Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego
27 października 2023
Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.
Uważa się, że aby ustalić plan ciała zarodka podczas rozwoju, komórki dekodują intensywność sygnalizacji, dynamikę i kombinacje. Używamy optogenetyki do manipulowania tymi cechami sygnalizacyjnymi w zarodkach danio pręgowanego. To podejście pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób komórki embrionalne dekodują sygnalizację, aby podejmować jedne z najwcześniejszych decyzji dotyczących losu komórki.
Omawiane tutaj podejścia optogenetyczne wykorzystują światło jako pilot do szybkiej i odwracalnej aktywacji BMP, czyli sygnalizacji węzłowej. Ponieważ ekspozycja na światło jest łatwa do ukierunkowania, podejścia te mogą zapewnić lepszą eksperymentalną kontrolę nad sygnalizacją. Nasz protokół wprowadza stosowanie tych wrażliwych na światło narzędzi w zarodkach danio pręgowanego.
Dzięki tej ulepszonej kontroli czasowej i przestrzennej powinno być teraz możliwe dokonywanie precyzyjnych modyfikacji sygnalizacji podczas rozwoju danio pręgowanego. Spodziewamy się, że pogłębi to nasze zrozumienie tego, w jaki sposób komórki dekodują sygnalizację, aby podejmować decyzje dotyczące losu, co pomoże ujawnić, jak rozwija się plan ciała embrionalnego. Na początek użyj inkubatora i oświetlacza mikropłytki LED, aby stworzyć kaseton świetlny do kontrolowania ekspozycji na światło i temperatury.
Następnie umieść sześciodołkową płytkę na górnej półce inkubatora i sprawdź, czy wiązka światła równomiernie ją obejmuje. Użyj kartki papieru, aby zobrazować rozkład pokrycia światłem. Użyj światłomierza do pomiaru natężenia promieniowania i jednorodności przestrzennej.
Co najmniej jeden dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować naczynia do wstrzykiwań i sześciodołkowe płytki pokryte agarozą. Opłucz formę naczynia iniekcyjnego pożywką z zarodków i delikatnie umieść na stopionej agarozie. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie użyj tabletki, aby usunąć pleśń.
Następnie przygotuj pipety ze szkła płomieniowego do eksperymentów immunofluorescencyjnych na zarodkach pozbawionych naskórkówki. Umieść końcówkę szklanej pipety w płomieniu palnika Bunsena i obracaj w sposób ciągły, aż krawędzie staną się gładkie. Przygotuj mieszaninę do wstrzykiwań, używając pokazanych tutaj mRNA.
W przypadku testu fenotypowania wprowadź igłę przez kosmówkę bezpośrednio do środka komórki na etapie jednokomórkowym i wstrzyknij 1 nanolitr mieszanki iniekcyjnej. Jeśli przeprowadzasz test immunofluorescencyjny, celuj w środek komórki zarodków pozbawionych naczyniówki w stadium jednokomórkowym. W przypadku obu testów należy przygotować wystarczającą liczbę zarodków dla nienarażonych zarodków bez wstrzyknięć, nienarażonych z wstrzyknięć, odsłoniętych bez wstrzyknięć i narażonych na działanie zarodków.
Wybierz co najmniej 30 zarodków w każdym stanie. Do testu immunofluorescencyjnego należy przygotować dodatkowe naczynie zawierające zarodki bez wstrzyknięć jako wskaźnik zastępczy do oceny postępu etapów rozwojowych. Po wstrzyknięciu inkubować zarodki i szalki Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Na początek wysiaduj wstrzyknięte zarodki danio pręgowanego w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Około 1,5 HPF, na etapie od 4 do 16 komórek, usuwa niezapłodnione i niezdrowe zarodki. W przypadku testu fenotypowania owinąć nienaświetloną płytkę kontrolną z niewstrzykniętymi i wstrzykniętymi zarodkami w folię aluminiową.
Umieść pokrytą folią płytkę na dolnej półce, a odsłoniętą płytkę na górnej półce kasetonu oświetleniowego o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po upewnieniu się, że osłona naczynia jest na swoim miejscu, włącz niebieskie światło i zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec niezamierzonej ekspozycji na światło w pomieszczeniu. W przypadku testu immunofluorescencyjnego około 1,5 HPF, pojedynczo owiń odsłonięte i nienaświetlone naczynia oraz folię aluminiową, pozostawiając rozpakowaną miskę proxy.
