><td>Addgene</td><td>207616</td><td>2</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>2.3</td></tr><tr><td>Iniekcyjne mRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (UltraPure)</td><td>Invitrogen / Thermo Fisher</td><td>16500500</td><td>3.1.1</td></tr><tr><td>250 ml szklane zlewki</td><td>Fisherbrand</td><td>FB100250</td><td>3.3.2 3.3.2</td></tr> (<tr><td>opakowanie 50 szt.)</td><td>Sokół</td><td>08 772 1B</td><td>3.1.6</td></tr><tr><td>B-8A przegub kulowy</td><td>Narishige</td><td>B-8A</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Jednostka ciśnienia zwrotnego (element zestawu do mikroiniekcji)</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)</td><td>BPU</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Przełącznik nożny (element zestawu do mikroiniekcji)</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)</td><td>FWS</td><td>3.3</td></tr><tr><td>GJ-1 Stojak magnetyczny</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Kapilary szklane (4 cale, średnica zewnętrzna 1 mm, żarnik)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>3.1.11</td></tr><tr><td>Szklane dna szalek Petriego (do dechorionacji)</td><td>Pyrex</td><td>08-748A</td><td>3.3.2</td></tr><tr><td>Pipety szklane (5 3/4" z szeroką końcówką)</td><td>Kimble-Chase</td><td>63A53WT</td><td>3.1.9</td></tr><tr><td>Formy do naczyń wtryskowych</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>tu1</td><td>3.1.3</td></tr><tr><td>Płyta żelazna IP</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td>3.3</td></tr><tr><td>M-152 mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Zestaw uchwytów do mikropipet (element zestawu do mikroiniekcji)</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)</td><td>MIMPH-MPIP-Kit</td><td>3,3</td></tr><tr><td>mikrometra</td> Wtryskiwacz ciśnieniowy <td>Meiji Techno America</td><td>MA285</td><td>3.3</td></tr><tr><td>(element platformy do mikroiniekcji)</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)</td><td>MPPI-3</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>3.1.11</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100 mm x 15 mm, opakowanie 500 szt.)</td><td>Falcon</td><td>08-757-100D</td><td>3.1.2</td></tr><tr><td>Pibuła (10 ml, zielona)</td><td>Bel-Art</td><td>F37898-0000</td><td>3.3</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>3.3.2</td></tr><tr><td>Butelki do wyciskania (500 ml)</td><td>Nalgene / Thermo Scientific</td><td>2402-0500</td><td>3.3</td></tr></tbody></table>

aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Szlaki sygnałowe koordynują podstawowe procesy biologiczne, w tym rozwój, regenerację, homeostazę i choroby. Metody eksperymentalnego manipulowania sygnalizacją są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób sygnalizacja jest interpretowana w tych szerokich kontekstach. Molekularne narzędzia optogenetyczne mogą zapewnić odwracalne, przestrajalne manipulacje aktywnością szlaku sygnałowego z wysokim stopniem kontroli czasoprzestrzennej i były stosowane in vitro, ex vivo i in vivo. Narzędzia te łączą domeny białek reagujących na światło, takie jak homodimeryzująca domena wykrywania napięcia tlenu (LOV) światła niebieskiego, z efektorami sygnalizacyjnymi, aby zapewnić zależną od światła eksperymentalną kontrolę nad sygnalizacją. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania białka morfogenetycznego kości (BMP) opartego na LOV i węzłowych aktywatorów sygnalizacji bOpto-BMP i bOpto-Nodal w optycznie dostępnym wczesnym zarodku danio pręgowanego. Opisano w nim dwa eksperymenty kontrolne: szybki test fenotypowy w celu określenia odpowiednich warunków eksperymentalnych oraz test immunofluorescencyjny w celu bezpośredniej oceny sygnalizacji. Łącznie te eksperymenty kontrolne mogą pomóc w ustaleniu metody wykorzystania narzędzi optogenetycznych we wczesnych zarodkach danio pręgowanego. Strategie te stanowią potężną platformę do badania ról sygnalizacji w rozwoju, zdrowiu i fizjologii.

Celem dwóch opisanych tutaj eksperymentów kontrolnych jest ustalenie, czy bOpto-BMP/Nodal aktywują odpowiednie dla nich szlaki w odpowiedzi na ekspozycję na niebieskie światło, nie wpływając jednocześnie na sygnalizację w ciemności, zgodnie z oczekiwaniami. Należy wykorzystać te kontrole do opracowania odpowiedniego schematu doświadczalnego w laboratorium przed zastosowaniem bOpto-BMP/Nodal w badaniach nad konkretnymi problemami naukowymi.
