Name: Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Poznaj izolację i hodowlę wielopotencjalnych komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów. Ta metoda enzymatyczna umożliwia różnicowanie w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty dla zastosowań w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Dr. Mathew Mazhavancherilowi, dyrektorowi i szefowi Centrum Badawczego Pushpagiri w Thiruvalla, za jego wsparcie w dokumentowaniu procedur w Centrum Badawczym.

Protokół opisany tutaj jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań na ludziach (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Wykorzystanie usuniętych zębów zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi w celu zapewnienia integralności, godności i praw uczestników. Uczestnikami wybranymi do tego badania były zdrowe osoby poniżej 30 roku życia, które wymagały ekstrakcji zęba w celu leczenia ortodontycznego. Osoby z rozległą próchnicą lub ciężkim zapaleniem przyzębia zostały wykluczone z badania. Zęby mleczne pobierano od dzieci, które wymagały ekstrakcji zębów zatrzymanych. Uzyskano również świadomą pisemną zgodę od uczestników biorących udział w tym badaniu.
1. Ekstrakcja i transport zębów
<ol>
	<li>Kolekcja zębów mlecznych i stałych
	<ol>
		<li>Wyjaśnij uczestnikom cel zabiegu i potencjalne zastosowanie usuniętych zębów do celów badawczych.</li>
		<li>Ekstrakcję zębów należy wykonać w znieczuleniu miejscowym, podając środek znieczulający w okolice zęba, który ma zostać usunięty. W szczególności w tym badaniu wstrzyknięto 1,75 ml lidokainy zmieszanej z epinefryną (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:200 000. Preferowany jest wybór zębów, które nie wykazują ciężkiej próchnicy lub zapalenia przyzębia20,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transport usuniętych zębów 
	UWAGA: Zaleca się pracę w warunkach aseptycznych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Obejmuje to noszenie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice i fartuch laboratoryjny, oraz pracę w sterylnym środowisku, takim jak kaptur z przepływem laminarnym stanowiącym zagrożenie biologiczne.
	<ol>
		<li>Po usunięciu zęba przepłucz go sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), aby usunąć krew i inne zanieczyszczenia. Za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela ostrożnie usuń wszelkie przyczepione resztki tkanek miękkich z powierzchni zęba (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Zanurz ząb w roztworze dezynfekującym, takim jak 70% etanol, na 10 sekund. Po dezynfekcji przepłucz ząb sterylnym PBS, aby zmyć resztki środka dezynfekującego.</li>
		<li>Umieść ząb w sterylnym pojemniku zawierającym podłoże transportowe. 
		UWAGA: Pożywka transportowa składała się z Alpha-MEM, komercyjnej pożywki hodowlanej uzupełnionej antybiotykami: 100 U/ml penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Pożywka ta dostarczała niezbędnych składników odżywczych do komórek w usuniętym zębie, zapewniając im przetrwanie do czasu obróbki laboratoryjnej. Antybiotyki służyły do hamowania rozwoju bakterii.</li>
		<li>Utrzymuj temperaturę 4 °C podczas transportu, aby spowolnić komórkową aktywność metaboliczną i opóźnić śmierć komórki. Przetransportuj ząb do laboratorium w celu wykonania kolejnych kroków, w tym przetworzenia i wyizolowania komórek macierzystych miazgi zębowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki miazgowej
<ol>
	<li>Zabezpiecz ząb za pomocą kleszczy dentystycznych, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu podczas zabiegu. Użyj tarczy diamentowej, aby przeciąć ząb w rękojeści dentystycznej (patrz Tabela materiałów) podłączonej do chłodziwa wodnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Celem jest odsłonięcie komory miazgi bez powodowania niepotrzebnych uszkodzeń znajdującej się w niej tkanki miazgi.</li>
	<li>Zatrudnij koparkę dentystyczną (patrz tabela materiałów), aby usunąć tkankę miazgi. Przyrząd ten umożliwia ekstrakcję miazgi bez powodowania uszkodzeń, zachowując w ten sposób żywotność komórek macierzystych miazgi zębowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Otrzymaną tkankę umieścić na szklanej szalce Petriego. Umyj tkankę miazgi solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.</li>
</ol>
3. Trawienie tkanki miazgi i izolacja komórek
<ol>
	<li>Rozdrabnianie i trawienie tkanek
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego ostrożnie zmiel tkankę miazgi na małe fragmenty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) i umieść ją w mini maszynce do mielenia tkanek z PBS, aby uzyskać drobno zhomogenizowaną mieszaninę. Proces ten zwiększa powierzchnię tkanki, ułatwiając bardziej efektywne działanie enzymów podczas trawienia.</li>
		<li>Przenieść rozdrobnione fragmenty jednorodnej tkanki do probówki o pojemności 15 ml i trawić enzymatycznie, stosując mieszaninę 3 mg/ml kolagenazy typu I i 4 mg/ml dypazy (patrz tabela materiałów). Enzymy te rozpuszczono w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), aby osiągnąć pożądane stężenia.</li>
		<li>Inkubować tkankę miazgi w mieszaninie enzymów (etap 3.1.2) przez około 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zneutralizować enzymy i zebrać komórki przez odwirowanie (etap 3.2.1) w celu dalszej hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie i ponowne zawieszenie
	<ol>
		<li>Po inkubacji przenieść strawioną tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki. Ten etap oddziela komórki od pozostałych niestrawionych fragmentów tkanek i enzymów. Ostrożnie wyrzucić pożywkę sklarowaną nad osadem, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie probówki.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej. Pożywka ta zapewnia niezbędne składniki odżywcze i środowisko, aby izolowane komórki mogły przetrwać i namnażać się.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Posiewanie i inkubacja komórek
	<ol>
		<li>Ostrożnie przenieść zawieszone komórki do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm². 
		UWAGA: Cały materiał z pojedynczej miazgi przenosi się do pojedynczej kolbydo hodowli komórkowych o średnicy 25 cm. Objętość pożywki wynosząca 5-7 ml zapewnia wystarczające pokrycie i dostępność składników odżywczych dla komórek. Upewnij się, że pożywką hodowlaną dla DPSC jest zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełniona 10%-20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (patrz Tabela materiałów) w celu zapewnienia niezbędnych czynników wzrostu. Ponadto uzupełnij pożywkę 1% penicyliną/streptomycyną, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w kolbie, aby zapewnić jednorodny wzrost.</li>
		<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmiana medium i monitorowanie konfluencji
	<ol>
		<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, aby zapewnić świeże składniki odżywcze i usunąć odpady metaboliczne. Aby to zrobić, ostrożnie odessać starą pożywkę za pomocą sterylnej pipety serologicznej i zastąpić ją świeżą pożywką.</li>
		<li>Regularnie monitoruj hodowlę komórkową pod mikroskopem, aby śledzić wzrost komórek i sprawdzać, czy nie ma oznak zanieczyszczenia.</li>
		<li>Kontynuuj ten proces, aż komórki osiągną zbieżność 80%-90%, czyli punkt, w którym komórki pokrywają większość powierzchni kolby, ale nie są nadmiernie zatłoczone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trypsynizacja komórek i pasażowanie lub zamrażanie
	<ol>
		<li>Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć pozostałą pożywkę i komórki nieprzylegające.</li>
		<li>Dodać roztwór 0,25% trypsyny-EDTA do kolby, aby oderwać komórki od powierzchni kolby. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając równą objętość pożywki hodowlanej, a następnie delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby zapewnić całkowite oderwanie komórek.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej i albo ponownie je platerować (pasażowanie) w celu dalszego wzrostu, albo zamrozić do wykorzystania w przyszłości. Podczas zamrażania użyj pożywki do zamrażania, która zawiera krioprotektant, taki jak DMSO, aby chronić komórki przed uszkodzeniem podczas zamrażania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka DPSC
<ol>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Aby potwierdzić charakter mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych komórek, wykonaj analizę cytometrii przepływowej22,23. Początkowo trypsynizuj i zbieraj komórki zgodnie z opisem w kroku 4.3.</li>
		<li>Określić żywotność komórek za pomocą techniki wykluczania barwnika trypanowego. Przeprowadzić analizę za pomocą analizatora żywotności komórek (patrz tabela materiałów) podczas 2. i 8. przejścia. Wykonaj analizę fenotypową za pomocą cytometru przepływowego podczas 3. i 7. pasażu.</li>
		<li>Po inkubacji umyj komórki w buforze cytometrii przepływowej w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał i przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. 
		UWAGA: Bufor cytometrii przepływowej składa się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS), 1%-2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1% azydku sodu (NaN3). FBS lub BSA blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał, podczas gdy azydek sodu działa jako środek konserwujący. Wysoki odsetek komórek powinien wykazywać ekspresję markerów mezenchymalnych komórek macierzystych i nie mieć markerów krwiotwórczych, co potwierdza ich tożsamość jako DPSCs24.</li>
		<li>Odłączyć DPSC i wybarwić je przeciwciałami immunofluorescencyjnymi do analizy metodą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Wybór markerów do analizy mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pomocą cytometrii przepływowej opiera się na konsensusie ustalonym przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT), który stwierdza, że MSCs powinny wyrażać CD105, CD73 i CD90 i nie mieć ekspresji CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79a lub CD19 oraz HLA klasy II25. Markery te są powszechnie stosowane w badaniach nad komórkami macierzystymi miazgi zęba26. Stężenia przeciwciał do barwienia mogą się różnić w zależności od konkretnego użytego przeciwciała i zaleca się przestrzeganie instrukcji producenta (patrz Tabela materiałów) dotyczących rozcieńczeń przeciwciał i warunków inkubacji25.</li>
		<li>Ustal kryteria klasyfikacji27,28 dla wyrażenia markerów CD, jak wspomniano: mniej niż 10%, brak wyrażenia; między 11% a 40%, niska ekspresja; zakres od 41% do 70%, umiarkowane wyrażenie; powyżej 71%, wysokie wyrażenie.</li>
		<li>Dodatkowo potwierdź brak markerów krwiotwórczych, inkubując oddzielną podwielokrotność komórki z przeciwciałami przeciwko CD34 i CD45.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Różnicowanie wieloliniowe
UWAGA: Poniższe kroki opisują protokoły osteogennego, adipogennego i chondrogenicznego różnicowania komórek macierzystych zębów. Rozpocznij od wysiewu kultur o gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę na płytce do hodowli tkankowej pokrytej fibronektyną z kompletnym podłożem (CM). Monitoruj wzrost komórek, aż do osiągnięcia 80%-90% konfluencji przed zainicjowaniem pożądanego protokołu różnicowania. Aby ocenić potencjał różnicowania wieloliniowego DPSC, należy zainicjować proces różnicowania w kierunku osteoblastów, adipocytów i chondrocytów poprzez wysiewanie komórek na 24-dołkowe płytki i hodowlę ich w odpowiednich podłożach różnicujących.
<ol>
	<li>Różnicowanie osteogenne
	<ol>
		<li>Rozpocznij od hodowli DPSC w regularnym podłożu wzrostowym w standardowych warunkach, aż osiągną 70%-80% konfluencji.</li>
		<li>Usuń pożywkę wzrostową z komórek, a następnie umyj komórki raz 1x PBS. Dodaj pożywkę do różnicowania osteogennego (ODM) do komórek. 
		UWAGA: ODM składa się z Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) uzupełnionego 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 mM beta-glicerofosforanu i 100 nM deksametazonu (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować komórki w pożywce osteogennej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę osteogenną co 2-3 dni. 
		UWAGA: Po 14 do 21 dniach DPSC powinny zróżnicować się w komórki podobne do osteoblastów. Można to potwierdzić, sprawdzając wzrost ekspresji markerów specyficznych dla osteoblastów, takich jak fosfataza alkaliczna, lub stosując techniki barwienia w celu wykrycia zmineralizowanej matrycy, takie jak barwienie czerwienią S alizaryny.</li>
		<li>Utrwalić komórki, inkubując je z 70% lodowatym etanolem przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wybarwić utrwalone komórki roztworem barwiącym 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10-15 min. Wizualizuj barwienie pod mikroskopem, aby potwierdzić różnicowanie osteogenne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Potwierdź różnicowanie, barwiąc komórki czerwienią Alizaryny S, która identyfikuje złoża wapnia wskazujące na mineralizację29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie adipogenne
	<ol>
		<li>Jak szczegółowo opisano we wcześniejszej sekcji, hoduj DPSC w standardowych warunkach w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 70%-80% konfluencji.</li>
		<li>Odessać pożywkę i raz umyć komórki 1x PBS. Wypłukaną pożywkę zastąpić pożywką różnicującą adipogenną. Pożywka ta zazwyczaj składa się z DMEM, 10% FBS, 10 μg/ml insuliny, 1 μM deksametazonu, 200 μM indometacyny i 0,5 mM IBMX (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zmieniaj podłoże różnicujące co 3-4 dni. Po około 3 tygodniach przemyj DPSC zróżnicowane adipogennie PBS i utrwal je 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zabarwić utrwalone komórki czerwienią olejową O (patrz tabela materiałów), aby uwidocznić akumulację kropelek lipidów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Aby dodatkowo potwierdzić różnicowanie adipogenne, należy przeprowadzić analizę ekspresji genów markerów adipogennych, takich jak receptor gamma aktywowany proliferatorem peroksysomów (PPARγ) i adiponektyna31,32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie chondrogenne
	<ol>
		<li>Kultury DPSC utrzymywane w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C stosuje się do różnicowania chondrogennego. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 70%-80% konfluencji.</li>
		<li>Odessać pożywkę i raz umyć komórki 1x PBS. Zastąp wypłukaną pożywkę chondrogenną pożywką różnicującą, która zazwyczaj zawiera zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle o wysokiej zawartości glukozy (DMEM), 1% ITS, 100 nM deksametazonu, 50 μg/ml askorbinian-2-fosforanu, 40 μg/ml proliny i 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-beta 3 (TGF-β3) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Utrzymuj komórki w pożywce różnicowania chondrogennego, zmieniając pożywkę co 2-3 dni. Po około trzech tygodniach DPSC powinny zróżnicować się w komórki podobne do chondrocytów.</li>
		<li>Utrwal komórki, inkubując je z 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu wybarwić komórki błękitem Alcian (patrz Tabela Materiałów) i zobrazować je pod mikroskopem, aby potwierdzić różnicowanie chondrogenne (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5).</li>
		<li>Potwierdź różnicowanie DPSC w chondrocyty za pomocą technik takich jak barwienie Alcian Blue dla proteoglikanów lub analiza ekspresji genów markerów chondrogennych, takich jak agrekan, SOX9 i kolagen typu II33,34.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół przedstawia izolację, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) z ludzkich zębów mlecznych i stałych. Zawiera opis przechowywania i proliferacji tych komórek, a także ocenę ich potencjału różnicowania in vitro do osteoblastów, adipocytów i chondrocytów35.
Chen i wsp.36 wykazali, że komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) można uzyskać z różnych źródeł, w tym z zakażonych ważnych ludzkich zębów dotkniętych stanami takimi jak zapalenie przyzębia, resorpcja korzeni, zapalenie okołokoronowe i złamania zębów, a także z zębów nadliczbowych i nieprawidłowo ustawionych. Odkrycie to zostało dodatkowo potwierdzone przez kolejne badania identyfikujące zakażone zęby życiowe jako potencjalne źródła DPSC 37,38,39,40. Jednak Bernardi i wsp.10 zwrócili uwagę, że zwiększona resorpcja korzeni może szkodliwie wpływać na żywotność tych komórek macierzystych. Istotną przeszkodą w tym procesie jest zachowanie komórek i zapobieganie ich degradacji, która rozpoczyna się natychmiast po ekstrakcji lub złuszczeniu zęba. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że zęby dotknięte ciężkimi stanami, takimi jak ropnie okołowierzchołkowe, guzy lub torbiele, nie powinny być wykorzystywane do ekstrakcji komórek macierzystych40,41.
DPSC można pozyskać za pomocą techniki trawienia enzymatycznego (ED) lub metody wyrastania z eksplantatów tkanek (OG), znanej również jako technika spontanicznego wzrostu14,15. Naukowcy wykorzystują te strategie do zbadania efektywności proliferacji komórek lub utrzymania cech morfologicznych i fenotypowych izolowanych komórek macierzystych17. Badania wykazały, że komórki macierzyste wyizolowane metodą OG wykazują wolniejsze tempo proliferacji i słabszą ekspresję markerów komórek macierzystych18. I odwrotnie, DPSC wyizolowane metodą ED wykazały szybszą proliferację, różnicowanie i zwiększoną ekspresję dodatkowych markerów powierzchniowych niż te wyizolowane metodą OG. Co ciekawe, niedojrzałe komórki macierzyste miazgi zębowej (IDPSC) pobrane z zębów mlecznych przy użyciu techniki OG wykazały, że hodowla komórkowa sprzyja selektywnej proliferacji IDPSC, zapobiegając w ten sposób wczesnemu różnicowaniu42.
Oczyszczanie DPSC ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysoce regenerujących się komórek i wymaga specyficznych markerów komórkowych. Selekcja komórek odbywa się przy użyciu metod sortowania komórek fluorescencyjnych lub aktywowanych magnetycznie. Oprócz wyżej wymienionych markerów, ze względu na niejednorodny charakterDSCs 43 stosuje się również wiele innych antygenów powierzchniowych. Nie zidentyfikowano jednak pojedynczego markera, który pozwoliłby na segregację subpopulacji.
W porównaniu z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego, DPSC zostały uznane za obiecujące źródło komórek multipotencjalnych ze względu na ich potencjał wieloliniowy44. Ta łodyga jest prawdopodobnie wynikiem względnej niedojrzałości tkanek źródłowych, ponieważ zęby mądrości, często źródło ekstrakcji DPSC, są ostatnimi zębami stałymi, które się rozwijają, a zatem są mniej dojrzałe niż szpik kostny45. Protokół ten z powodzeniem bada multipotencjalną naturę komórek macierzystych miazgi zębowej poprzez indukowanie tych komórek do ulegania adipogenezie, osteogenezie i chondrogenezie. Warto zauważyć, że DPSC są jedynym typem komórek, który zwiększa ekspresję DSPP podczas hodowli w warunkach osteogennych, co wskazuje na ich przyszłe różnicowanie w odontoblasty46.
Komórki macierzyste zębów, wyizolowane z różnych źródeł, wykazują duży potencjał proliferacji i różnicowania47. Znaczące postępy poczynione w systemach in vitro wywarły głęboki wpływ na biologię komórek macierzystych i terapię. Pomimo tych postępów, nadal istnieją wyzwania związane z przekładaniem terapii komórkami macierzystymi z laboratorium na łóżko pacjenta. Szczególną uwagę należy zwrócić na przeżywalność i stabilność komórek macierzystych, aby zagwarantować, że techniki konserwacji nie zagrażają żywotności tych komórek. Podczas gdy badania nad komórkami macierzystymi zębów przyniosły obiecujące wyniki w modelach zwierzęcych, istnieje pilna potrzeba rozszerzenia tych ustaleń na badania na ludziach. Kontynuując rygorystyczne badania i rozwój, dentystyczne komórki macierzyste mogą odegrać znaczącą rolę w postępie w dziedzinie bankowania komórek macierzystych.
Chociaż jest to szeroko stosowane, trawienie enzymatyczne do izolowania komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) ma kilka ograniczeń. Przede wszystkim proces ten może zagrozić żywotności komórek, ponieważ enzymy takie jak kolagenaza i dyspaza mogą nieumyślnie uszkadzać błony komórkowe, dając mniej żywych komórek macierzystych17. Ponadto metoda ta często prowadzi do degradacji ważnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która ma kluczowe znaczenie dla zachowania nieodłącznych właściwości komórek macierzystych48. Procedura może również zmieniać markery powierzchni komórki, utrudnia to dokładną identyfikację i charakterystykę DPSC43. Poza tymi ograniczeniami biologicznymi podejście to jest czasochłonne, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego z powodu długotrwałej inkubacji w temperaturze 37 °C. Co więcej, niespójność między partiami enzymów może prowadzić do zmiennych wyników, co podważa powtarzalność procedury izolacji. Nie można pominąć obciążenia finansowego, ponieważ wysokiej jakości enzymy odpowiednie do trawienia tkanek są drogie49. Co więcej, w następstwie trawienia może wystąpić szczątkowa aktywność enzymów, która może szkodliwie wpływać na hodowle komórkowe, wpływając na ich zdrowie, proliferację i różnicowanie. Wreszcie, potencjał trawienia enzymatycznego w celu preferencyjnego izolowania niektórych subpopulacji DPSC w stosunku do innych może nieumyślnie zniekształcić wynikową pulę komórek, wpływając na ich potencjał terapeutyczny50.

Badania nad komórkami macierzystymi rozkwitły w naukach biomedycznych dzięki obiecującym zastosowaniom w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC), pochodzące z tkanki miazgi zarówno ludzkich zębów mlecznych, jak i stałych, cieszą się dużym zainteresowaniem jako źródło komórek macierzystych ze względu na ich łatwą dostępność i zdolność multipotencjalną1,2. Komórki te mają potencjał do różnicowania się w różne typy komórek, w tym adipocyty, osteoblasty i chondrocyty, co potwierdzają liczne badania3.
W ciągu ostatnich kilku dekad nastąpił gwałtowny wzrost badań i zastosowań terapeutycznych komórek macierzystych. Ekspansywny potencjał komórek macierzystych wymaga dywersyfikacji źródeł, z których są pozyskiwane. Na wydajność, żywotność i zdolność macierzystą wybranych komórek wpływa kilka czynników. Pomimo istnienia różnych znanych rezerwuarów komórek macierzystych, takich jak szpik kostny i tkanka tłuszczowa, inwazyjne procedury, zachorowalność na miejsca i problemy etyczne związane z tymi źródłami często ograniczają ich eksplorację4,5. Wśród różnych źródeł komórek macierzystych, dentystyczne komórki macierzyste zyskały uwagę ze względu na ich łatwą dostępność, wysoką plastyczność i różnorodne potencjalne zastosowania. W szczególności ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej zostały szeroko przebadane pod kątem ich perspektyw terapeutycznych6. Zęby, powszechnie wyrzucane jako odpady medyczne, zawierają bogactwo mezenchymalnych komórek macierzystych7. Ochrona tej cennej puli komórek macierzystych wymaga wspólnych wysiłków pacjentów, dentystów i lekarzy, aby zapewnić, że zasoby te nie zostaną zmarnowane, dzięki czemu każda komórka macierzysta miazgi zęba będzie dostępna dla przyszłych potrzeb regeneracyjnych.
Komórki macierzyste pochodzące z miazgi zębowej, takie jak ludzkie dorosłe komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) i komórki macierzyste z złuszczonych ludzkich zębów mlecznych (SHED), znajdują się w niszy okołonaczyniowej miazgi zębowej. Uważa się, że komórki te pochodzą z komórek grzebienia nerwowego czaszki i wykazują wczesne markery zarówno mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), jak i neuroektodermalnych komórek macierzystych. DPSC i SHED wykazały się wielomocą i zdolnością do regeneracji różnych typów tkanek8.
Potencjalne źródła komórek macierzystych zębów obejmują zdrowe zęby mleczne i stałe. Komórki macierzyste stanowią tylko około 1% całkowitej populacji komórek w miazdze, co podkreśla znaczenie skutecznych technik izolacji i ekspansji9. W związku z tym ekstrakcja i ekspansja tych komórek macierzystych są kluczowymi etapami izolacji DPSC10. Usunięte lub złuszczone zęby muszą być przechowywane w bogatym w składniki odżywcze podłożu transportowym, takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) lub roztwór soli fizjologicznej buforowany przez Hanksa (HBSS).
Uzyskanie miazgi zębowej można osiągnąć różnymi metodami, w zależności od typu zęba7,11. W przypadku zębów mlecznych z korzeniami resorbowanymi ekstrakcję można przeprowadzić przez wierzchołek korzenia. Podobnie sterylne broszki kolczaste mogą być używane do pozyskiwania miazgi z zębów stałych z niedojrzałym otwartym wierzchołkiem. W przypadku zębów stałych z w pełni rozwiniętymi korzeniami, dostęp do komory miazgi polega na oddzieleniu korony zęba od korzenia. Osiąga się to poprzez przecięcie zęba za pomocą tarczy diamentowej na styku cementowo-szkliwa. To nacięcie odsłania komorę miazgi, umożliwiając pobranie tkanki miazgi12,13,14.
Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) mogą być izolowane poprzez trawienie enzymatyczne (ED) lub wyrostek z eksplantatów tkanek (OG), znane również jako spontaniczny wzrost. Metoda ED wykorzystuje enzymy, głównie kolagenazę I i dyspazę, do rozkładu tkanki na zawiesiny jednokomórkowe15,16. Metoda OG, prostsza i szybsza, polega na rozdrobnieniu fragmentów miazgi i bezpośrednim umieszczeniu ich na płytce hodowlanej, co pozwala komórkom wyrosnąć z eksplantatów tkankowych17. Naukowcy wykorzystali i porównali obie techniki do oceny tempa proliferacji komórek, zachowania właściwości izolowanych komórek macierzystych, różnicowania i ekspresji markerów powierzchniowych18. Ustanowienie i standaryzacja protokołów pozyskiwania DPSC o wysokiej skuteczności i skuteczności może utorować drogę do skutecznych i bezpiecznych terapii19. Protokół ten obejmuje ekstrakcję DPSC za pomocą trawienia enzymatycznego, przetwarzania laboratoryjnego, konserwacji i różnicowania komórek z barwieniem kolorymetrycznym w celu adipogenezy, osteogenezy i chondrogenezy.
Protokół opisany w tym artykule przedstawia procedurę krok po kroku, zaczynając od wstępnej izolacji miazgi zębowej od zęba, następnie hodowli i utrzymania DPSC w laboratorium, a kończąc na ich charakterystyce za pomocą specyficznych markerów komórek macierzystych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Opisano również techniki indukcji tych komórek macierzystych do różnych linii komórkowych, podkreślając ich wielomocność.

<table><tbody><tr><td>3-izobuty-L-metylo-ksantyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>AS001</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski Alcjan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>RM471</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwiący Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>GRM894</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia fosfatazy alkalicznej</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;-MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;-MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM lub Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Alpha-MEM lub Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian-2-fosforan</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>012-04802</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosforan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego-okap z przepływem laminarnym</td><td>Labconco Corporation, MO 64132-2696, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 i HLA-DR</td><td>BioLegend, Inc.CA 92121, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mikro; m )</td><td>Laboratoria HiMedia&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td><td>TCP025</td><td>Wirówka do siatek komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td><td>1101 | 1102</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompletne podłoże wzrostowe</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, Indie</td><td>AT006 DMEM</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe (15 lub 50</td>) <td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>546021P/546041P</td><td>15 ml i 50 ml</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania Cryo</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Etykiety kriogeniczne Etykieta</td><td>Indie:</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pudełka do przechowywania kriowialnego&nbsp;</td>Pudełka <td></td><td></td><td>do przechowywania Cryostore</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1,8 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>PW1282</td><td>Wolnostojąca</td></tr><tr><td>kolba hodowlana (25 cm&sup2;)</td><td>Corning Inc.NY 14831,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby</td><td>hodowlane HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd. Bombaj, Indie</td><td>TCG4/TCG6</td><td>T25/T75</td></tr><tr><td>Płytki hodowlane</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, Indie</td><td>TCP129 / TCP008</td><td>60 mm / 100 mm</td></tr><tr><td>Dentystyczne tarcze diamentowe</td><td>Komet SC 29730, USA</td><td></td><td>Komet&nbsp;</td></tr><tr><td>Koparka łyżkowa dentystyczna</td><td>Brasseler, GA 31419, USA</td><td>5023591U0</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Deksametozon</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Deksametozon</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TC185</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451,Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd. Bombaj, Indie</td><td>MB106</td><td></td></tr><tr><td>Etanol -70%</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kleszcze ekstrakcyjne&nbsp;</td><td>Dentsply Sirona, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, Indie</td><td>RM9954</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej pokryta fibronektyną</td><td>Corning Inc. Corning, NY 14831, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences, CA 95131, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do cytometrii przepływowej</td><td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe szklane 22 x 22 mm</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai, Indie</td><td>TCP017</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Lonza Group Ltd,4002 Bazylea, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybkobieżna rękojeść dentystyczna&nbsp;</td><td>NSK Ltd, Tokio 8216, Japonia</td><td></td><td>Ti-Max Z series</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IBMX lub 3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Pfizer Inc. NY 10017, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451,USA</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen (ITS)Thermo</td> <td>Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>Premiks insulina-transferyna-selen (ITS)</td><td>Corning Incorporated, MA 01876, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Corp., Tokio 163-0914, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (60%)</td> <td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>MB063</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina zmieszana z epinefryną</td><td>DENTSPLY, NC 28277, USA</td><td></td><td>Citanest</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Air Liquide, 75007 Paryż, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik magazynujący ciekły azot</td><td>Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Niemcy</td><td>30020</td><td>Accupipet-2-20 &micro; L</td></tr><tr><td>Mini młynek do tkanek</td><td>Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547, USA</td><td></td><td>Mini młynki</td></tr><tr><td>ReadyPrep Zamrażarka Minus 80</td><td>Blue Star Limited Komora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>licząca Neubauer</td><td>Marienfeld Superior, arktheidenfeld, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czerwona plama olejowa O</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>1024190250</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do różnicowania osteogennego (ODM)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies Inc. Vancouver, BC, V5Z 1B3, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL119</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem (PBS) bez Ca++ i Mg++</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd.Mumbai,India</td><td>TS1101</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific,MA, USA</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Prolina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozmiar ostrza skalpela 15&nbsp;</td><td>Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK</td><td>BDF-6955C</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>HiMedia Laboratories&nbsp; Ltd. Mumbai, Indie</td><td>AS102 4</td><td>% w/v roztwór</td></tr><tr><td>Sterylne probówki wirówkowe</td><td>Tarsons Products Pvt. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny pojemnik -20 ml</td><td>3M Center, MN 55144-1000,USA</td><td></td><td>3 M</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>P3813-1PAK</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Sterylne pipety (2, 5 i 10 ml )</td><td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety i końcówki</td><td>Eppendorf India Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne Uchwyt</td><td>Becton, Dickinson and Co., NJ, USA</td><td>371030</td><td>BP Uchwyt 3</td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-beta 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>R & D Systems, Inc.MN 55413, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-beta 3 (TGF-&beta; 3)</td> <td>R & D Systems, Inc.MN 55413,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0.4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0.4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0.4%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25%</td> <td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA</td><td>BSW-01D</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

W dziedzinie medycyny regeneracyjnej i zastosowań terapeutycznych, badania nad komórkami macierzystymi szybko zyskują na popularności. Komórki macierzyste miazgi zęba (DPSC), które są obecne zarówno w zębach mlecznych, jak i stałych, stały się istotnym źródłem komórek macierzystych ze względu na ich dostępność, zdolność adaptacji i wrodzone zdolności różnicowania. DPSC stanowią łatwo dostępny i obfity rezerwuar mezenchymalnych komórek macierzystych, wykazując imponującą wszechstronność i potencjał, szczególnie w celach regeneracyjnych. Pomimo ich obietnicy, główną przeszkodą jest skuteczne wyizolowanie i scharakteryzowanie DPSC, biorąc pod uwagę ich reprezentację jako drobna frakcja w komórkach miazgi zęba. Równie ważne jest odpowiednie zachowanie tego bezcennego zasobu komórkowego. Dwie dominujące metody izolacji DPSC to trawienie enzymatyczne (ED) i wyrastanie z eksplantatów tkanek (OG), często określane jako spontaniczny wzrost. Protokół ten koncentruje się przede wszystkim na podejściu do trawienia enzymatycznego do izolacji DPSC, szczegółowo opisując etapy obejmujące ekstrakcję, przetwarzanie w laboratorium i konserwację komórek. Poza ekstrakcją i konserwacją, protokół zagłębia się w zdolność różnicowania DPSC. W szczególności przedstawia procedury stosowane w celu indukowania tych komórek macierzystych do różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty, prezentując ich multipotencjalne atrybuty. Późniejsze wykorzystanie technik barwienia kolorymetrycznego ułatwia dokładną wizualizację i potwierdzenie udanego różnicowania, potwierdzając w ten sposób kaliber i funkcjonalność izolowanych DPSC. Ten kompleksowy protokół funkcjonuje jako plan obejmujący całe spektrum ekstrakcji, hodowli, konserwacji i charakterystyki komórek macierzystych miazgi zęba. Podkreśla to znaczny potencjał, jaki drzemie w DPSC, napędzając naprzód badania nad komórkami macierzystymi i dając nadzieję na przyszłe przełomy regeneracyjne i terapeutyczne.