Umieść wszystkie naczynia w kasecie oświetleniowym o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez włączania diody LED. Zamknij drzwiczki kasetonu, aby zapobiec przypadkowemu wystawieniu na działanie światła w pomieszczeniu. Przy około 5 HPF użyj lunety preparcyjnej, aby ocenić etap rozwoju zarodków zastępczych.
Wyjmij również owinięte naczynia, aby zapewnić równomierną ekspozycję na temperaturę we wszystkich naczyniach. Gdy zarodki proxy osiągną 40% epibolii, odkryj odsłonięte naczynie i umieść je na górnej półce kasetonu. Trzymaj nieodsłonięte naczynie przykryte na dolnej półce.
Natychmiast włącz niebieskie światło, zamknij drzwi i ustaw timer na 20 minut. Aby przygotować się do mocowania, wyeliminuj jak najwięcej światła w pomieszczeniu. Tuż przed utrwaleniem weź probówki zawierające 4% formaldehydu z 4 stopni Celsjusza i umieść je obok kasetonu.
Po 20 minutach otwórz drzwiczki kasetonu i wyjmij naczynie, które nie było wystawione na działanie światła. Użyj końcówki pipety z płomienistego szkła, aby usunąć wrażliwe na światło zarodki z naczynia. Następnie, aby zanurzyć zarodki w 4% formaldehydzie, zanurz końcówkę pipety z płomieniowanego szkła w formaldehydzie i pozwól zarodkom zanurzyć się w płynie.
Przechowuj utrwalone zarodki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku testu fenotypowania należy przeprowadzić eksperyment ekspozycji na światło na zarodki danio pręgowanego z ekspresją bOpto-BMP i bOpto-Nodal i usunąć je z kasety świetlnej w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu w temperaturze od 24 do 32 HPF. Korzystając z zakresu preparacyjnego, oceń fenotypy i ustal rubrykę punktacji.
Dla wygody oceniaj zarodki, gdy pozostają w kosmówce. Użyj pipety do sondowania, aby zmienić położenie zarodków do oglądania pod różnymi kątami. W teście immunofluorescencyjnym, po inkubacji zarodków w 4% formaldehydzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, usuń formaldehyd i spłucz je trzy do pięciu razy PBST.
Wyrzuć PBST i dodaj 100% metanolu. Zamknij probówki i delikatnie je odwróć, aby wymieszać resztki PBST i metanol. Po dwukrotnym umyciu zarodków metanolem przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, aż do kilku lat.
Za pomocą mikroskopu wyposażonego w sekcję optyczną uchwyć obrazy zarodków wybarwionych immunologicznie. Eksperymenty z barwieniem immunofluorescencyjnym z odpowiednimi ilościami mRNA i warunkami ekspozycji na światło wykazały, że poziomy pSmad były podobne w zarodkach bez wstrzyknięć i nieeksponowanych, podczas gdy zarodki poddane wstrzyknięciu ekspozycji na światło wykazywały wyższe poziomy fosforylacji Smad.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje zastosowanie manipulacji optogenetycznych w celu zbadania szlaków sygnalizacyjnych w embrionach danio pręgowanego. Wykorzystując narzędzia światłoczułe, badacze dążą do zrozumienia, w jaki sposób komórki embrionalne dekodują sygnały odpowiedzialne za decyzje dotyczące losów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Optogenetyka
Wstęp
- Szlaki sygnalizacyjne są kluczowe dla ustalenia planu budowy ciała zarodka.
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę nad aktywacją sygnalizacji.
- Zarodki danio pręgowanego służą jako model do badania wczesnego rozwoju.
- Zrozumienie dekodowania sygnałów może ujawnić mechanizmy rozwoju oraz powstawania chorób.
Cel badania
- Manipulacja sygnalizacją BMP i Nodal w embrionach danio pręgowanego.
- Badanie sposobów, w jakie komórki podejmują wczesne decyzje dotyczące losów komórkowych na podstawie sygnalizacji.
