Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych
17 maja 2024
Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.
Zacznij od zabezpieczenia usuniętego ludzkiego zęba na miejscu za pomocą kleszczy dentystycznych. Następnie wytnij ząb za pomocą tarczy diamentowej połączonej z rękojeścią dentystyczną i chłodziwem wodnym. Za pomocą koparki dentystycznej usuń tkankę miazgi z zęba.
Następnie za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego ostrożnie rozdrobnij tkankę miazgi na małe fragmenty. Następnie umieść te fragmenty w mini młynku do tkanek z PBS, aby utworzyć jednorodną mieszaninę. Przenieś zmielone fragmenty tkanek do 15-mililitrowej probówki i strawij je za pomocą mieszaniny kolagenazy typu pierwszego i rozdrobnij.
Inkubować tkankę w mieszaninie enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji zneutralizować enzymy. Następnie przenieś strawioną tkankę do 15-mililitrowej probówki i wiruj z prędkością 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym DMEM, uzupełnionym 10 do 20% FBS. W przypadku hodowli komórkowej ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.
Po dwóch do trzech dniach, za pomocą sterylnej pipety serologicznej, ostrożnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Następnie, w celu scharakteryzowania DPSC, włącz cytometr przepływowy i potwierdź charakter mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych komórek. Pomyślne różnicowanie DPSC na osteoblasty, adipocyty i chondrocyty potwierdza multipotencjalny charakter DPSC.
Czas podwojenia DPSC był zgodny z czasem zgłoszonym dla mezenchymalnych komórek macierzystych, co sugeruje zdrową i proliferacyjną populację komórek. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że większość DPSC była dodatnia dla CD-90, CD-73 i CD-105, potwierdzając ich tożsamość jako mezenchymalnych komórek macierzystych. Co więcej, mniej niż 2% komórek było dodatnich na CD-34, CD-45 i HLADR, co potwierdza brak znaczącego zanieczyszczenia komórek krwiotwórczych lub śródbłonka.
Przegląd
Niniejszy protokół kładzie nacisk na izolację, hodowlę i przechowywanie wielopotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zęba poprzez trawienie enzymatyczne. Przedstawia on ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adypocyty i chondrocyty.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad miazgą zęba
- Inżynieria tkankowa
Wprowadzenie
- Multipotencjalne komórki macierzyste mają istotny potencjał w medycynie regeneracyjnej.
- Miazga zęba jest bogatym źródłem komórek macierzystych.
- Trawienie enzymatyczne jest powszechną metodą izolacji tych komórek.
- Zrozumienie potencjału różnicowania jest kluczowe dla zastosowań terapeutycznych.
Cel badania
- Wyizolowanie i hodowla wielopotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zęba.
- Ocena zdolności różnicowania się tych komórek macierzystych.
- Opracowanie niezawodnego protokołu izolacji i przechowywania komórek macierzystych.
Zastosowane metody
- Zabezpieczenie wyekstrahowanego ludzkiego zęba za pomocą kleszczy stomatologicznych.
- Przecięcie zęba przy użyciu tarczy diamentowej i końcówki stomatologicznej.
- Usunięcie tkanki miazgi za pomocą ekskawatora stomatologicznego.
- Trawienie rozdrobnionej tkanki miazgi kolagenazą typu one oraz dispazą.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja wielopotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zęba.
- Komórki wykazały zdolność do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty.
- Protokół zapewnia precyzję i powtarzalność w hodowli komórek macierzystych.
- Wskazano na potencjalne zastosowania w medycynie regeneracyjnej.
Wnioski
- Protokół ten zapewnia niezawodną metodę izolacji komórek macierzystych.
- Multipotencjalne komórki macierzyste z miazgi zęba wykazują znaczący potencjał różnicowania.
- Dalsze badania mogą skupić się na zastosowaniach terapeutycznych w inżynierii tkankowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) umożliwia zespołom biofarmaceutycznym dostęp do stabilnego, multipotencjalnego źródła komórek do wczesnych etapów badań nad medycyną regeneracyjną. Standaryzowane protokoły ekstrakcji i walidacji DPSCs ograniczają niejednoznaczność biologiczną i zwiększają pewność prognostyczną w późniejszych analizach różnicowania oraz testach funkcjonalnych. Zdolność ta wzmacnia proces translacyjny, dostarczając powtarzalne i dobrze scharakteryzowane modele komórkowe do testowania hipotez terapeutycznych oraz oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek różnicowania komórek macierzystych istotnych dla celów regeneracyjnych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzanie tożsamości mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wielopotencjalności dzięki walidowanemu różnicowaniu trójliniowemu.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowane źródło komórek DPSC do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Gwarantuje powtarzalność dzięki ilościowej analizie markerów i kontrolowanym warunkom hodowli.
- Dostarcza zwalidowane populacje komórek do skalowalnych, gotowych do wdrożenia na platformach procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z regeneracyjnymi modelami chorób, umożliwiając różnicowanie w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki dobrze scharakteryzowanym populacjom komórek macierzystych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez potwierdzenie braku zanieczyszczeń hematopoetycznych lub endotelialnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje izolację i charakterystykę DPSC na styku wczesnego etapu odkryć i rozwoju modeli przedklinicznych, wspierając zarówno walidację celów, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza tożsamość i wielopotencjalność komórek macierzystych, wspierając badania nad regeneracją oparte na hipotezach.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, potwierdzone markerami DPSCs do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Wykorzystuje cytometrię przepływową i barwienie kolorymetryczne do ilościowej oceny tożsamości i różnicowania komórek.
- Badania translacyjne: Umożliwia generowanie typów komórek istotnych dla danej choroby do badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół w celu zapewnienia spójnego pozyskiwania DPSCs w różnych projektach i zespołach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną i skalowalną izolację oraz walidację DPSC.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie wysokiej jakości materiału komórkowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów medycyny regeneracyjnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie postępowania z tkankami, trawienia enzymatycznego i technik hodowli komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury cytometrii przepływowej i barwienia kolorymetrycznego w celu charakterystyki komórek.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów izolacji i walidacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych źródeł zębów lub w zależności od zmienności dawców.
- Wydajność i czystość komórek zależą od precyzyjnego przeprowadzenia trawienia enzymatycznego oraz analizy markerów.
