Name: Metodologia metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans przy użyciu paraformaldehydu. Ta technika pozwala izolować efekty metabolizmu bakteryjnego od fizjologii gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIH R21AG059117 oraz Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research na Uniwersytecie Michigan. SB był finansowany przez T32AG000114. ESK został sfinansowany przez NSF DGE 1841052.

1. Inokulacja bakterii
<ol>
	<li>Przygotować bulion Luria (LB), rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodu (NaCl) w 950 mL wody destylowanej.</li>
	<li>Dostosować pH pożywki LB do wartości 7,0 poprzez dodanie 5M wodorotlenku sodu (NaOH). Powinno to wymagać jedynie około 0,2 mL NaOH.</li>
	<li>Autoklawować pożywkę LB o skorygowanym pH w cyklu dla cieczy przez 45 min pod ciśnieniem 15 psi. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii w 100 mL LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 mL. Hodować bakterie przez noc w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Czas wzrostu bakterii może się różnić w zależności od kondycji kolonii bakteryjnej, wielkości kolby oraz ustawionej prędkości wytrząsania. Po około 14 h sprawdzić gęstość optyczną (OD) bakterii przy 600 nm (OD600).</li>
	<li>Zdjąć bakterie z wytrząsarki, gdy OD600 wyniesie 3,0 (1 x 109 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL). Jeśli OD600 jest niższa niż 3,0, ponownie umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką aż do osiągnięcia pożądanej wartości OD.</li>
	<li>Przenieść bakterie w alikwotach do stożkowych probówek o pojemności 50 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
2. Praca z paraformaldehydem
UWAGA: Stężenie użytego paraformaldehydu (PFA) oraz czas ekspozycji mogą się nieco różnić w zależności od klimatu, lokalizacji i rodzaju traktowanych bakterii. Dobrym punktem wyjścia dla OP50 jest ekspozycja na 0.5% PFA przez 1 h, natomiast dla HT115 wystarczające może być 0.25% PFA przez 1 h.
<ol>
	<li>Przygotować 32% roztwór stokowy PFA lub użyć zakupionego komercyjnie 32% roztworu PFA. Podczas pracy z PFA należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE). Należy nosić rękawice i ochronę oczu.</li>
	<li>Dodawać PFA w dygestorium chemicznym z odpowiednią wentylacją. Płukania oraz końcówki zawierające PFA należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na odpady chemiczne niebezpieczne znajdujących się w dygestorium.</li>
</ol>
3. Utrwalanie bakterii paraformaldehydem
<ol>
	<li>Gdy bakterie osiągną OD600 na poziomie 3.0, należy za pomocą pipety serologicznej przenieść 50 mL do nowej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mL. Pozostałą część należy zachować jako kontrolę żywą, kontrolę mock (patrz krok 4) lub wykorzystać do utrwalenia PFA w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Należy unikać przelewania cieczy z jednej kolby do drugiej i uważać, aby nie rozpryskać bakterii na ścianki nowej kolby. Kolonie na ściankach kolby mogą zostać poddane działaniu niższej dawki PFA.</li>
	<li>W dygestorium należy dodać 781 µL 32% PFA do 50 mL bakterii, aby uzyskać stężenie końcowe 0.5%. Zużyty końcówkę należy wyrzucić do pojemnika na odpady chemiczne stałe.</li>
	<li>Kolbę należy przykryć folią i ponownie umieścić w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C na 1 h. Po 1 h należy wyjąć kolbę z inkubatora i przejść do kroku 5.</li>
</ol>
4. Kontrola poddana zabiegowi pozorowanemu
<ol>
	<li>Gdy bakterie osiągną OD600 na poziomie 3,0, za pomocą pipety serologicznej przenieś 50 mL bakterii do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Przejdź do kroku 5.3, aby przeprowadzić etapy przemywania analogicznie do grupy traktowanej PFA.</li>
</ol>
5. Płukanie bakterii w celu usunięcia resztek PFA
<ol>
	<li>W dygestorium, używając pipety serologicznej, przenieś potraktowane bakterie z kolby Erlenmeyera do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Zastosowanie pipety serologicznej zamiast przelewania bakterii zapobiegnie kontaminacji koloniami bakteryjnymi znajdującymi się na krawędzi kolby, które mogły uniknąć bezpośredniego działania PFA.</li>
	<li>Wirowarkuj potraktowane bakterie przy przyspieszeniu około 3000 x g przez 20 min. Usuń nadsącz, wylewając go do pojemnika na odpady chemiczne w formie ciekłej w dygestorium.</li>
	<li>Dodaj 25 mL pożywki LB i wymieszaj na wortexie, aby resuspender osad bakteryjny (całkowite wypełnienie probówki utrudnia resuspensję osadu). Powtórz wirowanie i resuspensję osadu 4 razy.</li>
	<li>Resuspender osad w objętościach optymalnych dla poszczególnych analiz. W przypadku analiz przeżywalności, zaszczep płytki 60 mm za pomocą 200 µL bakterii resuspenderowanych w 10 mL pożywki LB. Resuspensja bakterii w 10 mL LB pozwala uzyskać 5-krotne stężenie w stosunku do oryginalnej hodowli 50 mL.</li>
