Name: Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Poznaj technikę wstrzyknięcia dooponowego u nowonarodzonych myszy do edycji genomu i dostarczania leków do układu nerwowego. Metoda zapewnia bezpieczniejszą alternatywę dla iniekcji komorowych przy zachowaniu skuteczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XNL jest wspierany przez Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ jest również wspierany przez FAST i NIH Grant R01HD110195 i R01MH117289.

Opisane procedury i protokoły były zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Dodatkowo procedury uzyskały aprobatę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Yale University School of Medicine. Do prezentowanych badań wykorzystano nowonarodzone myszy typu dzikiego (WT) C57BL/6J samce i samice. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie miejsca pracy
<ol>
	<li>Najpierw przygotuj następujące elementy: mokry lód do krioznieczulenia, pustą klatkę do oddzielenia szczeniąt od matki, mikroskop preparacyjny, źródło światła, czystą powierzchnię do umieszczenia zwierzęcia podczas wstrzyknięcia, waciki, poduszkę grzewczą, strzykawkę 25/10 μl i igłę 34 G/ 0,375"/ 12 stopni (patrz Tabela materiałów). 
UWAGA: Krioznieczulenie dla szczeniąt myszy przy użyciu mokrego lodu jest opcjonalnym krokiem mającym na celu ułatwienie obsługi, zmniejszenie ruchu szczeniąt i zminimalizowanie potencjalnego dyskomfortu zwierzęcia. Ten etap krioanestezjologii może również przynieść korzyści w postaci obniżenia ciśnienia śródczaszkowego i zmniejszenia powikłań związanych z objętością9,10.</li>
	<li>Przenieś szczenięta do oddzielnej klatki z dala od matki podczas obchodzenia się z nimi.</li>
	<li>Zważ każde szczenię i udokumentuj jego wagę.</li>
	<li>Wytrzyj tylną część myszy gazą i etanolem. Potwierdź przestrzeń międzykręgową lub co najmniej linię środkową kanału kręgowego (która powinna być czerwona u szczeniąt P1) za pomocą mikroskopu preparacyjnego (film uzupełniający 1).</li>
</ol>
2. Procedura iniekcji
<ol>
	<li>Aby znieczulić pojedyncze szczenię, delikatnie umieść je na wodoodpornej barierze, takiej jak rękaw lateksowy lub folia aluminiowa, na kąpieli lodowej na 3-5 minut. Ważne jest, aby unikać pozostawiania zwierzęcia na lodzie przez dłuższy czas, ponieważ może to stwarzać potencjalne ryzyko powikłań związanych z hipotermią, w tym migotania komór, niedotlenienia tkanek i kwasicy metabolicznej. 
	UWAGA: Czas trwania 3-5 minut może się różnić w zależności od przypadku. Oceń objawy znieczulenia, takie jak brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, aby określić odpowiedni czas trwania.</li>
	<li>Gdy zwierzę znajduje się na lodzie, napełnij strzykawkę 10 μl preparatu leczniczego, preparatu wirusowego lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego itp. 
	UWAGA: Podczas fazy uczenia się rozważ opcję wstrzyknięcia tej samej objętości zmieszanego 1% barwnika Fast Green z materiałami do dostarczania (patrz Tabela materiałów). Może to pomóc w wizualizacji procesu wstrzykiwania oraz pomóc w nauce i doskonaleniu techniki. Szczenięta, którym wstrzyknięto Fast Green Dye lub podobne materiały, powinny zostać poddane eutanazji wkrótce po wstrzyknięciu zgodnie z zatwierdzonym protokołem, ponieważ materiały te mogą powodować reakcje zapalne lub inne skutki uboczne u zwierząt.</li>
	<li>Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza zmniejszony ruch ciała lub jego brak, delikatnie umieść szczenięta pod mikroskopem.</li>
	<li>Lewym palcem wskazującym i kciukiem ostrożnie zbadaj palpacyjnie przestrzeń międzykręgową wzdłuż linii środkowej, znajdującą się między obustronnymi obręczami miednicznej (Dodatkowe wideo 1). Delikatnie obróć lekko podstawę ogona, aby pomóc zidentyfikować linię środkową kręgosłupa.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy ustawić skos igły w kierunku głowy zwierzęcia.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę, przechylając ją lekko pod kątem 70°-80° w miejscu przecięcia wgłębienia, upewniając się, że strzykawka pozostaje wyrównana z centralną płaszczyzną strzałkową. Gdy igła zetknie się z kością, stopniowo zmniejszaj kąt do około 30°, a następnie wsuń igłę o około 2 mm w przestrzeń międzykręgową. 
