Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Moje laboratorium zajmuje się badaniem mikroRNA i od dziesięcioleci wiemy, że mikroRNA są wyczerpane w raku. Jednak mechanizm utraty tych mikroRNA nie został aktywnie poznany. Nasze ostatnie prace nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi sugerują, że mikroRNA, które są zubożone w raku, są aktywnie ładowane do tych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Naszym celem jest teraz dotarcie do mechanizmu, w jaki sposób te RNA są aktywnie ładowane do tych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w procesie nowotworzenia. Protokół pomaga zrozumieć i uchwycić dynamiczny proces uwalniania mikroRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co jest jednym z trudnych obszarów w badaniu biologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Nasze odkrycia stanowią narzędzie do postępu w badaniach nad szlakami regulującymi wyczerpywanie się mikroRNA w nowotworach.

Planujemy zidentyfikować funkcjonalne i fenotypowe konsekwencje utraty określonych podzbiorów mikroRNA przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w raku. Po zidentyfikowaniu czynników, które są zaangażowane w ładowanie tych mikroRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, naszym celem jest obniżenie tych czynników i ocena konsekwencji fenotypowych. Co więcej, ponieważ zidentyfikowaliśmy motyw, który jest zawarty w tych małych RNA, jesteśmy ciekawi, czy ten motyw jest zarówno konieczny, jak i wystarczający do załadowania tych RNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Na początek weźmy komórki Calu-6 transfekowane fluoroforowym mikroRNA EV i mikroRNA komórki. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nasadkę sitową o długości 35 mikrometrów, dołączoną do okrągłodennych probówek z polistyrenu FACS. Następnie ustaw przyrząd do cytometrii przepływowej, włącz cytometr przepływowy i pozwól mu się rozgrzać przez 30 minut przed użyciem.

Zalać układ fluidyczny płynem osłonowym. Następnie sprawdź i dostosuj wyrównanie lasera. W celu kontroli jakości załaduj ultraczystą przefiltrowaną wodę do cytometru przepływowego i uruchom go z odpowiednim natężeniem przepływu, zapewniając odpowiedni czas pozyskiwania.

Następnie ustaw próg przechwytywania sygnału z ogniw Calu-6 na FSC 5 000. Aby uwzględnić nakładanie się widmowe między fluoroforami, należy przygotować kontrole kompensacyjne przy użyciu komórek nietransfekowanych i komórek transfekowanych tylko fluoroforem. Wykonaj analizę ekspresji w transfekowanych komórkach przy użyciu kanałów FSC, SSC, FITC i PE ustawionych odpowiednio na 258, 192, 269 i 423 jednostki napięcia.

Następnie wprowadzić ujemną próbkę kontrolną do cytometru przepływowego. Przechwytuj sygnały komórkowe po zdefiniowaniu intensywności FSC i SSC w niestandardowym arkuszu. Wybierz FSC dla osi x i SSC dla osi y na wykresie.

Narysuj wielokąt wokół interesującej populacji, aby utworzyć bramę na osi. Aby utworzyć nowy wykres przy użyciu bramkowanej populacji, ustaw oś x na sygnał fluorescencyjny jeden do wykrywania mikroRNA komórki, a oś y na sygnał fluorescencyjny drugi do wykrywania EV-microRNA. Ustal parametry kompensacji dla poszczególnych fluoroforów za pomocą komórek niezależnie transfekowanych każdym z fluorescencyjnie znakowanych mikroRNA.

Analiza cytometrii przepływowej komórek transfekowanych mikroRNA i mikroRNA EV wykazała sekwencyjny spadek sygnału fluorescencyjnego odpowiadającego mikroRNA EV. Natomiast sygnał odpowiadający mikroRNA komórki został zatrzymany w komórkach, co wskazuje, że fluorofor nie wpływa na zatrzymywanie mikroRNA przez komórki. Na początek weźmy EV wyizolowane z komórek Calu-6 transfekowanych fluoroforowym mikroRNA EV i mikroRNA komórki.

Rozcieńczyć EV w odpowiedniej objętości ultrafiltrowanego PBS, aby przygotować zawiesinę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej. Użyj cytometrii nanoprzepływowej do analizy nanocząstek o rozmiarach nano. Uruchom oprogramowanie i skonfiguruj przyrząd zgodnie z zalecanymi instrukcjami kalibracji.

Używając wydajnych nanokulek, przeprowadź test wydajności. Wydajność instrumentu jest uważana za optymalną, jeśli nanokulki są wykrywane w standardowym zakresie rozmiarów. Określ odpowiednie natężenie przepływu do wykrywania cząstek EV.

Teraz przeprowadź kontrolę jakości przy użyciu ultra czystej filtrowanej wody, aby zweryfikować płynność instrumentu i ocenić wydajność detektorów i laserów. Skonfiguruj parametry, aby ocenić czułość i rozdzielczość różnych populacji w mieszance kulek zgodnie z protokołem producenta. Następnie zastosuj odpowiednie bramkowanie, aby odróżnić populację koralików od szumu instrumentu.

Następnie dokładnie zwiruj próbki, aby zapewnić równomierny rozkład EV przed załadowaniem ich do analizy. Uruchom oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej i wprowadź ultrafiltrowany PBS. Korzystając z ultra filtrowanego PBS, ustaw bramkowanie dla cząstek EV, upewniając się, że bramkowanie odpowiada odpowiedniej wielkości cząstek na podstawie kalibracji.

Weź EV, które zostały przeniesione i zawirowane w tubie kompatybilnej z Attune i załaduj rurkę do instrumentu. Przechwytuj sygnały EV podczas wykreślania FSC na osi x i SSC na osi y. Do wykrywania komórki-mikroRNA, na osi x, wybierz sygnał fluorescencyjny jeden, a do detekcji EV-microRNA na osi y, wybierz sygnał fluorescencyjny drugi.

Korzystając z próbek EV wyizolowanych z komórek transfekowanych pojedynczym mikroRNA, ustal parametry kompensacji dla fluoroforów. Cytometria przepływowa ujawniła zależną od czasu akumulację miR-451a Alexa Fluor 488 w pojazdach elektrycznych, co wspiera efektywne pakowanie i uwalnianie. Natomiast fluorescencja komórki-miR-67 nie została zaobserwowana w EV.