Pomyślna realizacja opisanego protokołu pozwoliła na uzyskanie mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) zdolnych do różnicowania wieloliniowego, co potwierdziło ich multipotencjalność.
Testy żywotności 
Żywotność komórek DPSCs oceniano za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego w różnych punktach czasowych. Wyniki wskazują na konsekwentnie wysoką żywotność (powyżej 95%) przez cały okres hodowli, co potwierdza skuteczność zastosowanego protokołu izolacji i hodowli.
Analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) 
Analizy CFU przeprowadzono w celu oceny zdolności do samoodnowy komórek DPSC. Zawiesinę pojedynczych komórek wysiano przy niskiej gęstości i inkubowano przez 14 dni. Powstałe kolonie następnie barwiono i liczono. Wyniki wskazują na obecność wielu kolonii, co świadczy o wysokim udziale komórek zdolnych do samoodnowy w populacji DPSC.
Czas podwojenia komórek 
Czas podwojenia komórek obliczono na podstawie krzywej wzrostu DPSCs. Komórki wysiano z określoną gęstością i liczono je regularnie w celu sporządzenia krzywej wzrostu. Następnie czas podwojenia obliczono, wykorzystując fazę wzrostu wykładniczego krzywej. Wyniki wskazują na czas podwojenia zgodny z wartościami raportowanymi dla MSCs, co sugeruje zdrową i proliferującą populację komórek (Rycina 6).
Analiza cytometryczna 
Analiza cytometryczna wykazała, że zdecydowana większość komórek DPSC (np. &gt;95%) była pozytywna pod kątem CD90, CD73 i CD105, co potwierdziło ich tożsamość jako MSC (Rysunek 7). Ponadto mniej niż 2% komórek było pozytywnych pod kątem CD45, CD34 i HLA-DR, co potwierdziło brak istotnej kontaminacji komórkami krwiotwórczymi lub śródbłonkowymi.
Różnicowanie osteogenne 
Po zakończeniu różnicowania osteogennego komórki wykazały obecność zmineralizowanej macierzy, co zostało zobrazowane za pomocą barwienia Alizariną Red S (Rysunek 3). Obecność czerwonego zabarwienia w barwionych komórkach wskazuje na pomyślne odłożenie zmineralizowanej macierzy, co jest kluczową cechą różnicowania osteogennego. Brak możliwości uzyskania prawidłowego barwienia różnicowania może być potencjalnie związany z trudnościami napotkanymi podczas procedury pobierania próbek.
Różnicowanie adipogenne 
W trakcie różnicowania adipogennego w komórkach DPSCs gromadziły się kropelki lipidowe, co świadczyło o przebiegu adipogenezy. Kropelki lipidowe można zaobserwować dzięki barwieniu Oil Red O (Rysunek 4). Prawidłowe różnicowanie zaowocowało pojawieniem się wewnątrz komórek kropelek lipidowych zabarwionych na kolor pomarańczowo-czerwony.
Różnicowanie chondrogenne 
Na koniec, po różnicowaniu chondrogennym, DPSCs wytworzyły glikozaminoglikany, krytyczny składnik chrząstki, co potwierdzono barwieniem błękitem Alcianem, który wiąże się z tymi glikozaminoglikanami. Komórki, które z powodzeniem przeszły chondrogenezę, wykazaly niebieskie zabarwienie po barwieniu (Rysunek 5).
Komórki, które nie wykazały odpowiednich zmian barwy w procedurach barwienia, mogą być wynikiem suboptymalnego różnicowania, co prawdopodobnie wynika z problemów z pożywkami różnicującymi lub początkowej jakości DPSCs. Ważne jest zapewnienie jakości pożywek i suplementów oraz stanu zdrowia i liczby pasaży wykorzystanych DPSCs. Pomyślne różnicowanie DPSCs w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty potwierdza wielopotencjalny charakter tych komórek i podkreśla ich potencjał w medycynie regeneracyjnej oraz zastosowaniach terapeutycznych.
<img alt="Schemat procesu komórek macierzystych pochodzących z zęba, przedstawiający etapy ekstrakcji, hodowli komórkowej i różnicowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych miazgi zęba. Na tym rysunku przedstawiono schematyczny przebieg procesu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs). Proces rozpoczyna się od ekstrakcji zęba (lub zębów), a następnie od izolacji tkanki miazgi, z której pozyskuje się DPSCs. Po izolacji komórki DPSCs poddawane są różnym testom charakterystyki w celu potwierdzenia ich tożsamości jako komórek macierzystych oraz oceny ich żywotności, tempa proliferacji i innych kluczowych parametrów. Ostatni etap przedstawiony na schemacie obejmuje indukcję różnicowania, podczas której DPSCs są traktowane specyficznymi czynnikami, aby skierować ich transformację w wyspecjalizowane typy komórek, takie jak osteoblasty, adipocyty lub chondrocyty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces przygotowania zęba i implantacji; narzędzia obejmują wiertarkę rotacyjną, pęsetę i szalkę Petriego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pobieranie miazgi z usuniętych zębów. (A) Usunięty ząb przygotowany do ekstrakcji tkanki miazgi. (B) Przecinanie usuniętego zęba za pomocą wiertła diamentowego. (C) Usuwanie tkanki miazgi z komory miazgi. (D) Fragmentacja tkanki miazgi za pomocą skalpela chirurgicznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik badania histologicznego; barwiony przekrój tkanki pod mikroskopem; analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Różnicowanie osteogeniczne mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) wykazane przez barwienie Alizarin Red S (40x). Intensywne czerwone barwienie ujawnia odkładanie zmineralizowanej macierzy, co jest charakterystyczną cechą osteoblastów, potwierdzając pomyślne różnicowanie osteogeniczne. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przekrój histologiczny tkanki, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, skala 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Dyferencjacja adipogenna mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) wykazana za pomocą barwienia Oil Red O. Obecność jaskrawoczerwonych kropel reprezentuje akumulację lipidów, charakterystyczną dla adypocytów, co potwierdza pomyślną dyferencjację adipogenną. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej przedstawiający morfologię fibroblastów, zabarwionych w celu wizualizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Różnicowanie chondrogenne komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) wykazane za pomocą barwienia błękitem Alcianem (40x). Intensywny niebieski kolor wskazuje na obecność bogatej w proteoglikany macierzy zewnątrzkomórkowej, charakterystycznej dla chondrocytów, co potwierdza pomyślne różnicowanie chondrogenne. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wzrostu komórek w czasie, przedstawiający liczbę komórek w funkcji czasu w godzinach, wykazujący wzrost wykładniczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Czas podwojenia liczby komórek dla mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSCs). Na rysunku przedstawiono krzywą wzrostu komórek DPSC w czasie. Komórki zasiano początkowo z określoną gęstością, a pomiary liczby komórek wykonywano w regularnych odstępach czasu (naniesionych na oś X), aby monitorować tempo proliferacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histogramy cytometrii przepływowej, poziomy ekspresji markerów powierzchniowych komórek: CD90, CD73, CD105, CD34, CD45, HLA-DR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65767/65767fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ekspresja markerów powierzchniowych komórek macierzystych w hodowli DPSC. Na tym rysunku przedstawiono ekspresję specyficznych markerów powierzchniowych w komórkach DPSC. Markery mezenchymalnych komórek macierzystych CD44, CD90 i CD105 wykazują wysoki poziom ekspresji, co wskazuje na obecność cech mezenchymalnych w tych komórkach. Z kolei ekspresja markerów hematopoetycznych (CD34 i CD45) oraz cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej klasy II (HLA-DR) jest niemal niezauważalna, co potwierdza brak komórek linii hematopoetycznej w hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65767/65767fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

Zacznij od zabezpieczenia usuniętego ludzkiego zęba na miejscu za pomocą kleszczy dentystycznych. Następnie wytnij ząb za pomocą tarczy diamentowej połączonej z rękojeścią dentystyczną i chłodziwem wodnym. Za pomocą koparki dentystycznej usuń tkankę miazgi z zęba.Następnie za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego ostrożnie rozdrobnij tkankę miazgi na małe fragmenty. Następnie umieść te fragmenty w mini młynku do tkanek z PBS, aby utworzyć jednorodną mieszaninę. Przenieś zmielone fragmenty tkanek do 15-mililitrowej probówki i strawij je za pomocą mieszaniny kolagenazy typu pierwszego i rozdrobnij.Inkubować tkankę w mieszaninie enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji zneutralizować enzymy. Następnie przenieś strawioną tkankę do 15-mililitrowej probówki i wiruj z prędkością 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym DMEM, uzupełnionym 10 do 20% FBS. W przypadku hodowli komórkowej ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.Po dwóch do trzech dniach, za pomocą sterylnej pipety serologicznej, ostrożnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Następnie, w celu scharakteryzowania DPSC, włącz cytometr przepływowy i potwierdź charakter mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych komórek. Pomyślne różnicowanie DPSC na osteoblasty, adipocyty i chondrocyty potwierdza multipotencjalny charakter DPSC.Czas podwojenia DPSC był zgodny z czasem zgłoszonym dla mezenchymalnych komórek macierzystych, co sugeruje zdrową i proliferacyjną populację komórek. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że większość DPSC była dodatnia dla CD-90, CD-73 i CD-105, potwierdzając ich tożsamość jako mezenchymalnych komórek macierzystych. Co więcej, mniej niż 2% komórek było dodatnich na CD-34, CD-45 i HLADR, co potwierdza brak znaczącego zanieczyszczenia komórek krwiotwórczych lub śródbłonka.

isolation-culture-characterization-dental-pulp-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Udostępniamy protokoły oceny mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych z miazgi zębowej i interakcji komórek raka prostaty w oparciu o bezpośrednie i pośrednie metody wspólnej hodowli. Membrany Condition Medium i trans-well są odpowiednie do analizy pośredniej aktywności parakrynnej. Wysiewanie różnie barwionych komórek razem jest odpowiednim modelem bezpośredniej interakcji komórka-komórka.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Poznaj izolację i hodowlę wielopotencjalnych komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów. Ta metoda enzymatyczna umożliwia różnicowanie w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty dla zastosowań w inżynierii tkankowej.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Przeglądaj więcej filmów