	UWAGA: Zdolność igły do lekkiego uniesienia całego ciała jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń oponową wewnątrzoponową.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć do 10 μl objętości w ciągu 50-60 s. Trzymaj igłę na miejscu przez 10-20 s po zakończeniu podawania. Wyjmować igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć wycieku. 
	UWAGA: Móżdżek zmieni kolor na zielony przed wycofaniem igły. Ponadto powolne parcie ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia śródczaszkowego związanego z porodem i zminimalizować potencjalne powikłania. Opierając się na naszym doświadczeniu z iniekcjami u ponad 500 szczeniąt, dostarczanie objętości 10 μl w ciągu 50-60 s jest optymalne.</li>
</ol>
3. Po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Przyłóż bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia, jeśli występuje wyciek lub krew. 
	UWAGA: W większości przypadków nie powinno ich być. Z naszego doświadczenia wynika, że szczenięta leczone ze śladami wycieku lub krwi są nadal użyteczne, ale podczas analizy danych może być konieczne rozważenie zmniejszonej dawki leków lub leczenia.</li>
	<li>Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i odczekaj 10-15 minut, aby szczenięta w pełni się zregenerowały i ponownie rozgrzały. Uważnie obserwuj szczenięta, aby upewnić się, że są czujne i aktywnie się poruszają, zanim wrócisz do klatki domowej. Na odpowiednią regenerację myszy wskazuje przywrócenie różowego koloru skóry, zwiększenie spontanicznych ruchów ciała i reagowanie na dotyk.</li>
	<li>Umieść szczeniaka z powrotem w klatce domowej i upewnij się, że szczenię jest odpowiednio przykryte ściółką, gniazdem lub jednym i drugim. Gwarantuje to, że młode otrzyma niezbędną opiekę matczyną ze strony matki.</li>
	<li>Oceniaj ogólny wygląd i aktywność codziennie przez co najmniej 3 dni po wstrzyknięciu. Chory wygląd i zmniejszona aktywność mogą zwiększać możliwość infekcji, skutków ubocznych związanych z leczeniem lub innych powikłań itp. W razie potrzeby skonsultuj się z lekarzem weterynarii.</li>
</ol>

A Comprehensive Protocol for Delivering Intrathecal Injections in Neonatal Mice

<ol><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onasemnogene+abeparvovec%3A+first+global+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Onasemnogene abeparvovec: first global approval.</a> Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).</li>
<li>Ramos, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+SMN+expression+in+disease-relevant+tissue+and+implications+for+SMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment.</a> J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).</li>
<li>Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+delivery+to+CNS+by+spinal+intrathecal+administration+to+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice.</a> J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).</li>
<li>Dindot, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ASO+therapy+for+Angelman+syndrome+that+targets+an+evolutionarily+conserved+region+at+the+start+of+the+UBE3A-AS+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript.</a> Sci Transl Med. 15, eabf4077(2023).</li>
<li>Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapy+for+the+nervous+system%3A+from+bench+to+bedside+with+emphasis+on+pediatric+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology.</a> Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+%CE%B2-Thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia.</a> N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).</li>
<li>Krol, A., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windows+of+opportunity%3A+timing+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders.</a> Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).</li>
<li>Birg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature+influences+intracranial+pressure+and+cerebral+perfusion+pressure+after+traumatic+brain+injury%3A+A+CENTER-TBI+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study.</a> Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).</li>
<li>Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature%2C+body+core+temperature%2C+and+intracranial+pressure+in+acute+cerebral+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. 91, e51863(2014).</li>
<li>Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+clinical+trial+with+repeated+intrathecal+injections+of+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).</li>
<li>Kroin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+intracranial+pressure+modulation+by+epidural+blood+and+other+injectates+in+a+postdural+puncture+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model.</a> Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).</li>
<li>Møllgård, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesothelium+divides+the+subarachnoid+space+into+functional+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments.</a> Science. 379 (6627), 84-88 (2023).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8, e67680(2013).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).</li>
</ol>

YHJ jest współzałożycielem Couragene, ale w przypadku tego projektu nie ma konfliktu interesów.

Opisano krok po kroku procedurę wstrzykiwania dooponowego u nowonarodzonych myszy (P1), powodującą powszechną dystrybucję leku w ich mózgach. W porównaniu z powszechną metodą iniekcji domózgowo-komorowej do dostarczania leków noworodkom myszy, która polega na przekłuciu kory mózgowej11, wstrzyknięcie dooponowe pozwala uniknąć bezpośredniego uszkodzenia mózgu nowonarodzonej myszy z powodu penetracji igły. Ze względu na minimalną inwazyjność, wstrzyknięcie dooponowe może być wykonywane wielokrotnie, gdy jest to konieczne, symulując wielokrotne podawanie ludziom w warunkach klinicznych12.
Zmiany ciśnienia śródczaszkowego są często związane z wstrzyknięciem dooponowym13, co może prowadzić do odrzucenia matki i odmowy karmienia z powodu zmian w zachowaniu młodych. Nie zaobserwowano jednak ostrych zmian w zachowaniu ani zmniejszonej przeżywalności wśród młodych, którym wstrzyknięto zastrzyk. Podobnie, nietypowe lub nietypowe zachowania związane z wstrzyknięciami dooponowymi u dorosłych nie zostały zauważone (dane nie pokazane).
Do sukcesu mogło przyczynić się kilka wskazówek technicznych, które warto podkreślić. Wolniejsze tempo wstrzykiwania jest prawdopodobnie ważnym czynnikiem. Dodatkowo krioanestezjoaneksja może obniżyć ciśnienie śródczaszkowe przed wstrzyknięciem, minimalizując przepływ wsteczny podczas wstrzyknięcia dooponowego i zmniejszając inne powikłania. Wreszcie, precyzja miejsca wstrzyknięcia może również mieć wpływ na wskaźnik sukcesu.
Aby osiągnąć najlepszą skuteczność poprzez podanie dokanałowe, kluczowe znaczenie ma wykonanie zabiegu jak najszybciej po urodzeniu szczeniąt. Leki i inne substancje dostarczane we wstrzyknięciu dooponowym dostają się do przestrzeni dooponowej, która jest przestrzenią między warstwami pajęczynówki i pia mater opon mózgowo-rdzeniowych, które otaczają mózg i rdzeń kręgowy. Dlatego leki dostarczane we wstrzyknięciu dooponowym przechodzą przez te warstwy opon mózgowych12. U gryzoni, podobnie jak u ludzi, opony mózgowe składają się z trzech warstw: opony twardej, pajęczynówki i opony twardej14. Błony te tworzą się podczas rozwoju embrionalnego i osiągają pełną dojrzałość w 2. dniu po urodzeniu (P2)15. Dlatego zaleca się stosowanie protokołu szybkiego genotypowania w celu przypisania szczeniąt do grup eksperymentalnych w ciągu kilku godzin, szczególnie w przypadku eksperymentów z udziałem genotypów zwierzęcych, takich jak eksperymenty z edycją genów. Im wcześniej młode zostaną wstrzyknięte, tym lepszy wynik. Iniekcje są zazwyczaj wykonywane w ciągu 3 godzin po urodzeniu. To okno czasowe pozwala wstrzykiwanym lekom podążać za przepływem płynu mózgowo-rdzeniowego do miąższu mózgu, podczas gdy wyściółka wyściółki jest nadal niedojrzała i mniej dotknięta wielkością cząstek leku. Warto zwrócić uwagę na różnice rozwojowe między ludźmi a myszami. Nowonarodzone myszy P1 odpowiadają późnemu etapowi ciąży rozwoju ludzkiego mózgu16. Wyniki eksperymentów na nowonarodzonych myszach z P1 służą jako cenny dowód słuszności koncepcji, ale należy zachować ostrożność przy ekstrapolacji tych wyników na ludzi w projektach badań translacyjnych.
Technika ta jest wyzwaniem ze względu na ograniczone okno czasowe administracji i zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowanych eksperymentatorów. Wysoka śmiertelność może być związana z zabiegiem, jeśli eksperymentator nie ma doświadczenia. Wąskie ramy czasowe wymagają jednak zwiększonego poziomu precyzji i powtarzalności w ramach badań i między nimi. Ponadto, przy odpowiedniej praktyce, biegłość i wskaźnik sukcesu tej metody można znacznie zwiększyć.
Jeśli zastrzyki są wykonywane prawidłowo, na przeżycie młodych, którym wstrzyknięto zastrzyk, wpływa przede wszystkim opieka matczyna. Zaleca się przygotowanie par zastępczych samic dla swoich celów. Jeśli docelowe młode nie mają plamki mlecznej na brzuchu po południu w dniu wstrzyknięcia, należy je natychmiast przenieść do przybranej samicy. Samice myszy rozpoznają swoje dzieci po zapachu. Dlatego tak ważne jest, aby unikać wprowadzania do młodych nieznanych zapachów od eksperymentatorów lub niepowiązanych matek w trakcie i po zabiegu. Konieczność wykorzystania przybranych samic powinna być jednak oceniana w odniesieniu do indywidualnych eksperymentów. Zaleca się również wykonanie zabiegu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, najlepiej w dygestoriowym dygestorium. Pomocne jest również mieszanie szczeniąt z ściółką i odchodami matki. Po wstępnej kontroli pozabiegowej zaleca się zminimalizowanie zakłóceń w zaporze przez co najmniej 3 dni w celu zmniejszenia stresu. Jak w przypadku każdego zabiegu chirurgicznego, należy wziąć pod uwagę ryzyko infekcji pozabiegowej. Dlatego podczas wstrzykiwania należy ściśle przestrzegać dobrych praktyk laboratoryjnych dotyczących procedur sterylnych. Należy zauważyć, że ciśnienie dooponowe jest wyższe niż w środowisku zewnętrznym, co zapewnia naturalną ochronę przed infekcją. Doświadczenie wskazuje, że częstość zakażeń po wstrzyknięciu jest rzadka. Zaleca się jednak codzienne monitorowanie ogólnego wyglądu i aktywności szczeniąt przez co najmniej 3 dni po wstrzyknięciu w celu wykrycia oznak i objawów infekcji lub innych powikłań. W szczególnych przypadkach konsultacja ze służbami weterynaryjnymi może być uzasadniona zamiast eutanazji szczeniąt z poważnymi powikłaniami.

Wstrzyknięcie dokanałowe (IT) jest powszechną procedurą kliniczną stosowaną do podawania leków, zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego i utrzymywania ciśnienia śródczaszkowego zarówno u pacjentów pediatrycznych, jak i dorosłych w klinikach1,2. Podawanie leków we wstrzyknięciu dooponowym jest skutecznym podejściem do zwiększania stężenia leków w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przy jednoczesnym zminimalizowaniu narażenia ogólnoustrojowego. W związku z tym metoda ta zwiększa skuteczność terapeutyczną i zmniejsza skutki uboczne, szczególnie w przypadku leków wrażliwych na temperaturę i o krótkim okresie półtrwania3.
W badaniach przedklinicznych testujących nowe leki i terapie z wykorzystaniem modeli gryzoni, konieczne jest zastosowanie niezawodnej metody podawania leków, która zapewnia większą precyzję i powtarzalność wyników4,5. W przypadku badań przedklinicznych oceniających nowe metody leczenia zaburzeń neurogenetycznych i neurorozwojowych, wczesne leczenie ma kluczowe znaczenie dla wstępnych badań potwierdzających słuszność koncepcji, ponieważ zwykle przewiduje się, że wcześniejsze interwencje przyniosą korzystniejsze wyniki6,7,8.
W porównaniu do konwencjonalnych iniekcji domózgowo-komorowych (ICV), zastrzyki IT niosą ze sobą znacznie mniejsze ryzyko, ponieważ eliminują potrzebę bezpośredniej penetracji przez korę mózgową. Ta zaleta znacznie zmniejsza potencjalne uszkodzenie regionalnej tkanki korowej i otaczających nerwów. Co więcej, zastrzyki IT pozwalają na co najmniej pięciokrotne zwiększenie możliwej do podania ilości leków za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia, co znacznie zwiększa wykonalność wielokrotnego podawania. Jednak ze względu na mały rozmiar i delikatną naturę nowonarodzonych myszy, wykonywanie zastrzyków dooponowych u nowonarodzonych szczeniąt jest technicznie trudne i wymaga specjalistycznych technik, sprzętu i skrupulatnej obsługi.
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi wykonywania iniekcji dokanałowych u nowonarodzonych szczeniąt P1. Podkreślono tu kluczowe względy i dobre praktyki laboratoryjne w celu zapewnienia spójności podawania oraz bezpieczeństwa i dobrostanu zwierząt podczas zabiegu. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą pewnie przeprowadzać eksperymenty z precyzją i powtarzalnością, jednocześnie minimalizując potencjalne ryzyko lub dyskomfort dla zwierząt.

<table><tbody><tr><td>Myszy Balance</td><td>Ohaus Corporation</td><td>30253017</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Mikroskop cyfrowy Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>DOM-1001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>RWD</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Hamilton</td><td>6PK (34/0.375"/4/12DEG)S</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>1702RN</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Sigma</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Wstrzyknięcie dooponowe jest powszechnie stosowaną procedurą zarówno w klinikach pediatrycznych jak i dla dorosłych, służąc jako skuteczny sposób podawania leków i leczenia. Poprzez bezpośrednie dostarczanie leków i zabiegów do płynu mózgowo-rdzeniowego ośrodkowego układu nerwowego, metoda ta pozwala osiągnąć wyższe miejscowe stężenia leków, jednocześnie zmniejszając ogólnoustrojowe skutki uboczne w porównaniu z innymi drogami, takimi jak wstrzyknięcia dożylne, podskórne lub domięśniowe. Jego znaczenie wykracza poza warunki kliniczne, ponieważ wstrzyknięcie dooponowe odgrywa istotną rolę w badaniach przedklinicznych skoncentrowanych na leczeniu zaburzeń neurogenetycznych u gryzoni i innych dużych zwierząt, w tym naczelnych innych niż ludzie. Jednak pomimo powszechnego zastosowania, wstrzyknięcie dooponowe u młodych, zwłaszcza nowonarodzonych szczeniąt, stanowi poważne wyzwanie techniczne ze względu na ich niewielkie rozmiary i delikatną naturę. Skuteczne i niezawodne podawanie wstrzyknięć dooponowych nowonarodzonym myszom wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły i starannego rozważenia różnych czynników. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania ustandaryzowanego protokołu, który nie tylko zawiera instrukcje, ale także podkreśla kluczowe kwestie techniczne i dobre praktyki laboratoryjne w celu zapewnienia spójności procedur, a także bezpieczeństwa i dobrostanu zwierząt.
Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, przedstawiamy szczegółowy i kompleksowy protokół wykonywania iniekcji dokanałowych, szczególnie u nowonarodzonych szczeniąt w 1. dniu po urodzeniu (P1). Postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku, naukowcy mogą bez obaw wykonywać zastrzyki dooponowe u nowonarodzonych szczeniąt, umożliwiając dokładne dostarczanie leków, oligonukleotydów antysensownych i wirusów w celu wymiany genów lub leczenia opartego na edycji genomu. Ponadto podkreśla się znaczenie przestrzegania dobrych praktyk laboratoryjnych w celu utrzymania dobrostanu zwierząt i zapewnienia wiarygodnych wyników eksperymentalnych. Protokół ten ma na celu sprostanie wyzwaniom technicznym związanym z iniekcjami dooponowymi u noworodków myszy, ostatecznie ułatwiając postępy w dziedzinie badań neurogenetycznych, które mają na celu opracowanie potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Skuteczne wstrzyknięcie do przestrzeni dokanałowej doprowadziło do natychmiastowego, szerokiego rozprowadzenia podanego roztworu, choć rzeczywista penetracja komórkowa zależała od charakteru dostarczonych leków i materiałów. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy Fast Green do wizualizacji bezpośrednich efektów po wstrzyknięciu dokanałowym (IT) u noworodków typu dzikiego (Rycina 1A-K) i porównaliśmy je z konwencjonalnym wstrzyknięciem do komór mózgowych (ICV) (Rycina 1L-N). Wyniki długoterminowe (10 dni po wstrzyknięciu) zbadano również z użyciem myszy reporterowych YFP aktywowanych poprzez dostarczenie narzędzi do edycji genów opartych na CRISPR/Cas97. Ekspresję YFP zaobserwowano w szerokim zakresie w całym mózgu myszy w porównaniu z myszami niepoddanymi działaniu CRISPR/Cas9 (Rycina 2). Przy większym powiększeniu ekspresję YFP zaobserwowano w większości komórek. Wstrzyknięcia wykonano u ponad 500 noworodków, a zabieg przeżyło ponad 98% wstrzykniętych młodych. Nie zaobserwowano szkodliwego wpływu na długoterminowe przeżycie i stan zdrowia leczonych młodych (Rycina dodatkowa 1).
<img alt="Obiekty wstrzyknięte i niewstrzyknięte, przekroje mózgu, rozkład barwnika w czasie, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65761/65761fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Rozkład czasowy i przestrzenny barwnika Fast Green w mózgach myszy. (A) Obserwacja makroskopowa myszy, porównanie myszy wstrzykniętych i niewstrzykniętych 5 min po wstrzyknięciu dokanałowym. (B) Wizualizacja rozkładu barwnika Fast Green w mózgu myszy przed sekcją. (C-E) Rozkład barwnika w sekcjach mózgu 5 min po podaniu dokanałowym. (F-H) Rozkład barwnika w sekcjach mózgu 30 min po podaniu dokanałowym. (I-K) Rozkład barwnika w sekcjach mózgu 60 min po podaniu dokanałowym. (L-N) Dla porównania, rozkład barwnika w sekcjach mózgu 40 min po podaniu dokomorowym. Pasek skali: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/65761fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna móżdżku i kory; barwienie YFP i DAPI; analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65761/65761fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Długofalowe efekty edycji genów CRISPR/Cas9 podanej doglebowo. Rozległa ekspresja reportera YFP w mózgu myszy po doglebowym wstrzyknięciu systemu edycji genów CRISPR/Cas9: móżdżek (A-F), tylna kora (D-F) oraz kora przedczołowa (G-I). Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/65761fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Krzywa przeżywalności myszy z zespołem Angelmana po dokanałowej edycji genów metodą CRISPR. Krzywa przeżywalności przedstawiająca wyniki u myszy z zespołem Angelmana, które otrzymały edycję genów CRISPR poprzez podanie dokanałowe, w porównaniu z myszami nieleczonymi oraz myszami typu dzikiego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające 1: Procedura iniekcji dokanałowej u noworodków myszy. Film demonstrujący proces wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65761/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

Nasza grupa stosuje interdyscyplinarne podejście, które obejmuje odkrywanie genomu i modelowanie funkcjonalne w celu zbadania genetyki i epigenetycznych podstaw zaburzeń neurorozwojowych. Przeprowadzamy analizę molekularną, neurofizjologiczną i neurobehawioralną przy użyciu indukowanych przez pacjenta pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC u zmutowanych myszy w celu zbadania patofizjologii zaburzeń neurorozwojowych. Naszym celem jest opracowanie metody leczenia tej choroby opartej na edycji genów.Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe, zwane również wstrzyknięciem ICV, jest jedyną metodą bezpośredniego dostarczania leczenia do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy. Musi jednak przeniknąć przez korę mózgową. Dokanałowe wstrzyknięcie IT jest powszechnie stosowaną procedurą w klinikach, służącą jako skuteczny środek do podawania leków bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego.Jednak wstrzyknięcie dokanałowe u nowonarodzonych szczeniąt może stanowić poważne wyzwanie techniczne ze względu na ich niewielkie rozmiary i delikatną naturę. Staramy się opracować wydajną i niezawodną metodę dostarczania, aby przetestować skuteczność i edycję genów w mózgu myszy, który nie jest wirusowy i nie jest nanocząsteczką. W porównaniu z konwencjonalnym wstrzykiwaniem ICV, wstrzyknięcie dooponowe stanowi znacznie mniejsze ryzyko, ponieważ pozwala uniknąć konieczności bezpośredniej penetracji przez korę mózgową.Ta zaleta minimalizuje potencjalne uszkodzenia regionalnej tkanki korowej i otaczających nerwów. Wstrzyknięcia dooponowe umożliwiają również co najmniej pięciokrotne zwiększenie możliwej do podania objętości leków, a więc pojedynczego wstrzyknięcia i znacznie zwiększają widoczność powtarzanych podań. Na początek przenieś szczenięta do oddzielnej klatki z dala od matki podczas obchodzenia się z nimi.Przed rozpoczęciem procedury wstrzykiwania, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, należy potwierdzić przestrzeń międzykręgową lub co najmniej linię środkową kanału kręgowego szczeniaka. Załaduj strzykawkę o pojemności 25 lub 10 mikrolitrów z 10 mikrolitrami żądanej substancji do wstrzykiwań, takiej jak preparat leku, preparat wirusa lub sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy i tak dalej. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza zmniejszony ruch ciała lub jego brak, delikatnie umieść młode pod mikroskopem.Lewym palcem wskazującym i kciukiem ostrożnie dotykaj przestrzeni międzykręgowej wzdłuż linii środkowej, znajdującej się między obustronnymi obręczami miednicy. Delikatnie obróć lekko podstawę ogona, aby pomóc zidentyfikować linię środkową kręgosłupa. Ostrożnie włóż igłę, przechylając ją pod kątem od 70 do 80 stopni w miejscu, w którym przecina się wgłębienie, upewniając się, że pozostaje wyrównane z centralną płaszczyzną strzałkową.Gdy igła zetknie się z kością, stopniowo zmniejszaj kąt do około 30 stopni i przesuwaj igłę o około dwa milimetry w głąb przestrzeni międzykręgowej. Powoli wstrzyknąć do 10 mikrolitrów objętości w ciągu 50 do 60 sekund. Trzymać igłę na miejscu przez 10 do 20 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia.Wyjąć igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć przeciekania. Po wstrzyknięciu należy umieścić szczenię na poduszce grzewczej na 10 do 15 minut, aby szczenię mogło w pełni wyzdrowieć i ponownie się ogrzać. Podanie dokanałowego wstrzyknięcia szybkiej zieleni u noworodków typu dzikiego natychmiast spowodowało szerokie rozpowszechnienie podawanego roztworu.Myszy reporterowe YFP wykazywały powszechną ekspresję YFP w całym mózgu 10 dni po dokanałowym wstrzyknięciu edycji genów opartej na CRISPR-Cas9.

intrathecal-injection-newborn-mouse-for-genome-editing-drug

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Zamboni, M., et al., Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie do wnętrzełka. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę dostarczania induktora leku do cisterna magna znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie selektywnie indukuje ekspresję markerów fluorescencyjnych w komórkach powierzchni mózgu dostępnych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego, co potwierdza obrazowanie fluorescencyjne.

Celowane dostarczanie leków w modelu mysim za pomocą iniekcji Cisterna Magna

Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Poznaj technikę wstrzyknięcia dooponowego u nowonarodzonych myszy do edycji genomu i dostarczania leków do układu nerwowego. Metoda zapewnia bezpieczniejszą alternatywę dla iniekcji komorowych przy zachowaniu skuteczności.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Przeglądaj więcej filmów