Metodologia metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans

Wyzwaniem w badaniach nad C. elegans jest odizolowanie efektów diety opartej na żywych bakteriach od skutków manipulacji eksperymentalnych. Ustalenie, czy manipulacja ma bezpośredni wpływ na gospodarza, czy pośrednio wpływa na robaki poprzez interakcje mikrobiomu gospodarza, może być trudne. Bakterie poddane działaniu paraformaldehydu rozwiązują wyzwanie polegające na odizolowaniu efektów metabolizmu bakteryjnego od fizjologii gospodarza.

Leczenie paraformaldehydem jest wysokoprzepustowe i konsekwentnie sprawia, że bakterie są replikacyjnie i metabolicznie nieaktywne. Oprócz swojej konsystencji, bakterie traktowane PFA pozostają smacznym i pożywnym źródłem pożywienia. Zacznij od zaszczepienia pojedynczej kolonii bakteryjnej w 200 mililitrach wysterylizowanego bulionu luria w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera.

Hoduj bakterie przez noc w inkubatorze z wytrząsarką ustawioną na 37 stopni. Po 14 godzinach hodowli sprawdź gęstość optyczną bakterii na poziomie 600 nanometrów. Podziel bakterie na 50-mililitrowe stożkowe probówki i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania.

Za pomocą pipety serologicznej przenieść 50 mililitrów kultury bakteryjnej do nowej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mililitrów. Oznacz probówki do kontroli na żywo lub pozorowanej leczenia. Użyj pipety serologicznej, aby przenieść 50 mililitrów bakterii do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu pozorowanej kontroli przed myciem.

W kapturze chemicznym dodaj 781 mikrolitrów paraformaldehydu do kultury bakteryjnej, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5%Wyrzuć zużytą końcówkę do pojemnika na odpady chemiczne w postaci odpadów stałych. Następnie przykryj kolbę arkuszem folii i umieść ją w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Po zakończeniu inkubacji umyj bakterie, aby usunąć wszelkie pozostałości paraformaldehydu.

W celu usunięcia pozostałości paraformaldehydu, za pomocą pipety serologicznej, przenieść leczone bakterie z kolby Erlenmeyera do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwiruj leczone bakterie w temperaturze około 3000 G przez 20 minut. Wyrzucić sklarowany osad do pojemnika na odpady chemiczne w stanie spoczynku ciekłego wewnątrz okapu chemicznego.

Teraz dodaj 25 mililitrów bulionu luria do traktowanego i kontroluj granulki bakteryjne i wiruj, aby ponownie zawiesić granulki bakteryjne. Powtórzyć wirowanie i ponowne zawieszenie osadów cztery razy. Przygotowując się do różnych testów, ponownie zawiesić osad w odpowiednich objętościach.

Do testów długości życia wysiewa się 200 mikrolitrów bakterii ponownie zawieszonych w 10 mililitrach bulionu luria na 60-milimetrowych płytkach. Przechowuj bakterie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić kontrolę jakości rozwoju bakterii, przetrzyj talerz bulionu luria przygotowanymi bakteriami za pomocą sterylnej końcówki pipety.

Aby zweryfikować zanieczyszczenie, rozłóż bulion Luria używany do mycia i ponownego zawieszania na osobnym talerzu. Następnie umieść płytki na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia sprawdź, czy nie rozwijają się bakterie.

Uratuj bakterie, jeśli przygotowanie paraformaldehydu zakończy się sukcesem, a kolonie nie wyrosną na płytce LB. Aby sprawdzić aktywność metaboliczną bakterii za pomocą respirometru, najpierw uwodnić wkład, dodając 200 mikrolitrów kalibru do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej. Umieść wkład w płytce 96-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ustaw maszynę na mieszanie, czekanie, mierzenie i pętlę. Następnego dnia umieść uwodniony wkład w urządzeniu. Do nowej 96-dołkowej płytki dodaj 160 mikrolitrów M9 do dołków testowych, a następnie 40 mikrolitrów przygotowanych bakterii.

Dodaj 200 mikrolitrów M9 do czterech studzienek narożnych, aby działały jako ślepe próby. Dozować 160 mikrolitrów M9 i 40 mikrolitrów bulionu luria jako kontrole negatywne. Na koniec odpipetować 200 mikrolitrów M9 do pozostałych niewykorzystanych studzienek.

Następnie zastąp wyrzuconą płytkę kalibracyjną płytką testową przed uruchomieniem programu. Wyniki zostaną wyświetlone jako wskaźnik zużycia tlenu. Różne szczepy wykazywały różne czasy reakcji inaktywacji na paraformaldehyd.

Na przykład narażenie bakterii HB101 na 0,25% przez godzinę wystarczy, aby uczynić je metabolicznie nieaktywnymi. Enterococcus faecalis wymagał stężenia 1,0%, aby uzyskać stały efekt. Robaki Caenorhabditis elegans wykazywały podobne preferencje w stosunku do leczonych szczepów OP50, jak również do pozorowanej kontroli leczonej.

Jednak czuły test parami ujawnił silniejszą preferencję dla próbnej kontroli traktowanej. Robaki na leczonym OP50 mają wyższą szybkość pompowania niż robaki na próbie traktowanej kontroli. Spożywanie leczonych bakterii skutkowało opóźnionym czasem rozwoju robaków typu dzikiego, a także obniżoną zdolnością składania jaj.

Długość życia robaków nie różniła się znacząco od siebie, niezależnie od źródła pożywienia. Jednak bakterie poddane działaniu paraformaldehydu wydłużyły żywotność robaków w obecności pięciu fluoro-dwóch deoksyurydyn. Spożycie bakterii poddanych działaniu paraformaldehydu przez długowieczny szczep robaków nie wpłynęło na jego długowieczność.