	<li>Przechowuj bakterie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Kontrola jakości wzrostu bakterii
<ol>
	<li>Po końcowym przemyciu i resuspensji, wykonaj posiew bakterii na płytkę z podłożem LB (używając sterylnego końcówki do pipety). Dobrą praktyką jest również wykonanie posiewu LB użytego do mycia i resuspensji na oddzielnej płytce, aby upewnić się, że użyte podłoże nie było zanieczyszczone.</li>
	<li>Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc. Sprawdź, czy wystąpił wzrost. Bakterie uznaje się za martwe replikacyjnie, gdy na płytce LB nie rosną kolonie.</li>
</ol>
7. Kontrola jakości metabolizmu bakteryjnego z użyciem respirometru
<ol>
	<li>Po ostatnim przemyciu i resuspensji z kroku 5.4, potwierdź, że bakterie są metabolicznie martwe, korzystając z dostępnych narzędzi, takich jak respirometry19,20, oraz mierząc podstawowy wskaźnik zużycia tlenu (OCR).</li>
	<li>Przygotuj roztwór M9: Rozpuść 3 g fosforanu potasu jednowodnego (KH2PO4), 6 g fosforanu sodu dwuwodnego (Na2HPO4) oraz 5 g chlorku sodu (NaCl) w 950 mL wody destylowanej. Autoklawuj w cyklu dla cieczy przez 45 min przy 15 psi, a następnie pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodaj 1 mL 1 M siarczanu magnezu (MgSO4) i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nawilż wkład respirometru: Dodaj 200 µL kalibratora do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej. Umieść wkład w płytce 96-dołkowej i inkubuj przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Kalibracja testu: Następnego dnia umieść nawilżony wkład w urządzeniu i rozpocznij kalibrację.</li>
	<li>Przygotowanie testowej płytki do analizy: Korzystając z nowej płytki 96-dołkowej, dodaj 160 µL M9 i 40 µL przygotowanych bakterii (1 x 109 CFU/mL) do dołków testowych. Dodaj 200 µL M9 do 4 narożnych dołków, aby służyły jako dołki ślepe. Dodaj 160 µL M9 i 40 µL LB użytego do przemywania i resuspensji, aby służyły jako kontrole negatywne. Dodaj 200 µL M9 do pozostałych dołków, które nie będą używane.</li>
	<li>Przeprowadzenie analizy: Po zakończeniu kalibracji wkładu, włóż płytkę testową z kroku 7.5 do urządzenia w celu analizy. Ustawienia obejmują kroki mieszania, oczekiwania, pomiaru i pętli. Wyniki zostaną przedstawione jako wskaźnik zużycia tlenu (OCR). Bakterie są uznawane za metabolicznie martwe i gotowe do użycia, gdy OCR wynosi zero.</li>
</ol>
<img alt="Proces traktowania bakterii paraformaldehydem; schemat procedury laboratoryjnej i ustawienia eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65775/65775fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat postępowania przy traktowaniu paraformaldehydem. Pojedynczą kolonię bakterii E. coli OP50 hoduje się przez noc. Dodaje się PFA do stężenia końcowego 0,5%, a kulturę traktowaną PFA inkubuje z wytrząsaniem przez 1 h w 37 °C. Na koniec PFA usuwa się poprzez przemycie kultury świeżym LB 5x. Aby potwierdzić, że traktowane bakterie są niezdolne do replikacji, wykonuje się posiew bakterii na płytkę LB i inkubuje przez noc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65775/65775fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Bacterial Metabolic Inactivation in Caenorhabditis elegans Using Paraformaldehyde

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22Elegans+II%22">Elegans II</a>. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).</li>
<li>Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+worms%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).</li>
<li>Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+useful+model+for+studying+aging+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 554994(2020).</li>
<li>Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-derived+metabolites+in+regulating+the+development+and+physiology+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 14, 1035582(2023).</li>
<li>McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+FUdR+on+gene+expression+in+the+C.+elegans+bacterial+diet+OP50%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 207(2021).</li>
<li>Cabreiro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+retards+aging+in+c.+Elegans+by+altering+microbial+folate+and+methionine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism.</a> Cell. 153 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Worthy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+attractive+odorants+released+by+preferred+bacterial+food+found+in+the+natural+habitats+of+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans.</a> PLoS One. 13 (7), e0201158(2018).</li>
<li>Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+metabolite+synergizes+with+endogenous+serotonin+to+trigger+C.+elegans+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).</li>