Test fenotypowy można przeprowadzić w zaledwie 2 dni, co daje przydatną informację o aktywności sygnalizacyjnej i fototoksyczności (Ryc. 3A). Zarodki, które zostały wstrzyknięte i poddane działaniu światła niebieskiego, powinny wykazywać fenokopię nadmiernej sygnalizacji BMP (wentralizacja46; Ryc. 4A, panel lewy) lub sygnalizacji Nodal (defekty rozwojowe związane z nadmiarem mezendodermy1,3,47,57,58,59,60 (Ryc. 4A, panel prawy)). Jeśli wstrzyknięte i poddane działaniu światła zarodki są afenotypowe, należy sprawdzić jakość mRNA, rozważyć wstrzyknięcie większej ilości oraz zweryfikować strategię naświetlania, aby zapewnić stałą ekspozycję na jasne światło (światło o długości fali ~450 nm z natężeniem promieniowania 45 W/m2 powinno silnie aktywować sygnalizację). Z kolei wstrzyknięte zarodki niepoddane działaniu światła powinny wyglądać identycznie jak niepoddane wstrzykiwaniu rodzeństwo. Jeśli wstrzyknięte zarodki niepoddane działaniu światła wykazują fenotypy, należy zmniejszyć ilość wstrzykniętego mRNA i ponownie ocenić układ eksperymentalny, aby upewnić się, że zarodki niepoddane naświetlaniu są chronione przed ekspozycją na światło. Dane przedstawione na Ryc. 4B obrazują wyniki typowych eksperymentów fenotypowych przy odpowiednich ilościach mRNA i warunkach naświetlania: silna aktywność sygnalizacyjna jest widoczna u wstrzykniętych zarodków poddanych działaniu światła, podczas gdy jedynie niewielka frakcja wstrzykniętych zarodków niepoddanych naświetlaniu wykazuje fenotypy.
Analiza fenotypowa daje również możliwość oceny fototoksyczności. Jeśli fototoksyczność jest pomijalna, niezaaplikowane embriony wystawione na działanie światła powinny wykazywać fenotyp typu dzikiego, podobnie jak niezaaplikowane embriony niewystawione na działanie światła. Jeśli w niezaaplikowanych embrionach wystawionych na światło występują wady, a w niezaaplikowanych embrionach niewystawionych na światło ich nie ma, należy rozważyć zmniejszenie natężenia promieniowania świetlnego. Natężenie 45 W/m2 silnie aktywuje sygnalizację bez wyraźnej fototoksyczności. Dane przedstawione na ryc. 4B nie wykazują niepokojących różnic między niezaaplikowanymi embrionami wystawionymi na światło a niezaaplikowanymi embrionami niewystawionymi na światło, co wskazuje na pomijalną fototoksyczność.
Chociaż testy immunofluorescencji wymagają więcej czasu i wysiłku (~1 tydzień) w porównaniu do testu fenotypowania (2 dni), barwienie immunofluorescencyjne zapewnia bezpośredni odczyt aktywności szlaku sygnalizacyjnego i może ujawnić subtelne zmiany w sygnalizacji, które nie mogą być widoczne w morfologii ogólnej. Immunofluorescencja jest szczególnie istotna przy ocenie odpowiedzi na bOpto-Nodal, ponieważ nadmierna sygnalizacja Nodal często prowadzi do lizy zarodków do 1 dpf — co może mieć wiele przyczyn — w przeciwieństwie do specyficznych fenotypów wentralizacji charakterystycznych dla nadmiernej sygnalizacji BMP46 (Rysunek 4A). Zarodki wstrzyknięte i eksponowane na niebieskie światło powinny wykazywać jednolity wzrost fosforylacji Smad1/5/9 lub Smad2/3 w porównaniu do zarodków nie wstrzykniętych, a eksponowanych na światło. Jeśli poziomy nie wzrosną lub wzrosną tylko słabo, należy sprawdzić jakość mRNA, rozważyć wstrzyknięcie większej ilości oraz ponownie zweryfikować strategię ekspozycji na światło. Ekspozycja na niebieskie światło przez 20 min z natężeniem 45 W/m2 około 40% epiboli powinna silnie aktywować sygnalizację. Jeśli barwienie pSmad jest niejednolite, należy spróbować wstrzyknąć mRNA do centrum komórki (zamiast do żółtka), co może skutkować bardziej jednolitym rozkładem mRNA.
