Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Obecnie dynamikę mikrotubul obserwuje się pośrednio poprzez mikrotubule znajdujące się w białkach takich jak EB1, ponieważ heterodimery alfa, beta tubuliny występują obficie w cytoplazmie. Brakuje skutecznych narzędzi do bezpośredniego heterodimerów tubuliny, aby obserwować dynamikę sieci mikrotubul u ludzi. Nasz protokół wykorzystuje mikrotubule w synapsach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi w zakresie umożliwiającym lub różnorodnym do badań terapeutycznych i genetycznych badań przesiewowych białek regulatorowych sieci mikrokanalików w układzie nerwowym u ludzi.

Nasze badania koncentrują się na związku między cytoszkieletyną a rozwojem układu nerwowego, a także na jego implikacjach dla chorób neurologicznych. Mamy nadzieję odkryć mechanizm rozwoju neurologicznego i patogenezę chorób neurologicznych, podkreślając ich wpływ na białka regulatorowe cytoszkieletu i neurony. Zacznij od wybrania wędrującej larwy trzeciego stadium rozwojowego Drosophila za pomocą długich, kleszczy.

Umyj larwy hemo realistyczną solą fizjologiczną, a następnie osusz ją chusteczką. Następnie umieść larwy grzbietowo lub brzusznie na naczyniu preparacyjnym pod mikroskopem stereoskopowym, w zależności od obserwowanej tkanki, zdecyduj się na rozwarstwienie grzbietowe lub brzuszne. Przypnij pysk, haczyki i ogon larwy, aby utrzymać rozszerzoną pozycję.

Następnie dodaj kroplę realistycznej soli fizjologicznej hemo, aby zapobiec wysychaniu larw. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe poprzeczne nacięcie blisko tylnego końca, nie przecinając go całkowicie. Przystąp do cięcia wzdłuż brzusznej linii środkowej, przesuwając się w kierunku przedniego końca.

Teraz włóż po cztery szpilki do owadów w rogach larw. Dokonaj niezbędnych regulacji szpilek owadów, aby zmaksymalizować rozciąganie larw. Użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć narządy wewnętrzne, unikając uszkodzenia mięśni.

Aby utrwalić larwy, zanurz tusze w 100 mikrolitrach 4% aldehydu paraformowego, nadal przymocowane do naczynia preparacyjnego. Następnie zdemontuj kołki, a następnie przenieś próbkę do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej wypełnionej 0,2% PBST. Umieść probówkę na shakerze na 10 minut.

Przy 15 obr./min. Usuń PBST i zanurz aldehyd paraformowy utrwalony w dresofili drosophila, tusze larwalne i środek blokujący na 40 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp środek blokujący 200 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego 0,2% PBST.

Pozostaw larwy do inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia przemyj larwy 0,2% PBST przez 10 minut. Następnie wyjmij PBST z probówki i dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego.

Inkubuj go w temperaturze otoczenia przez półtorej godziny w ciemności. Wprowadź barwnik jądrowy, taki jak jodek TO-PRO(R)3, do probówki inkubacyjnej na 30 minut, barwiąc mikrotubule w ciemności. Na koniec spłucz przeciwciało wtórne i barwnik jądrowy 0,2% PBST przez 10 minut.

Rozpocznij od umieszczenia tusz larwalnych drosophila znakowanych przeciwciałami w 0,2% PBST na szkiełku podstawowym wyregulowanym pod mikroskopem stereoskopowym, upewniając się, że wewnętrzna powierzchnia tuszy larwalnej jest skierowana do góry. Nadmiar roztworu PBST należy wchłonąć za pomocą chusteczki do ścierania. Następnie delikatnie dodaj kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku zakrywającym wypreparowane larwy powoli i delikatnie, unikając tworzenia się pęcherzyków. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe na miejscu, nakładając lakier do paznokci na jego krawędziach. Przechowuj szkiełko w ciemnym miejscu, aby zminimalizować tłumienie fluorescencji podczas akwizycji obrazu.

Używaj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym 63 x w olejku. Następnie dostosuj długość fali i moc lasera, aby jak najlepiej dopasować się do wymagań eksperymentu. Aby zidentyfikować połączenia nerwowo-mięśniowe i uchwycić obrazy mięśnia czwartego w segmencie A trzy.

Wybierz laser 488 nanometrów, aby aktywować tubulinę alfa lub FUCH i 546 nanometrów, aby aktywować ścieżkę obrazowania HRP, zmodyfikuj parametry, aby uzyskać rozmiar klatki 1024 na 1024 piksele, zoom cyfrowy 1,0 i interwał obrazowania 0,8 mikrometra Aby uwidocznić mikrotubule w mięśniach, uchwyć obrazy mięśnia drugiego w segmentach, od trzech do pięciu, ponieważ ma mniej gałęzi tchawicy. Wybierz laser 488 nm do aktywacji tubuliny alfa i laser 633 nm do aktywacji ścieżki obrazowania T3605. Dostosuj parametry obrazowania do rozmiaru klatki 1024 na 1024 pikseli, zoomu cyfrowego 2,0 i interwału obrazowania 0,4 mikrometra.

Zarówno przed, jak i po synaptycznych organizacjach mikrotubul połączenia nerwowo-mięśniowego oznaczono anty-tubuliną alfa. Barwienie FUCH odzwierciedlało obfitość stabilnych mikrotubul w neuronach presynaptycznych. Zmniejszoną intensywność sygnału anty-FUCH obserwowano, gdy białko odcinające mikrotubule kataninę 60 ulegało nadekspresji w neuronach presynaptycznych.

Intensywność barwienia pnia aksonu była silniejsza niż gałęzi. Mutacje kataniny 60 powodowały zwiększenie pętli mikrotubul. Nadekspresja Kataniny 60 powodowała krótkie fragmenty mikrokanalików w obrębie przycisków końcowych.

Barwienie alfa-tubuliną wykazało wyraźną sieć mikrotubul wokół jądra, komórki mięśniowe miały znacznie zwiększoną intensywność mikrokanalików parajądrowych i wykazywały silniejsze wiązki. W przypadku kataniny 60 nadekspresja zmutowanego kataniny powodowała fragmentację włókien mikrokanalików.