Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego
October 27th, 2023
Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.
Uważa się, że aby ustalić plan ciała zarodka podczas rozwoju, komórki dekodują intensywność sygnalizacji, dynamikę i kombinacje. Używamy optogenetyki do manipulowania tymi cechami sygnalizacyjnymi w zarodkach danio pręgowanego. To podejście pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób komórki embrionalne dekodują sygnalizację, aby podejmować jedne z najwcześniejszych decyzji dotyczących losu komórki.
Omawiane tutaj podejścia optogenetyczne wykorzystują światło jako pilot do szybkiej i odwracalnej aktywacji BMP, czyli sygnalizacji węzłowej. Ponieważ ekspozycja na światło jest łatwa do ukierunkowania, podejścia te mogą zapewnić lepszą eksperymentalną kontrolę nad sygnalizacją. Nasz protokół wprowadza stosowanie tych wrażliwych na światło narzędzi w zarodkach danio pręgowanego.
Dzięki tej ulepszonej kontroli czasowej i przestrzennej powinno być teraz możliwe dokonywanie precyzyjnych modyfikacji sygnalizacji podczas rozwoju danio pręgowanego. Spodziewamy się, że pogłębi to nasze zrozumienie tego, w jaki sposób komórki dekodują sygnalizację, aby podejmować decyzje dotyczące losu, co pomoże ujawnić, jak rozwija się plan ciała embrionalnego. Na początek użyj inkubatora i oświetlacza mikropłytki LED, aby stworzyć kaseton świetlny do kontrolowania ekspozycji na światło i temperatury.
Następnie umieść sześciodołkową płytkę na górnej półce inkubatora i sprawdź, czy wiązka światła równomiernie ją obejmuje. Użyj kartki papieru, aby zobrazować rozkład pokrycia światłem. Użyj światłomierza do pomiaru natężenia promieniowania i jednorodności przestrzennej.
Co najmniej jeden dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować naczynia do wstrzykiwań i sześciodołkowe płytki pokryte agarozą. Opłucz formę naczynia iniekcyjnego pożywką z zarodków i delikatnie umieść na stopionej agarozie. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie użyj tabletki, aby usunąć pleśń.
Następnie przygotuj pipety ze szkła płomieniowego do eksperymentów immunofluorescencyjnych na zarodkach pozbawionych naskórkówki. Umieść końcówkę szklanej pipety w płomieniu palnika Bunsena i obracaj w sposób ciągły, aż krawędzie staną się gładkie. Przygotuj mieszaninę do wstrzykiwań, używając pokazanych tutaj mRNA.
W przypadku testu fenotypowania wprowadź igłę przez kosmówkę bezpośrednio do środka komórki na etapie jednokomórkowym i wstrzyknij 1 nanolitr mieszanki iniekcyjnej. Jeśli przeprowadzasz test immunofluorescencyjny, celuj w środek komórki zarodków pozbawionych naczyniówki w stadium jednokomórkowym. W przypadku obu testów należy przygotować wystarczającą liczbę zarodków dla nienarażonych zarodków bez wstrzyknięć, nienarażonych z wstrzyknięć, odsłoniętych bez wstrzyknięć i narażonych na działanie zarodków.
Wybierz co najmniej 30 zarodków w każdym stanie. Do testu immunofluorescencyjnego należy przygotować dodatkowe naczynie zawierające zarodki bez wstrzyknięć jako wskaźnik zastępczy do oceny postępu etapów rozwojowych. Po wstrzyknięciu inkubować zarodki i szalki Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Na początek wysiaduj wstrzyknięte zarodki danio pręgowanego w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Około 1,5 HPF, na etapie od 4 do 16 komórek, usuwa niezapłodnione i niezdrowe zarodki. W przypadku testu fenotypowania owinąć nienaświetloną płytkę kontrolną z niewstrzykniętymi i wstrzykniętymi zarodkami w folię aluminiową.
Umieść pokrytą folią płytkę na dolnej półce, a odsłoniętą płytkę na górnej półce kasetonu oświetleniowego o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po upewnieniu się, że osłona naczynia jest na swoim miejscu, włącz niebieskie światło i zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec niezamierzonej ekspozycji na światło w pomieszczeniu. W przypadku testu immunofluorescencyjnego około 1,5 HPF, pojedynczo owiń odsłonięte i nienaświetlone naczynia oraz folię aluminiową, pozostawiając rozpakowaną miskę proxy.
Umieść wszystkie naczynia w kasecie oświetleniowym o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez włączania diody LED. Zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec przypadkowemu wystawieniu na działanie światła w pomieszczeniu. Przy około 5 HPF użyj lunety preparcyjnej, aby ocenić etap rozwoju zarodków zastępczych.
Wyjmij również owinięte naczynia, aby zapewnić równomierną ekspozycję na temperaturę we wszystkich naczyniach. Gdy zarodki proxy osiągną 40% epibolii, odkryj odsłonięte naczynie i umieść je na górnej półce kasetonu. Trzymaj nieodsłonięte naczynie przykryte na dolnej półce.
Natychmiast włącz niebieskie światło, zamknij drzwi i ustaw timer na 20 minut. Aby przygotować się do mocowania, wyeliminuj jak najwięcej światła w pomieszczeniu. Tuż przed utrwaleniem weź probówki zawierające 4% formaldehydu z 4 stopni Celsjusza i umieść je obok kasetonu.
Po 20 minutach otwórz drzwiczki kasetonu i wyjmij naczynie, które nie było wystawione na działanie światła. Użyj końcówki pipety z płomienistego szkła, aby usunąć wrażliwe na światło zarodki z naczynia. Następnie, aby zanurzyć zarodki w 4% formaldehydzie, zanurz końcówkę pipety z płomieniowanego szkła w formaldehydzie i pozwól zarodkom zanurzyć się w płynie.
Przechowuj utrwalone zarodki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku testu fenotypowania należy przeprowadzić eksperyment ekspozycji na światło na zarodki danio pręgowanego z ekspresją bOpto-BMP i bOpto-Nodal i usunąć je z kasety świetlnej w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu w temperaturze od 24 do 32 HPF. Korzystając z zakresu preparacyjnego, oceń fenotypy i ustal rubrykę punktacji.
Dla wygody oceniaj zarodki, gdy pozostają w kosmówce. Użyj pipety do sondowania, aby zmienić położenie zarodków do oglądania pod różnymi kątami. W teście immunofluorescencyjnym, po inkubacji zarodków w 4% formaldehydzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, usuń formaldehyd i spłucz je trzy do pięciu razy PBST.
Wyrzuć PBST i dodaj 100% metanolu. Zamknij probówki i delikatnie je odwróć, aby wymieszać resztki PBST i metanol. Po dwukrotnym umyciu zarodków metanolem przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, aż do kilku lat.
Za pomocą mikroskopu wyposażonego w sekcję optyczną uchwyć obrazy zarodków wybarwionych immunologicznie. Eksperymenty z barwieniem immunofluorescencyjnym z odpowiednimi ilościami mRNA i warunkami ekspozycji na światło wykazały, że poziomy pSmad były podobne w zarodkach bez wstrzyknięć i nieeksponowanych, podczas gdy zarodki poddane wstrzyknięciu ekspozycji na światło wykazywały wyższe poziomy fosforylacji Smad.
Przegląd
Niniejsze badanie eksploruje zastosowanie optogenetycznej manipulacji w celu zbadania szlaków sygnałowych u zarodków zebrafish. Stosując narzędzia wrażliwe na światło, badacze dążą do uzyskania wglądu w to, jak komórki zarodkowe dekodują sygnały dla decyzji dotyczących losu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neurobiologia
- Biologia rozwojowa
- Optogenetyka
Wprowadzenie
- Szlaki sygnałowe są kluczowe dla ustalania planu budowy zarodka.
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę aktywacji sygnałów.
- Zarodki zebrafish służą jako model do badania wczesnego rozwoju.
- Zrozumienie dekodowania sygnałów może ujawnić mechanizmy rozwoju i chorób.
Cel badania
- Wpływanie na szlaki BMP i Nodal u zarodków zebrafish.
- Zbadanie, jak komórki podejmują wczesne decyzje dotyczące losu w oparciu o sygnały.
- Ulepszenie kontroli eksperymentalnej nad szlakami sygnałowymi za pomocą światła.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie narzędzi wrażliwych na światło do aktywacji sygnałów.
- Wstrzyknięcie mRNA do zarodków zebrafish na etapie jedno-komórkowym.
- Wykorzystanie skrzynki świetlnej do kontrolowanego narażenia na światło podczas eksperymentów.
- Ocena etapów rozwoju i fenotypów po ekspozycji.
Główne wyniki
- Narażenie na światło skutkowało wyższymi poziomami fosforylacji Smad w wstrzykniętych zarodkach.
- Warunki eksperymentalne umożliwiały precyzyjne modyfikacje sygnałów.
- Komórki zarodkowe wykazały zdolność do dekodowania sygnałów dla decyzji dotyczących losu komórkowego.
- Testy immunofluorescencyjne dostarczyły wglądu w postęp rozwoju.
Wnioski
- Narzędzia optogenetyczne pogłębiają zrozumienie sygnałów embrionalnych.
- To podejście może prowadzić do postępu w badaniach biologii rozwojowej.
- Przyszłe badania mogą zbadać dalsze implikacje dla regeneracji i chorób.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optogenetic activation of BMP and Nodal signaling in zebrafish embryos enables precise, reversible interrogation of developmental pathways critical for early cell fate decisions. This platform provides biopharma R&D teams with a tunable, high-resolution system for dissecting pathway function and de-risking target hypotheses in a vertebrate model. The approach supports predictive confidence in target validation and informs translational strategies for developmental and regenerative programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of developmental signaling hypotheses in a live vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating pathway-specific effects using light-controlled activation.
- Facilitates functional target validation through quantitative phenotyping and immunofluorescence readouts.
- Improves predictive confidence for pathway modulation strategies in early-stage portfolios.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, optically controlled biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via phenotype scoring and pSmad immunofluorescence assays.
- Enables assay standardization and scalability through uniform light exposure and embryo handling protocols.
- Prepares robust platforms for evaluating pathway modulators in a developmentally relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway interrogation with disease-relevant developmental processes in a vertebrate model.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking pathway activation to phenotypic and molecular endpoints.
- Provides mechanistic insights that inform risk-adjusted advancement of regenerative and developmental therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
This optogenetic protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven pathway interrogation, quantitative phenotyping, and molecular validation in zebrafish embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through light-controlled signaling activation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative phenotypic and molecular readouts for assay development.
- Analytics: Provides immunofluorescence-based measurement of pathway activation (pSmad) for condition comparison.
- Translational Research: Connects developmental pathway modulation to disease-relevant biology in a vertebrate system.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable optogenetic platform adaptable to additional signaling pathways and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes experimental conditions and enables scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying pathway function early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of developmental and regenerative programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling and optogenetic tool deployment.
- Needs access to controlled light exposure systems and quantitative imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of phenotype scoring and immunofluorescence protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of light delivery and tool expression.
- Practical limitations include light penetration, embryo throughput, and precise timing of exposure.