Wstrzyknięte, nieeksponowane zarodki powinny wykazywać poziom pSmad porównywalny z poziomem w zarodkach niewstrzykniętych. Nieoficjalnie zaobserwowaliśmy silniejszą nieszczelność fosforylacji Smad w przypadku bOpto-Nodal niż bOpto-BMP. Jeśli poziom pSmad jest podwyższony w wstrzykniętych, nieeksponowanych zarodkach, należy zmniejszyć ilość wstrzykniętego mRNA. Ponadto należy ponownie ocenić konfigurację eksperymentalną, aby upewnić się, że 1) nieeksponowane zarodki nie są przypadkowo narażone na światło oraz 2) ekspozycja na światło podczas utrwalania jest minimalna. Podczas etapu utrwalania kluczowe jest, aby od momentu wyjęcia z pudełka świetlnego do zanurzenia w formaldehydzie nie upłynęło więcej niż 45 s. Dodatkowo, podczas tego kroku należy zminimalizować ekspozycję na światło pokojowe i słoneczne poprzez zasłonięcie żaluzji w oknach, wyłączenie białych źródeł światła, użycie czerwonego światła lub zakrycie białych źródeł światła niebieskim filtrem żelowym (Tabela materiałów).
Dane przedstawione na Rysunku 4C ukazują wyniki typowych eksperymentów z barwieniem immunofluorescencyjnym przy zastosowaniu odpowiednich ilości mRNA i warunków ekspozycji na światło: poziomy pSmad są podobne w embrionach nieiniekcyjnych i nieeksponowanych na światło, natomiast embriony iniekcyjne, eksponowane na światło, wykazują wyższe poziomy fosforylacji Smad.
<img alt="Schemat optogenetyczny przedstawiający aktywację szlaków BMP i Nodal z wykorzystaniem domeny LOV w celu sygnalizacji Smad." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Strategia aktywacji sygnalizacji bOpto-BMP i -Nodal. (A) Endogenny szlak sygnalizacyjny BMP jest aktywowany przez wiązanie ligandu BMP, co prowadzi do powstania kompleksu receptorowego typu I/II, fosforylacji Smad1/5/9 i ekspresji genów docelowych BMP. Receptory typu I BMPR1aa i Acvr1l są znane odpowiednio jako Alk3 i Alk8. BMPR2a jest receptorem typu II. (B) Konstrukcje bOpto-BMP38. Domeny kinazowe BMPR1aa i Acvr1l są połączone z LOV; fuzja BMPR2a-LOV zawiera domeny kinazową i C-terminalną (CTD) receptora. Wszystkie fuzje są kierowane do błony za pomocą motywu mirystoilacji (Myr). Domeny są oddzielone łącznikami glicyna-seryna (GS). Konstrukcje są znakowane w CTD epitopem HA. Stwierdzono, że ta kombinacja trzech konstrukcji optymalnie aktywuje sygnalizację BMP. (C) Aktywacja sygnalizacji BMP za pośrednictwem bOpto-BMP. Pod wpływem niebieskiego światła domeny LOV dimeryzują, co prawdopodobnie wyzwala tworzenie kompleksu i aktywację sygnalizacji. (D) Endogenny szlak sygnalizacyjny Nodal jest aktywowany przez wiązanie ligandu Nodal, co prowadzi do powstania kompleksu receptorowego typu I/II, fosforylacji Smad2/3 i ekspresji genów docelowych Nodal. Receptor typu I Acvr1ba i receptor typu II Acvr2ba są znane odpowiednio jako Acvr1b i Acvr2b. (E) Konstrukcje bOpto-Nodal39. Domeny kinazowe Acvr1ba i Acvr2ba są połączone z LOV. Wszystkie fuzje są kierowane do błony za pomocą motywu mirystoilacji (Myr). Domeny są oddzielone łącznikami GS. Konstrukcje są znakowane w CTD epitopem HA. (F) Aktywacja sygnalizacji Nodal za pośrednictwem bOpto-Nodal. Pod wpływem niebieskiego światła domeny LOV dimeryzują, co prawdopodobnie wyzwala tworzenie kompleksu i aktywację sygnalizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ oświetlenia LED dla inkubatora mikrobiologicznego; schemat przedstawia metodę naświetlania i montaż." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegroda świetlna z kontrolą temperatury do eksperymentów optogenetycznych. (A) Oświetlacz LED do mikropłytek jest zamontowany na górnej części inkubatora za pomocą niestandardowego uchwytu LED. Zarodki zebrafish w płytce 6-dołkowej na pierwszej półce są naświetlane przez otwór wywiercony w górnej części inkubatora. Na dolnej półce znajduje się drugi zestaw nienarażonych zarodków kontrolnych w płytce 6-dołkowej owiniętej w folię aluminiową. Drzwi inkubatora są uszczelnione listwami uszczelniającymi, aby zapobiec przypadkowej ekspozycji na światło pokojowe lub słoneczne. (B) Szczegóły procedury wykonywania otworu w inkubatorze za pomocą wiertła stopniowego. Model inkubatora użyty w tym badaniu posiada wewnętrzny panel, który wymagał wywiercenia drugiego, większego otworu (Tabela materiałów). (C) Szczegóły niestandardowego uchwytu LED zaprojektowanego dla systemu oświetlenia trójfalowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Iniekcja mRNA i immunofluorescencja; oś czasu rozwoju zarodka; analiza obrazowania fenotypu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat eksperymentu bOpto-BMP/Nodal. Analiza fenotypu i barwienie immunofluorescencyjne pSmad w celu przetestowania aktywności bOpto-BMP/Nodal. Zarodki są wstrzykiwane z mRNA w stadium jednej komórki i przenoszone do pudła świetlnego nie później niż 1,5 h po zapłodnieniu (hpf). (A) Analiza fenotypu. Wstrzyknięte zarodki i niepoddane wstrzykiwaniu rodzeństwo są hodowane w ciemności lub wystawione na jednorodne niebieskie światło od 1,5 hpf do 1 dnia po zapłodnieniu (dpf). Aktywność sygnalizacji optogenetycznej można ocenić poprzez analizę fenotypów zarodków zgodnych z nadmierną aktywnością szlaku. (B) Barwienie immunofluorescencyjne pSmad. Wstrzyknięte zarodki i niepoddane wstrzykiwaniu rodzeństwo są hodowane w ciemności do momentu 40% epibolii (~6 hpf). Połowa zarodków wstrzykniętych i połowa niepoddanych wstrzykiwaniu jest następnie wystawiona na jednorodne niebieskie światło przez 20 min. Po ekspozycji wszystkie zarodki są utrwalane i poddawane barwieniu immunofluorescencyjnemu na pSmad. Podwyższone poziomy pSmad1/5/9 lub pSmad2/3 odzwierciedlają optogenetyczną aktywację sygnalizacji odpowiednio BMP lub Nodal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat fenotypów zebrafish; nadmierne sygnalizowanie BMP/Nodal; analiza immunofluorescencyjna białek pSmad." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ocena odpowiedzi sygnalizacyjnych aktywowanych światłem w embrionach zebrafish. Embriony zebrafish zostały wstrzyknięte w stadium jednej komórki mRNA kodującym bOpto-BMP/Nodal. (A) Embriony hodowano w ciemności lub wystawiano na jednorodne niebieskie światło począwszy od 1,5 h po zapłodnieniu (hpf). Fenotypy oceniano w 1. dniu po zapłodnieniu (dpf). Przedstawiono reprezentatywne fenotypy. Nadmierna sygnalizacja BMP prowadzi do ventralizacji (panel lewy), natomiast nadmierna sygnalizacja Nodal powoduje wady rozwojowe związane z dodatkowym mezendodermem (panel prawy). Pasek skali = 500 µm. (B) Kwantyfikacja fenotypów. Wstrzyknięte embriony oraz niewstrzyknięte rodzeństwo hodowano w ciemności począwszy od 1,5 hpf (czarna żarówka). Połowa wstrzykniętych i połowa niewstrzykniętych embrionów została wystawiona na jednorodne niebieskie światło (niebieska żarówka). (C) Wstrzyknięte embriony oraz niewstrzyknięte rodzeństwo hodowano w ciemności począwszy od 1,5 hpf (czarna żarówka). Przy 40% epibolii (~6 hpf), połowa wstrzykniętych i połowa niewstrzykniętych embrionów została wystawiona na jednorodne niebieskie światło (niebieska żarówka). Po 20 min wszystkie embriony utrwalono i poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu na fosforylowane białka Smad1/5/9 lub Smad2/3. Wyższa intensywność pSmad wskazuje odpowiednio na zwiększoną sygnalizację BMP/Nodal. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Pełny montaż lightboxa. Plik 3D PDF przedstawiający trójwymiarowy widok pełnego montażu lightboxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Widok rozstrzelony skrzynki świetlnej. Plik 3D PDF przedstawiający trójwymiarowy widok rozstrzelony montażu skrzynki świetlnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Duża uszczelka świetlna. Plik z rysunkiem CAD (format .DWG) do wykonania dużej uszczelki świetlnej do uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Mała uszczelka świetlna. Plik z rysunkiem CAD (format .DWG) do wykonania małej uszczelki świetlnej do uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Akrylowa podstawa platformy. Plik rysunku CAD (format .DWG) do wykonania akrylowej podstawy platformy do uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Akrylowa platforma pionowa. Plik rysunku CAD (format .DWG) do wykonania pionowej akrylowej platformy uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 7: Wspornik akrylowy lewy. Plik rysunku CAD (format .DWG) do wykonania lewego wspornika akrylowego uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 8: Prawy wspornik akrylowy. Plik z rysunkiem CAD (format .DWG) do wykonania prawego wspornika akrylowego uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Uważa się, że aby ustalić plan ciała zarodka podczas rozwoju, komórki dekodują intensywność sygnalizacji, dynamikę i kombinacje. Używamy optogenetyki do manipulowania tymi cechami sygnalizacyjnymi w zarodkach danio pręgowanego. To podejście pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób komórki embrionalne dekodują sygnalizację, aby podejmować jedne z najwcześniejszych decyzji dotyczących losu komórki.Omawiane tutaj podejścia optogenetyczne wykorzystują światło jako pilot do szybkiej i odwracalnej aktywacji BMP, czyli sygnalizacji węzłowej. Ponieważ ekspozycja na światło jest łatwa do ukierunkowania, podejścia te mogą zapewnić lepszą eksperymentalną kontrolę nad sygnalizacją. Nasz protokół wprowadza stosowanie tych wrażliwych na światło narzędzi w zarodkach danio pręgowanego.Dzięki tej ulepszonej kontroli czasowej i przestrzennej powinno być teraz możliwe dokonywanie precyzyjnych modyfikacji sygnalizacji podczas rozwoju danio pręgowanego. Spodziewamy się, że pogłębi to nasze zrozumienie tego, w jaki sposób komórki dekodują sygnalizację, aby podejmować decyzje dotyczące losu, co pomoże ujawnić, jak rozwija się plan ciała embrionalnego. Na początek użyj inkubatora i oświetlacza mikropłytki LED, aby stworzyć kaseton świetlny do kontrolowania ekspozycji na światło i temperatury.Następnie umieść sześciodołkową płytkę na górnej półce inkubatora i sprawdź, czy wiązka światła równomiernie ją obejmuje. Użyj kartki papieru, aby zobrazować rozkład pokrycia światłem. Użyj światłomierza do pomiaru natężenia promieniowania i jednorodności przestrzennej.Co najmniej jeden dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować naczynia do wstrzykiwań i sześciodołkowe płytki pokryte agarozą. Opłucz formę naczynia iniekcyjnego pożywką z zarodków i delikatnie umieść na stopionej agarozie. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie użyj tabletki, aby usunąć pleśń.Następnie przygotuj pipety ze szkła płomieniowego do eksperymentów immunofluorescencyjnych na zarodkach pozbawionych naskórkówki. Umieść końcówkę szklanej pipety w płomieniu palnika Bunsena i obracaj w sposób ciągły, aż krawędzie staną się gładkie. Przygotuj mieszaninę do wstrzykiwań, używając pokazanych tutaj mRNA.W przypadku testu fenotypowania wprowadź igłę przez kosmówkę bezpośrednio do środka komórki na etapie jednokomórkowym i wstrzyknij 1 nanolitr mieszanki iniekcyjnej. Jeśli przeprowadzasz test immunofluorescencyjny, celuj w środek komórki zarodków pozbawionych naczyniówki w stadium jednokomórkowym. W przypadku obu testów należy przygotować wystarczającą liczbę zarodków dla nienarażonych zarodków bez wstrzyknięć, nienarażonych z wstrzyknięć, odsłoniętych bez wstrzyknięć i narażonych na działanie zarodków.Wybierz co najmniej 30 zarodków w każdym stanie. Do testu immunofluorescencyjnego należy przygotować dodatkowe naczynie zawierające zarodki bez wstrzyknięć jako wskaźnik zastępczy do oceny postępu etapów rozwojowych. Po wstrzyknięciu inkubować zarodki i szalki Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Na początek wysiaduj wstrzyknięte zarodki danio pręgowanego w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Około 1,5 HPF, na etapie od 4 do 16 komórek, usuwa niezapłodnione i niezdrowe zarodki. W przypadku testu fenotypowania owinąć nienaświetloną płytkę kontrolną z niewstrzykniętymi i wstrzykniętymi zarodkami w folię aluminiową.Umieść pokrytą folią płytkę na dolnej półce, a odsłoniętą płytkę na górnej półce kasetonu oświetleniowego o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po upewnieniu się, że osłona naczynia jest na swoim miejscu, włącz niebieskie światło i zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec niezamierzonej ekspozycji na światło w pomieszczeniu. W przypadku testu immunofluorescencyjnego około 1,5 HPF, pojedynczo owiń odsłonięte i nienaświetlone naczynia oraz folię aluminiową, pozostawiając rozpakowaną miskę proxy.Umieść wszystkie naczynia w kasecie oświetleniowym o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez włączania diody LED. Zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec przypadkowemu wystawieniu na działanie światła w pomieszczeniu. Przy około 5 HPF użyj lunety preparcyjnej, aby ocenić etap rozwoju zarodków zastępczych.Wyjmij również owinięte naczynia, aby zapewnić równomierną ekspozycję na temperaturę we wszystkich naczyniach. Gdy zarodki proxy osiągną 40% epibolii, odkryj odsłonięte naczynie i umieść je na górnej półce kasetonu. Trzymaj nieodsłonięte naczynie przykryte na dolnej półce.Natychmiast włącz niebieskie światło, zamknij drzwi i ustaw timer na 20 minut. Aby przygotować się do mocowania, wyeliminuj jak najwięcej światła w pomieszczeniu. Tuż przed utrwaleniem weź probówki zawierające 4% formaldehydu z 4 stopni Celsjusza i umieść je obok kasetonu.Po 20 minutach otwórz drzwiczki kasetonu i wyjmij naczynie, które nie było wystawione na działanie światła. Użyj końcówki pipety z płomienistego szkła, aby usunąć wrażliwe na światło zarodki z naczynia. Następnie, aby zanurzyć zarodki w 4% formaldehydzie, zanurz końcówkę pipety z płomieniowanego szkła w formaldehydzie i pozwól zarodkom zanurzyć się w płynie.Przechowuj utrwalone zarodki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku testu fenotypowania należy przeprowadzić eksperyment ekspozycji na światło na zarodki danio pręgowanego z ekspresją bOpto-BMP i bOpto-Nodal i usunąć je z kasety świetlnej w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu w temperaturze od 24 do 32 HPF. Korzystając z zakresu preparacyjnego, oceń fenotypy i ustal rubrykę punktacji.Dla wygody oceniaj zarodki, gdy pozostają w kosmówce. Użyj pipety do sondowania, aby zmienić położenie zarodków do oglądania pod różnymi kątami. W teście immunofluorescencyjnym, po inkubacji zarodków w 4% formaldehydzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, usuń formaldehyd i spłucz je trzy do pięciu razy PBST.Wyrzuć PBST i dodaj 100% metanolu. Zamknij probówki i delikatnie je odwróć, aby wymieszać resztki PBST i metanol. Po dwukrotnym umyciu zarodków metanolem przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, aż do kilku lat.Za pomocą mikroskopu wyposażonego w sekcję optyczną uchwyć obrazy zarodków wybarwionych immunologicznie. Eksperymenty z barwieniem immunofluorescencyjnym z odpowiednimi ilościami mRNA i warunkami ekspozycji na światło wykazały, że poziomy pSmad były podobne w zarodkach bez wstrzyknięć i nieeksponowanych, podczas gdy zarodki poddane wstrzyknięciu ekspozycji na światło wykazywały wyższe poziomy fosforylacji Smad.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

Techniki optogenetyczne umożliwiły badanie wpływu określonych neuronów na zachowanie.  Opisujemy metodę u larw danio pręgowanego do aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych wyrażających wariant rodopsyny kanałowej (ChEF) za pomocą lasera na ciele stałym pompowanym diodą (DPSS) i rejestrowania wywołanych zachowań za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę aktywacji sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę szlaków BMP i Nodal, pomagając zrozumieć mechanizmy decyzji losu komórkowego we wczesnym rozwoju.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów