Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków
8 marca 2024
Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.
Nasza grupa stosuje interdyscyplinarne podejście, które obejmuje odkrywanie genomu i modelowanie funkcjonalne w celu zbadania genetyki i epigenetycznych podstaw zaburzeń neurorozwojowych. Przeprowadzamy analizę molekularną, neurofizjologiczną i neurobehawioralną przy użyciu indukowanych przez pacjenta pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC u zmutowanych myszy w celu zbadania patofizjologii zaburzeń neurorozwojowych. Naszym celem jest opracowanie metody leczenia tej choroby opartej na edycji genów.
Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe, zwane również wstrzyknięciem ICV, jest jedyną metodą bezpośredniego dostarczania leczenia do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy. Musi jednak przeniknąć przez korę mózgową. Dokanałowe wstrzyknięcie IT jest powszechnie stosowaną procedurą w klinikach, służącą jako skuteczny środek do podawania leków bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego.
Jednak wstrzyknięcie dokanałowe u nowonarodzonych szczeniąt może stanowić poważne wyzwanie techniczne ze względu na ich niewielkie rozmiary i delikatną naturę. Staramy się opracować wydajną i niezawodną metodę dostarczania, aby przetestować skuteczność i edycję genów w mózgu myszy, który nie jest wirusowy i nie jest nanocząsteczką. W porównaniu z konwencjonalnym wstrzykiwaniem ICV, wstrzyknięcie dooponowe stanowi znacznie mniejsze ryzyko, ponieważ pozwala uniknąć konieczności bezpośredniej penetracji przez korę mózgową.
Ta zaleta minimalizuje potencjalne uszkodzenia regionalnej tkanki korowej i otaczających nerwów. Wstrzyknięcia dooponowe umożliwiają również co najmniej pięciokrotne zwiększenie możliwej do podania objętości leków, a więc pojedynczego wstrzyknięcia i znacznie zwiększają widoczność powtarzanych podań. Na początek przenieś szczenięta do oddzielnej klatki z dala od matki podczas obchodzenia się z nimi.
Przed rozpoczęciem procedury wstrzykiwania, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, należy potwierdzić przestrzeń międzykręgową lub co najmniej linię środkową kanału kręgowego szczeniaka. Załaduj strzykawkę o pojemności 25 lub 10 mikrolitrów z 10 mikrolitrami żądanej substancji do wstrzykiwań, takiej jak preparat leku, preparat wirusa lub sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy i tak dalej. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza zmniejszony ruch ciała lub jego brak, delikatnie umieść młode pod mikroskopem.
Lewym palcem wskazującym i kciukiem ostrożnie dotykaj przestrzeni międzykręgowej wzdłuż linii środkowej, znajdującej się między obustronnymi obręczami miednicy. Delikatnie obróć lekko podstawę ogona, aby pomóc zidentyfikować linię środkową kręgosłupa. Ostrożnie włóż igłę, przechylając ją pod kątem od 70 do 80 stopni w miejscu, w którym przecina się wgłębienie, upewniając się, że pozostaje wyrównane z centralną płaszczyzną strzałkową.
Gdy igła zetknie się z kością, stopniowo zmniejszaj kąt do około 30 stopni i przesuwaj igłę o około dwa milimetry w głąb przestrzeni międzykręgowej. Powoli wstrzyknąć do 10 mikrolitrów objętości w ciągu 50 do 60 sekund. Trzymać igłę na miejscu przez 10 do 20 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia.
Wyjąć igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć przeciekania. Po wstrzyknięciu należy umieścić szczenię na poduszce grzewczej na 10 do 15 minut, aby szczenię mogło w pełni wyzdrowieć i ponownie się ogrzać. Podanie dokanałowego wstrzyknięcia szybkiej zieleni u noworodków typu dzikiego natychmiast spowodowało szerokie rozpowszechnienie podawanego roztworu.
Myszy reporterowe YFP wykazywały powszechną ekspresję YFP w całym mózgu 10 dni po dokanałowym wstrzyknięciu edycji genów opartej na CRISPR-Cas9.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy, co umożliwia edycję genów oraz dostarczanie leków bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego. Technika ta ma na celu przezwyciężenie trudności związanych z delikatnością noworodków oraz poprawę niezawodności zabiegu bez uszkadzania otaczających tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Edycja genów
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Zaburzenia neurorozwojowe mogą przynieść korzyści z ukierunkowanej edycji genów.
- Iniekcje dokanałowe stanowią mniej inwazyjną alternatywę dla metod doplikierzkowych.
- Procedura ta jest szczególnie odpowiednia dla myszy noworodkowych ze względu na ich mały rozmiar i delikatność.
- Skuteczne metody dostarczania są kluczowe dla testowania wydajności edycji genów w modelach zwierzęcych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu podawania preparatów leczniczych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego.
- Zwiększenie bezpieczeństwa i skuteczności metod edycji genów w modelach mysich zaburzeń neurorozwojowych.
- Zbadanie rozprzestrzeniania się i efektów wstrzykniętych substancji po podaniu.
Zastosowane metody
- Technika iniekcji dokanałowej z wykorzystaniem noworodków myszy jako modelu biologicznego.
- Badano substancje takie jak formulacje leków oraz preparaty CRISPR-Cas9 w celu bezpośredniego podania do rdzenia kręgowego.
- Kluczowa jest precyzja: stosuje się strzykawki o określonych objętościach, co wymaga dokładnej identyfikacji anatomicznej.
- Kładzie się nacisk na opiekę poiniekcyjną oraz procesy rekonwalescencji szczeniąt.
Główne wyniki
- Pomyślne dostarczenie i rozprowadzenie roztworów w mózgu noworodka myszy potwierdzono po iniekcji.
- Po iniekcji dokanałowej zaobserwowano rozległą ekspresję reportera YFP w odpowiedzi na edycję genów.
- Metoda ta wykazała znacznie zwiększone objętości podawalne w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Niższe ryzyko uszkodzenia tkanek korowych zwiększa precyzję dostarczania genów.
Wnioski
- Badanie prezentuje innowacyjną i skuteczną technikę dostarczania leków oraz edycji genów w modelach noworodkowych.
- Podejście to umożliwia bezpieczniejsze interwencje w badaniach nad zaburzeniami neurorozwojowymi.
- Podkreśla ono znaczenie precyzyjnego celowania anatomicznego w poprawie skuteczności terapii ośrodkowego układu nerwowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni wtrysk dokanałowy u noworodków myszy umożliwia precyzyjne dostarczanie narzędzi do edycji genów oraz środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego, co rozwiązuje krytyczny problem w procesie odkrywania leków neurogenetycznych. Protokół ten ogranicza ekspozycję poza celem oraz uszkodzenia tkanek, co zapewnia większą pewność prognostyczną w ocenie skuteczności i bezpieczeństwa na wczesnych etapach. Standaryzacja tej metody zwiększa ciągłość translacyjną z modeli przedklinicznych do potencjalnych zastosowań klinicznych w zaburzeniach neurorozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę celów neurogenetycznych in vivo przy minimalnym zaburzeniu kory mózgowej.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie bezpośredniego dostarczenia odczynników do edycji genów oraz potencjalnych terapeutyków do OUN.
- Ułatwia rzetelną ocenę zaangażowania celu oraz wyników mechanistycznych w modelach noworodkowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system oceny związków i terapii genowych ukierunkowanych na OUN w kontrolowanych warunkach.
- Poprawia standaryzację analizy poprzez minimalizację zmienności proceduralnej i maksymalizację spójności dostarczania.
- Umożliwia ilościowy pomiar dystrybucji i ekspresji po podaniu do OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne metody dostarczania do klinicznych strategii podawania do przestrzeni dokanałowej w zaburzeniach neurogenetycznych.
- Wspiera decyzje o przejściu do kolejnych etapów badań z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając wiarygodnych danych dotyczących ekspozycji OUN w modelach noworodkowych.
- Ułatwia ocenę biomarkerów translacyjnych oraz długoterminowych wyników ekspresji genów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych nad terapiami skierowanymi na OUN, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a badaniami translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów neurorozwojowych poprzez bezpośrednią interwencję w OUN.
- Przesiewanie: Zapewnia zwalidowaną platformę do powtarzalnej oceny związków i terapii genowych w tkance OUN noworodków.
- Analityka: Wspiera ilościową ocenę dystrybucji w OUN, ekspresji genów oraz wyników fenotypowych po wstrzyknięciu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość między przedklinicznymi badaniami skuteczności a klinicznymi metodami podania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, skalowalny protokół do wielokrotnego zastosowania w programach badań neurogenetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w opracowywaniu terapii celowanych w OUN oraz w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność procesów dostarczania substancji do OUN noworodków.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dla portfeli neurogenetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów celowanych w OUN z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane przedkliniczne.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie obchodzenia się z noworodkami oraz precyzyjnego celowania anatomicznego.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu do mikroiniekcji i wsparcia obrazowania w celu dokładnego podania substancji.
- Konieczne jest rygorystyczne przestrzeganie zasad dobrostanu zwierząt oraz protokołów standaryzacji procedur.
- Może wymagać adaptacji dla różnych szczepów gryzoni lub większych modeli zwierzęcych w zależności od różnic anatomicznych.
- Ograniczenia dotyczące objętości i szybkości wstrzykiwania muszą być starannie zarządzane, aby uniknąć działań niepożądanych.