- Poprawa kontroli eksperymentalnej nad szlakami sygnalizacyjnymi z wykorzystaniem światła.
Zastosowane metody
- Przygotowanie narzędzi światłoczułych do aktywacji sygnalizacji.
- Iniekcja mRNA do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki.
- Wykorzystanie pudełka świetlnego do kontrolowanej ekspozycji na światło podczas eksperymentów.
- Ocena etapów rozwoju i fenotypów po ekspozycji.
Główne wyniki
- Ekspozycja na światło spowodowała wyższy poziom fosforylacji Smad w wstrzykniętych embrionach.
- Warunki eksperymentalne pozwoliły na precyzyjne modyfikacje sygnalizacji.
- Komórki embrionalne wykazały zdolność do dekodowania sygnalizacji w celu podejmowania decyzji o losie komórkowym.
- Analizy immunofluorescencyjne dostarczyły informacji na temat przebiegu rozwoju.
Wnioski
- Narzędzia optogenetyczne pogłębiają zrozumienie sygnalizacji embrionalnej.
- Podejście to może doprowadzić do postępów w badaniach nad biologią rozwoju.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dalsze implikacje w zakresie regeneracji i chorób.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optogenetyczna aktywacja sygnalizacji BMP i Nodal w embrionach danio pręgowanego umożliwia precyzyjne i odwracalne badanie szlaków rozwojowych krytycznych dla wczesnych decyzji dotyczących losu komórek. Platforma ta dostarcza badaniom biofarmaceutycznym R&Zespoły dysponują regulowalnym systemem o wysokiej rozdzielczości do analizy funkcji szlaków oraz minimalizacji ryzyka w hipotezach dotyczących celów terapeutycznych w modelu kręgowca. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i dostarcza podstaw do strategii translacyjnych dla programów rozwojowych i regeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji rozwojowej w żywym systemie kręgowców.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolowanie efektów specyficznych dla danej ścieżki za pomocą aktywacji sterowanej światłem.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dzięki ilościowemu fenotypowaniu i odczytom z immunofluorescencji.
- Zwiększa pewność prognostyczną strategii modulacji ścieżek sygnałowych w portfelach we wczesnej fazie badań.
Przesiewy i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowane, optycznie kontrolowane systemy biologiczne dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki poprzez ocenę fenotypową oraz testy immunofluorescencyjne pSmad.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów dzięki jednolitym protokołom naświetlania i obchodzenia się z zarodkami.
- Przygotowuje stabilne platformy do oceny modulatorów szlaków w kontekście istotnym dla rozwoju.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie analizy szlaków sygnałowych z procesami rozwojowymi istotnymi dla danej choroby w modelu kręgowca.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie aktywacji szlaku z punktami końcowymi fenotypowymi i molekularnymi.
- Dostarcza informacji mechanistycznych, które pozwalają na optymalizację programów terapeutycznych w zakresie medycyny regeneracyjnej i rozwojowej z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół optogenetyczny wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących szlaków sygnałowych, ilościowe fenotypowanie oraz walidację molekularną w embrionach zebrafish.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez aktywację sygnalizacji sterowanej światłem.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty fenotypowe i molekularne do opracowywania testów.
- Analityka: Umożliwia pomiar aktywacji szlaku (pSmad) w oparciu o immunofluorescencję w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy modulację szlaku rozwojowego z biologią istotną dla chorób w układzie kręgowców.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę optogenetyczną, którą można dostosować do dodatkowych szlaków sygnalizacyjnych i systemów modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki eksperymentalne i umożliwia skalowalne, powtarzalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie funkcji szlaków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów rozwojowych i regeneracyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z zarodkami ryb zebrafish oraz wdrażania narzędzi optogenetycznych.
- Konieczny jest dostęp do systemów kontrolowanej ekspozycji na światło oraz infrastruktury do obrazowania ilościowego.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów oceny fenotypu i immunofluorescencji.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji dostarczania światła i ekspresji narzędzi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują penetrację światła, przepustowość zarodków oraz precyzyjny czas ekspozycji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:15
Injecting bOpto‐BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos
3:08
Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish
5:30
Evaluation of bOpto‐BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment
