Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej
September 15th, 2023
Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.
Dlatego nasz zespół ma na celu zrozumienie mechanizmów patogeniczności grzybów w roślinach, aby poprawić zarządzanie chorobami. Obecnie badamy, w jaki sposób autochtoniczny grzyb kukurydzy reguluje wydzielanie białka poza swoją funkcją porządkową. Nasz protokół wykazuje wysoką synchronizację między replikacjami i odtwarzalność kolonizacji grzybów.
Ponadto dzięki naszym testom nie ma potrzeby oczyszczania ani utrwalania próbek przed ich obrazowaniem w czasie rzeczywistym. Metoda ta oferuje różnorodne zastosowania w interakcjach roślina-patogen i przyczyniła się do szczegółowych badań nad mechanizmami patogeniczności grzybów w kukurydzy oraz porównawczej analizy genomicznej. Na początek użyj wytrzymałych nożyczek lub nożyc, aby odciąć nasadkę i 0,5 milimetra od stożkowego dna 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.
Umieść kawałek waty szklanej w wyciętej rurce, aby zakryć środkowy otwór. Umieść jeden zmontowany filtr z waty szklanej w sterylnej 1.5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i oznacz probówkę. Następnie pokrój 96-dołkową płytkę PCR bez listwy na sześć dwukolumnowych stojaków wsporczych.
Odwróć stojaki dwukolumnowe tak, aby stożkowe dna studzienek były skierowane do góry. Umieść ruszt na szklanej szalce Petriego zawierającej wilgotną bibułę filtracyjną i przykryj go pokrywką, aby utworzyć komorę wilgotnościową dla osłon liści. Aby zebrać konidia z zarodnikującego colletotrichum graminicola, dodaj do płytki trzy do czterech mililitrów sterylnej wody dejonizowanej.
Używając sterylnego tłuczka ze stożkową końcówką, zeskrob równomiernie na całej płytce, aby poluzować zarodniki z agaru. W asepcie dodaj jeden mililitr zawiesiny zarodników na jednostkę filtrującą z waty szklanej i pozwól zarodnikom spłynąć grawitacyjnie do probówki zbiorczej. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę zarodników o sile 3,500 G przez pięć minut i odlać płyn do pojemnika nadającego się do sterylizacji w autoklawie.
Dodaj jeden mililitr sterylnej wody dejonizowanej do probówki zbiorczej i delikatnie zamieszaj, aby ponownie zawiesić granulowane zarodniki. Ponownie odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić zarodniki do oceny ilościowej w 300 do 500 mikrolitrach wody dejonizowanej. Użyj hemocytometru pod mikroskopem złożonym w stukrotnym powiększeniu, aby określić stężenie zarodników.
Następnie przygotuj 500 000 zarodników na mililitr zawiesiny z wodą dejonizowaną. Aby usunąć pochwę z pierwszego prawdziwego liścia siewek drugiego etapu, przesuń miniaturę wzdłuż zachodzącego na siebie brzegu pochwy i delikatnie poluzuj ją od pędu. Pokrój odzyskaną pochwę liściową na segmenty o długości od trzech do pięciu centymetrów.
Ostrożnie rozwiń każdy segment, aby odsłonić wewnętrzną warstwę naskórka. Nałóż 20 mikrolitrów zawiesiny zarodników grzybów na wewnętrzną powierzchnię pośrodku pochewki powyżej środkowego żebra. Umieść zaszczepione pochwy liściowe poziomo ze środkowym żebrem umieszczonym u dołu w szklanej płytce Petriego zawierającej zwilżoną bibułę filtracyjną.
Następnie umieść małe komory wilgotnościowe w przezroczystym pudełku do przechowywania wyłożonym zwilżoną bibułą do kiełkowania. Przykryj pojemnik do przechowywania pokrywką i inkubuj w temperaturze 23 stopni Celsjusza pod ciągłym oświetleniem przez zamierzony czas. Regularnie sprawdzaj pola pod kątem oznak choroby na pochwach.
Na początek delikatnie opłucz pochwy liści kukurydzy zaszczepione zarodnikami grzybów w wodzie dejonizowanej. Umieść osłonę na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym z powierzchnią adaksjalną skierowaną w dół, a powierzchnią osiową do góry. Za pomocą żyletki z pojedynczą krawędzią przytnij około jednego centymetra od końców pochwy i usuń większość tkanki blaszki po obu stronach środkowego żebra.
Trzymaj żyletkę pod kątem 90 stopni, aby ogolić tkankę ze środkowego żebra odgarstkowego, odsłaniając warstwę naskórka na powierzchni adaksjalnej powyżej zaszczepionego miejsca. Ostrożnie podnieś część osłony z jednej krawędzi i przenieś ją na nowy szkiełko z powierzchnią adaksjalną skierowaną do góry, najbliżej soczewki obiektywu. Nanieść 60 mikrolitrów wody dejonizowanej na sekcję i umieścić szklane szkiełko nakrywkowe bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Stenocarpella maydis szybko atakowała komórki naskórka bezpośrednio przez niezróżnicowane obrzęki strzępek. Podczas gdy colletotrichum graminicola wytwarzał melanizowaną apresorię. Barwienie błękitem trypanowym ujawniło naturę i zakres kolonizacji strzępek grzybów, przy czym C graminicola początkowo inatakowała przez grube strzępki pierwotne, a później przeszła w stadium nekrotroficzne.
C graminicola atakuje żywe komórki kukurydzy za pomocą grubych strzępek pierwotnych oddzielonych od cytoplazmy gospodarza błoną. W przeciwieństwie do tego, S matus wytwarza fitotoksynę, która zabija komórki naskórka przed ich inwazją. U C graminicola wytwarzanie ciemnobrązowego osadu w osłonkach liści kukurydzy wskazywało na wybuch oksydacyjny związany z odpowiedzią oporności gospodarza.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na zoptymalizowanym protokole inokulacji, wykorzystującym oderwane pochwę liściową kukurydzy w celu zbadania interakcji między kukurydzą a patogenami grzybiczymi. Metoda ta umożliwia badanie interakcji komórkowych w tkankach niefikowanych w czasie rzeczywistym, co poprawia reproduktywalność wyników eksperymentów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Interakcje roślina-patogen
- Mechanizmy patogenności grzybów
- Kukurydza jako organizm modelowy
Tło
- Rozumienie patogenności grzybów jest kluczowe dla poprawy zarządzania chorobami roślin.
- Poprzednie metody często wymagały czyszczenia lub fiksacji próbek, co ograniczyło obserwację w czasie rzeczywistym.
- Obserwacje w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów odporności i podatności roślin.
Stosowane metody
- Protokół inokulacji oderwanej pochw liściowej kukurydzy
- Wykorzystanie grzyba Colletotrichum graminicola
- Obserwacje w czasie rzeczywistym bez fiksacji
Główne wyniki
- Protokół wykazał wysoką reproduktywalność i synchroniczność w kolonizacji przez grzyby.
- Obserwacje w czasie rzeczywistym wskazały na odmienne strategie inwazji grzybów.
- Wyniki ujawnili różnice w mechanizmach patogenności między grzybami.
Wnioski
- To badanie demonstruje nowatorskie i skuteczne podejście do badania interakcji kukurydza-grzyby.
- Wyniki mają zastosowanie do zrozumienia odporności na choroby kukurydzy i mogą wpłynąć na przyszłe praktyki rolnicze.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct live-cell imaging of fungal infection in detached maize sheaths enables high-resolution analysis of plant-pathogen interactions, supporting early discovery and mechanistic de-risking in crop protection R&D. This method provides reproducible, quantitative insights into fungal colonization strategies and host responses, informing target validation and translational research. Its real-time, fixation-free workflow enhances predictive confidence for disease resistance trait development and comparative genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of fungal pathogenicity mechanisms in living plant tissue.
- Supports functional validation of candidate resistance genes and effector proteins.
- Facilitates mechanistic de-risking by visualizing host-pathogen interactions in real time.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible infection assays for comparative evaluation of fungal strains.
- Generates optically clear, live samples suitable for high-content imaging and quantitative analysis.
- Enables rapid assessment of protein localization using fluorescently tagged fungal strains.
- Supports scalable screening of host or pathogen genetic variants for functional impact.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling extraction of nucleic acids, proteins, and metabolites from infected tissue.
- Provides continuity from early mechanistic studies to preclinical validation of disease resistance traits.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes or compounds targeting fungal pathogenicity.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for crop protection and plant biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for fungal infection and host defense.
- Screening: Provides reproducible, quantitative infection assays for evaluating genetic or chemical interventions.
- Analytics: Enables real-time measurement of infection progression, protein localization, and host response markers.
- Translational Research: Facilitates extraction and analysis of molecular biomarkers from infected tissue.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse fungal pathogens and maize genotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of plant-pathogen interactions.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of infection assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for resistance trait development and comparative genomics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes, proteins, or interventions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant pathology, microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and molecular biology infrastructure for sample processing.
- Demands cross-team standardization of inoculation, imaging, and data analysis protocols.
- Adaptable to different maize genotypes and fungal species with protocol optimization.
- Live-cell imaging duration and tissue viability may limit extended time-course studies.