<li>Kim, D. H., Flavell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+and+the+behavior+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).</li>
<li>Gems, D., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic%2C+behavioral%2C+and+environmental+determinants+of+male+longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).</li>
<li>Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vitamin-b2-sensing+mechanism+that+regulates+gut+protease+activity+to+impact+animal%27s+food+behavior+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth.</a> eLife. 6, e26243(2017).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Virk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+acts+in+E.+coli+to+accelerate+C.+elegans+aging+independently+of+bacterial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis.</a> Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).</li>
<li>Beydoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+food+source+for+metabolism+and+longevity+studies+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans.</a> Communications Biology. 4 (1), 258(2021).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Felix, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+and+immobilized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Permeabilized and immobilized cells.</a> Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).</li>
<li>Lobritz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+efficacy+is+linked+to+bacterial+cellular+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Shtonda, B. B., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+choice+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).</li>
<li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+tor+and+insulin+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C.</a> elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+C.+elegans+caused+by+bacterial+colonization+of+the+intestine+and+subsequent+activation+of+an+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response.</a> Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+sbt2055+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li>
<li>Kaeberlein, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).</li>
<li>Beaudoin-Chabot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfolded+protein+response+reverses+the+effects+of+glucose+on+lifespan+in+chemically-sterilized+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C.</a> elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889(2022).</li>
<li>Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+lifespan%2C+improved+perception%2C+and+enhanced+host+defense+of+Caenorhabditis+elegans+by+Lactococcus+cremoris+subsp%5BTitle%5D)+AND+%22cremoris.Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp.</a> cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421(2022).</li>
<li>Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+network+for+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).</li>
<li>Hastings, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wormjam%3A+A+consensus+C.+elegans+metabolic+reconstruction+and+metabolomics+community+and+workshop+series%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series.</a> Worm. 6 (2), e1373939(2017).</li>
<li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diets+differentially+alter+lifespan+and+healthspan+trajectories+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans.</a> Communications Biology. 3 (1), 653(2020).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cembio+-+the+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzyści z zabijania PFA w porównaniu z innymi metodami zabijania bakterii Leczenie PFA jest wysokoprzepustową metodą zapobiegania metabolizmowi bakterii przy jednoczesnym utrzymaniu pożywnego źródła pożywienia dla C. elegans. Zabijanie bakterii za pomocą PFA ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami. W przeciwieństwie do obróbki UV, gdzie każda płytka musi zostać przetestowana pod kątem skutecznego uśmiercenia, pojedyncza płytka z partii bakterii poddanych działaniu PFA może być testow...

Caenorhabditis elegans został pierwotnie zaproponowany jako organizm modelowy w 1965 roku1 i od tego czasu jest szeroko stosowany w badaniach nad genetyką, rozwojem, zachowaniem, starzeniem się i metabolizmem2. Ze względu na duży rozmiar lęgu i przezroczysty naskórek, C. elegans szczególnie dobrze nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych za pomocą fluorescencyjnych reporterów3. Ich krótki cykl życiowy, hermafrodytyczna reprodukcja i genetyczna homologia z ludźmi sprawiają, że C. elegans jest cennym systemem modelowym do badań nad rozwojem4 i aging biology5. Co więcej, C. elegans są stosunkowo łatwe w utrzymaniu. Robaki mogą być hodowane w płynnych kulturach lub na stałych płytkach agarowych i spożywać dietę złożoną z żywych bakterii Escherichia coli OP504.
Jednak źródło żywego pożywienia C. elegans może zakłócić badania nad metabolizmem, suplementacją leków i zachowaniem. Ponieważ żywe bakterie mają swój własny metabolizm, warunki eksperymentalne, które wpływają na bakterie, zmieniają również składniki odżywcze i metabolity dostępne dla robaków. Na przykład różnice w stężeniach żelaza, aminokwasów i folianów w bakteriach mają różny wpływ na rozwój, fizjologię i długość życia C. elegans6. Wiele powszechnych praktyk laboratoryjnych może wywołać takie zmiany w składzie składników odżywczych i metabolitach wytwarzanych przez OP50. W szczególności narażenie na 5-fluoro-2'-deoksyurydynę (FUdR), związek powszechnie stosowany w celu zapobiegania rozmnażaniu u C. elegans, wywołuje szerokie zmiany w ekspresji genu OP50, w tym szlaki biosyntezy aminokwasów7. Żywe bakterie mogą również zakłócić badania, w których C. elegans są uzupełniane małymi cząsteczkami, ponieważ bakterie mogą częściowo lub całkowicie metabolizować związki aktywne. Co więcej, wpływ tych małych cząsteczek na bakterie może z kolei zmienić fizjologię C. elegans, jak to miało miejsce w przypadku leku wydłużającego życie metforminy8. Wreszcie, żywe bakterie mogą zmieniać środowisko robaka w sposób, który zmienia zachowanie, takie jak wydzielanie atrakcyjnych substancji zapachowych9, wytwarzanie egzogennych neuromodulatorów10 i tworzenie gradientów tlenu w gęstym trawniku bakteryjnym11.
Aby złagodzić zakłócający wpływ metabolizmu bakterii na badania nad C. elegans, opracowano wiele metod zabijania bakterii (Tabela 1). Trzy popularne strategie zabijania OP50 to promieniowanie UV, zabijanie termiczne i antybiotykoterapia. Chociaż jest prosta i stosunkowo tania, każda z tych metod może mieć niepożądany wpływ zarówno na bakterie, jak i C. elegans. Zabijanie promieniami UV za pomocą sieciownika UV12 jest mało wydajne, a szybkość jest ograniczona liczbą płytek, które mogą zmieścić się w sieciowniku UV. Co więcej, skuteczność zabijania promieniami UV może się różnić w zależności od płytki w partii, a testowanie wzrostu na wszystkich płytkach może stać się trudne w dużych eksperymentach. Zabijanie ciepła OP50 poprzez wystawienie kultury na działanie temperatur >60 °C wiąże się z osobnym zestawem wyzwań. Wysoka temperatura może uszkodzić składniki odżywcze niezbędne dla robaka i zniszczyć strukturę komórkową bakterii, tworząc bardziej miękką teksturę, która skraca ilość czasu spędzanego przez robaki na jedzeniu13. Ta metoda również nie może być stosowana przez cały cykl życiowy C. elegans, ponieważ robaki karmione bakteriami zabitymi termicznie mogą zatrzymać się na wczesnym etapie rozwoju13. Antybiotykoterapia jest trzecią powszechną metodą hamowania metabolizmu bakterii14, ale antybiotyki mogą również wpływać na wzrost i metabolizm robaków15.
Jednym z rozwiązań pozwalających na wyeliminowanie metabolicznego wpływu żywych bakterii przy jednoczesnym zachowaniu struktury bakteryjnej i niezbędnych składników odżywczych jest zabicie OP50 za pomocą paraformaldehydu (PFA)16. PFA to polimer formaldehydu, który może sieciować białka w komórkach17, aby zapobiec replikacji bakterii bez niszczenia wewnętrznych struktur komórkowych, takich jak wewnętrzna błona plazmatyczna18. Ze względu na zachowanie wewnętrznej struktury komórkowej, bakterie traktowane PFA nie wykazują wzrostu ani aktywności metabolicznej, ale pozostają jadalnym i bogatym w składniki odżywcze źródłem pożywienia dla C. elegans16. Tutaj znajduje się szczegółowy protokół, który pokazuje, jak metabolicznie dezaktywować bakterie za pomocą paraformaldehydu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>metoda</td>
			<td>Wymagane materiały</td>
			<td colspan="2">Skalowalny?</td>
			<td>Odżywcze?</td>
			<td colspan="4">Wpływ na robaka?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">Sieciowanie UV</td>
			<td colspan="2">Ograniczone przez:</td>
			<td rowspan="4">Tak</td>
			<td colspan="4">Zmienny wpływ na długość życia NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Liczba płytek, które pasują do sieciownika UV</td>
			<td colspan="4">Zmienny wpływ na długość życia w FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas naświetlania na płytkę</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Zmniejszone preferencje żywieniowe16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Możliwość sprawdzenia każdej płytki pod kątem wzrostu8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Ciepło</td>
			<td rowspan="3">>60 °C inkubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Tak</td>
			<td rowspan="3">Nie: niszczy ścianę komórkową, obniża wartość odżywczą</td>
			<td colspan="4">Zatrzymanie rozwoju 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Zmniejszone preferencje żywieniowe13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przedłuża żywotność NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antybiotyki</td>
			<td rowspan="3">Antybiotyki (kanamycyna, karbenicylina, itp.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Tak</td>
			<td rowspan="3">Tak</td>
			<td colspan="4">Opóźnia wzrost i rozwój15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przedłuża żywotność w płynnych mediach19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Przedłuża żywotność NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0,5% Paraformaldehyd</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Tak</td>
			<td rowspan="3">Tak</td>
			<td colspan="4">Mały rozmiar lęgu zmniejsza sięo 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Małe wydłużenie czasu rozwoju16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Zmniejszone preferencje żywieniowe16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Porównanie metod zabijania OP50. Zabijanie promieniami UV, zabijanie ciepłem, antybiotykoterapii i leczenie PFA mają różny wpływ na stan odżywienia bakterii i zdrowie robaków karmionych leczonymi bakteriami. Te metody replikacyjnej inaktywacji E. coli różnią się również wymaganymi materiałami i skalowalnością.

<table><tbody><tr><td>Zszywki</td> <td>z folii aluminiowej</td><td>2549291</td><td></td></tr><tr><td>palnik Bunsena</td><td>VWR</td><td>470121-700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miernik gęstości komórek</td><td>Denville</td><td>80-3000-45&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorg</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg chemiczny</td><td>Labcono</td><td>975050411384RG</td><td></td></tr><tr><td>Probówki konkwarowe (50 ml)</td><td>Kuwety Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmyera</td><td>Fisher</td><td>250 ml: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Fisher</td><td>22-363-605</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425500</td><td></td></tr><tr><td>Butelka na odpady płynne</td><td>Thomas Scientific</td><td>1230G50</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (32%)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714-S</td><td>Paraformaldehyd &ndash; roztwór bez metanolu</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Easypet 3</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia plastikowe (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>P2853</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego i mikropłytka do hodowli komórkowych</td><td>Agilent</td><td>101085-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (50 ml)</td><td>Inkubator wytrząsarki Genesee Scientific</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>11 676 083</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro do zbierania odpadów stałych</td><td>M& M Industries</td><td>&nbsp; 5,0 galona M1 Tradycyjne wiadro</td><td></td></tr><tr><td>tryptonowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-251</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermo</td><td>11676331</td><td></td></tr><tr><td>Waga ważąca</td><td>C Goldenwall</td><td>HZ10K6B</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-255</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad caenorhabditis elegans

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans jest powszechnym organizmem modelowym do badań w zakresie genetyki, rozwoju, starzenia się, metabolizmu i zachowania. Ponieważ C. elegans spożywają dietę składającą się z żywych bakterii, aktywność metaboliczna ich źródła pożywienia może zmylić eksperymenty szukające bezpośredniego wpływu różnych interwencji na robaka. Aby uniknąć zakłócających skutków metabolizmu bakterii, naukowcy z C. elegans zastosowali wiele metod metabolicznej dezaktywacji bakterii, w tym promieniowanie ultrafioletowe (UV), zabijanie termiczne i antybiotyki. Obróbka UV jest stosunkowo niskoprzepustowa i nie może być stosowana w hodowli płynnej, ponieważ każda płytka musi zostać zbadana pod kątem skutecznego zabijania bakterii. Druga metoda leczenia, zabijanie termiczne, negatywnie wpływa na teksturę i jakość odżywczą bakterii, prowadząc do zatrzymania rozwoju C. elegans. Wreszcie, antybiotykoterapia może bezpośrednio zmienić fizjologię C. elegans, a także zapobiec rozwojowi bakterii. Niniejszy manuskrypt opisuje alternatywną metodę metabolicznej inaktywacji bakterii za pomocą paraformaldehydu (PFA). Leczenie PFA polega na sieciowaniu białek w komórkach bakteryjnych, aby zapobiec aktywności metabolicznej, przy jednoczesnym zachowaniu struktury komórkowej i wartości odżywczych. Ta metoda jest wysokoprzepustowa i może być stosowana w hodowlach płynnych lub na płytkach litych, ponieważ badanie jednej płytki bakterii traktowanych PFA pod kątem wzrostu weryfikuje całą partię. Inaktywacja metaboliczna poprzez leczenie PFA może być stosowana w celu wyeliminowania zakłócającego wpływu metabolizmu bakterii na badania suplementacji leków lub metabolitów, odporności na stres, metabolomiki i zachowania C. elegans.

Szczegółowy schemat procedury przedstawiono na Rysunku 1. Opracowano i zoptymalizowano wysokoprzepustową metodę spójnej inaktywacji replikacji bakterii (Rysunek 2A) i ich metabolizmu (Rysunek 2B) z wykorzystaniem paraformaldehydu16 na potrzeby badań metabolicznych i farmakologicznych w badaniach nad C. elegans. Celem było wyznaczenie najniższego stężenia PFA oraz najkrótszego czasu niezbędnego do spó...

Źródłem pożywienia dla Caenorhabditis elegans w laboratorium jest żywa Escherichia coli. Ponieważ bakterie są metabolicznie aktywne, stanowią zmienną zakłócającą w badaniach metabolicznych i lekowych u C. elegans. Szczegółowy protokół metabolicznej inaktywacji bakterii za pomocą paraformaldehydu opisano tutaj.

Metodologia metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

Wyzwaniem w badaniach nad C. elegans jest odizolowanie efektów diety opartej na żywych bakteriach od skutków manipulacji eksperymentalnych. Ustalenie, czy manipulacja ma bezpośredni wpływ na gospodarza, czy pośrednio wpływa na robaki poprzez interakcje mikrobiomu gospodarza, może być trudne. Bakterie poddane działaniu paraformaldehydu rozwiązują wyzwanie polegające na odizolowaniu efektów metabolizmu bakteryjnego od fizjologii gospodarza.Leczenie paraformaldehydem jest wysokoprzepustowe i konsekwentnie sprawia, że bakterie są replikacyjnie i metabolicznie nieaktywne. Oprócz swojej konsystencji, bakterie traktowane PFA pozostają smacznym i pożywnym źródłem pożywienia. Zacznij od zaszczepienia pojedynczej kolonii bakteryjnej w 200 mililitrach wysterylizowanego bulionu luria w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera.Hoduj bakterie przez noc w inkubatorze z wytrząsarką ustawioną na 37 stopni. Po 14 godzinach hodowli sprawdź gęstość optyczną bakterii na poziomie 600 nanometrów. Podziel bakterie na 50-mililitrowe stożkowe probówki i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania.Za pomocą pipety serologicznej przenieść 50 mililitrów kultury bakteryjnej do nowej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mililitrów. Oznacz probówki do kontroli na żywo lub pozorowanej leczenia. Użyj pipety serologicznej, aby przenieść 50 mililitrów bakterii do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu pozorowanej kontroli przed myciem.W kapturze chemicznym dodaj 781 mikrolitrów paraformaldehydu do kultury bakteryjnej, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5%Wyrzuć zużytą końcówkę do pojemnika na odpady chemiczne w postaci odpadów stałych. Następnie przykryj kolbę arkuszem folii i umieść ją w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Po zakończeniu inkubacji umyj bakterie, aby usunąć wszelkie pozostałości paraformaldehydu.W celu usunięcia pozostałości paraformaldehydu, za pomocą pipety serologicznej, przenieść leczone bakterie z kolby Erlenmeyera do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwiruj leczone bakterie w temperaturze około 3000 G przez 20 minut. Wyrzucić sklarowany osad do pojemnika na odpady chemiczne w stanie spoczynku ciekłego wewnątrz okapu chemicznego.Teraz dodaj 25 mililitrów bulionu luria do traktowanego i kontroluj granulki bakteryjne i wiruj, aby ponownie zawiesić granulki bakteryjne. Powtórzyć wirowanie i ponowne zawieszenie osadów cztery razy. Przygotowując się do różnych testów, ponownie zawiesić osad w odpowiednich objętościach.Do testów długości życia wysiewa się 200 mikrolitrów bakterii ponownie zawieszonych w 10 mililitrach bulionu luria na 60-milimetrowych płytkach. Przechowuj bakterie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić kontrolę jakości rozwoju bakterii, przetrzyj talerz bulionu luria przygotowanymi bakteriami za pomocą sterylnej końcówki pipety.Aby zweryfikować zanieczyszczenie, rozłóż bulion Luria używany do mycia i ponownego zawieszania na osobnym talerzu. Następnie umieść płytki na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia sprawdź, czy nie rozwijają się bakterie.Uratuj bakterie, jeśli przygotowanie paraformaldehydu zakończy się sukcesem, a kolonie nie wyrosną na płytce LB. Aby sprawdzić aktywność metaboliczną bakterii za pomocą respirometru, najpierw uwodnić wkład, dodając 200 mikrolitrów kalibru do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej. Umieść wkład w płytce 96-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ustaw maszynę na mieszanie, czekanie, mierzenie i pętlę. Następnego dnia umieść uwodniony wkład w urządzeniu. Do nowej 96-dołkowej płytki dodaj 160 mikrolitrów M9 do dołków testowych, a następnie 40 mikrolitrów przygotowanych bakterii.Dodaj 200 mikrolitrów M9 do czterech studzienek narożnych, aby działały jako ślepe próby. Dozować 160 mikrolitrów M9 i 40 mikrolitrów bulionu luria jako kontrole negatywne. Na koniec odpipetować 200 mikrolitrów M9 do pozostałych niewykorzystanych studzienek.Następnie zastąp wyrzuconą płytkę kalibracyjną płytką testową przed uruchomieniem programu. Wyniki zostaną wyświetlone jako wskaźnik zużycia tlenu. Różne szczepy wykazywały różne czasy reakcji inaktywacji na paraformaldehyd.Na przykład narażenie bakterii HB101 na 0,25% przez godzinę wystarczy, aby uczynić je metabolicznie nieaktywnymi. Enterococcus faecalis wymagał stężenia 1,0%, aby uzyskać stały efekt. Robaki Caenorhabditis elegans wykazywały podobne preferencje w stosunku do leczonych szczepów OP50, jak również do pozorowanej kontroli leczonej.Jednak czuły test parami ujawnił silniejszą preferencję dla próbnej kontroli traktowanej. Robaki na leczonym OP50 mają wyższą szybkość pompowania niż robaki na próbie traktowanej kontroli. Spożywanie leczonych bakterii skutkowało opóźnionym czasem rozwoju robaków typu dzikiego, a także obniżoną zdolnością składania jaj.Długość życia robaków nie różniła się znacząco od siebie, niezależnie od źródła pożywienia. Jednak bakterie poddane działaniu paraformaldehydu wydłużyły żywotność robaków w obecności pięciu fluoro-dwóch deoksyurydyn. Spożycie bakterii poddanych działaniu paraformaldehydu przez długowieczny szczep robaków nie wpłynęło na jego długowieczność.

methodology-to-metabolically-inactivate-bacteria-for-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans przy użyciu paraformaldehydu. Ta technika pozwala izolować efekty metabolizmu bakteryjnego od fizjologii gospodarza.

Metodologia metabolicznej dezaktywacji bakterii w badaniach nad Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów