Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych
19 stycznia 2024
Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.
Nasze badania koncentrują się na badaniu mechanizmów naprawy błony komórkowej zarówno w żywych komórkach, jak i w układach biomimetycznych zwanych gigantycznymi pęcherzykami jednowarstwowymi. Jesteśmy szczególnie zainteresowani zrozumieniem roli białek, takich jak aneksyny, w ułatwianiu naprawy powierzchni. Te skomplikowane procesy są badane przy użyciu naszej innowacyjnej techniki nakłuwania termoplazmonicznego.
Obecnie naprawa komórek jest badana przy użyciu laserów impulsowych w połączeniu z biologią molekularną w celu identyfikacji białek, które są rekrutowane do miejsca urazu. Wadą tego podejścia jest to, że trudno jest kontrolować zakres uszkodzeń spowodowanych użyciem laserów impulsowych. Obecnie nasze eksperymenty wiążą się z kilkoma wyzwaniami.
Pracujemy nad dostrojeniem ustawienia ostrości naszego lasera za pomocą nanocząsteczki, co ma kluczowe znaczenie dla precyzji. I chociaż może to być nieco trudne, aktywnie pracujemy również nad zminimalizowaniem tworzenia się nanopęcherzyków podczas procesu ogrzewania. Nasze badania wykazały, że białka aneksyny szybko reagują na napływ wapnia, odgrywając kluczową rolę w naprawie błony i ujawniając zróżnicowane zachowania poszczególnych anektyn.
Aby lepiej zrozumieć związane z tym mechanizmy, zwracamy się do systemów biomimetycznych, które pozwalają nam precyzyjnie zmierzyć, w jaki sposób aneksyny wpływają na zginanie błony w pobliżu otworu błonowego. Nasz protokół wychodzi naprzeciw potrzebie precyzyjnego zlokalizowania błony uszkodzonej w zdrowych komórkach. Dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów naprawy błon komórkowych w żywych organizmach.
Ponadto umożliwia badanie biofizycznej roli białek błonowych rekrutowanych do regionu anura w pobliżu główek porów w błonach biometrycznych. Na początek pokryj naczynie z mikrostudzienką 150 mikrolitrami 0,01% do 0,1% roztworu do mocowania komórek przed inkubacją. Po wysuszeniu naczynia na powietrzu dodaj kroplami 80 mikrolitrów roztworu nanocząstek złota na suchą powierzchnię.
Następnego dnia usuń dodane podłoże hodowlane z mikrostudzienki. Następnie dodaj dwa mililitry transfekowanych komórek na wierzch unieruchomionych nanocząstek złota na powierzchni szkła. Inkubować płytkę przed rozpoczęciem eksperymentów.
Użyj mikroskopu konfokalnego z laserem argonowym ustawionym na 488 nanometrów, aby zobaczyć fluorescencję GFP z białka aneksyny. Ustaw laser helowo-neonowy na 633 nanometry, aby obserwować odbicie nanocząstek złota. Wybierz pojedyncze komórki zamiast klastrów komórek, aby zapobiec nakładaniu się błon plazmatycznych.
Upewnij się, że unieruchomione nanocząstki złota są obecne jako pojedyncze cząstki i odpowiednio rozmieszczone, aby zapobiec zwiększonemu gradientowi termicznemu. Użyj pęsety optycznej, aby napromieniować nanocząstkę złota przez jedną sekundę, aby przerwać błonę plazmatyczną. Aby wygenerować gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe lub GUV, nałóż 90 mikrolitrów podgrzanego 5% żelu PVA na szkiełko
podstawowe.Rozprowadź żel równomiernie na szkiełku. Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia w komorze grzewczej w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 50 minut. Następnie za pomocą szklanej strzykawki nałóż 30 mikrolitrów mieszaniny lipidów.
Za pomocą krawędzi igły rozprowadź mieszaninę w cienkiej warstwie. Zastosuj delikatny przepływ azotu gazowego w celu odparowania chloroformu z mieszaniny lipidów. Następnie suszyć szkiełka w próżni przez 1,5 do dwóch godzin.
W osobnej dwumililitrowej probówce dodaj 400 mikrolitrów buforu do uprawy. Następnie dodać rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania do końcowego stężenia 500 nanomolowych. Odpipetować 400 mikrolitrów rozcieńczonego białka do zmontowanej komory wewnętrznej i owinąć komorę parafilmem.
Po godzinnej inkubacji przenieś 400 mikrolitrów zawartości komory do dwumililitrowej probówki. Dodaj jeden mililitr buforu obserwacyjnego do zebranego roztworu, aby usunąć wszelkie niekapsułkowane białka. Następnie odwirować roztwór o sile 600 G przez 10 minut w temperaturze 13 stopni Celsjusza.
Następnie zastąp jeden mililitr supernatantu buforem obserwacyjnym i delikatnie odpipetować, aby rozproszyć GUV. Wstaw do lodówki do rozpoczęcia eksperymentów. Aby nakłuć GUV, najpierw pokryj powierzchnię naczynia z 35-milimetrowym szklanym dnem beta-kazeiną.
Następnie dodaj pięć mikrolitrów 150-nanometrowych złotych nano powłok do mieszaniny GUV zawierającej chlorek wapnia. Przenieś mieszaninę do komory i zamontuj ją na stoliku mikroskopu. Użyj pęsety optycznej, aby uwięzić pojedynczą złotą nanopowłokę na powierzchni GUV.
Gdy uwięziona powłoka nano jest w bliskim kontakcie z membraną GUV, zwiększ moc lasera, aby przebić miejsce docelowe. Napromienianie nanocząstkami spowodowało uszkodzenie błony i spowodowało szybką rekrutację aneksin do miejsca urazu, po napływie wapnia w celu utworzenia struktury przypominającej pierścień. W eksperymentach GUV nakłucia membrany były szybko ponownie uszczelniane przy braku aneksin.
Unikalne właściwości biofizyczne białka aneksyny A4 doprowadziły do pęknięcia GUV ze względu na jego zdolność do zwijania błon. Obecność aneksyny w GUV powodowała szybką akumulację w miejscu urazu po nakłuciu błony. Analiza pierścieni aneksyny A5 w eksperymentach komórkowych wykazała, że pozostały one stałe w czasie i przestrzeni.
Rozerwanie błony plazmatycznej za pomocą termoplazmoniki spowodowało podwyższony poziom jonów wapnia. Komórki osiągnęły maksymalne natężenie wapnia po 6,6 sekundy, czyli w momencie, który przypuszcza się, że odpowiada czasowi zamknięcia rany.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje mechanizmy naprawy błony plazmatycznej w żywych komórkach oraz w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUVs), koncentrując się na roli białek aneksyn. Innowacyjna technika punktury termoplazmonicznej umożliwia precyzyjne uszkadzanie błony i wyjaśnia procesy rekrutacji oraz funkcje białek kluczowych dla naprawy błony.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Mechanizmy naprawy błony plazmatycznej
- Rola białek anneksyn
- Systemy biomimetyczne (GUV)
Wstęp
- Zrozumienie reakcji komórkowych na uszkodzenia błony
- Wyzwania związane z tradycyjnymi metodami laserowymi
- Potrzeba precyzyjnej kontroli procesu rozrywania błony
Zastosowane metody
- Technika punkcji termoplazmonicznej
- Żywe komórki i gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe
- Mikroskopia konfokalna i pęsety optyczne
Główne wyniki
- Szybka rekrutacja aneksyny nastąpiła po dopływie wapnia
- Aneksyna A4 spowodowała pękanie GUV w wyniku zwijania się błony
- Poziomy wapnia osiągnęły szczyt w 6,6 sekundy po nakłuciu, co pokrywało się z zamknięciem rany
Wnioski
- Wykazuje kluczową rolę białek annexin w naprawie błony
- Dostarcza cennych informacji na temat zachowania biofizycznego białek błonowych podczas odpowiedzi na uszkodzenie
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna analiza mechanizmów naprawy błony plazmatycznej ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka w wczesnych programach badawczych ukierunkowanych na odporność komórkową i integralność błon. Metoda punktury termoplazmonicznej umożliwia kontrolowaną, ilościową analizę rekrutacji białek oraz dynamiki błon, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i badaniach mechanistycznych. Podejście to usprawnia proces podejmowania decyzji dotyczących portfolio badawczego poprzez wyjaśnienie funkcjonalnych ról białek naprawczych zarówno w żywych komórkach, jak i w systemach modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację wpływu konkretnych białek, takich jak aneksyny, na naprawę błony.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowy pomiar rekrutacji białek i odpowiedzi błony.
- Ułatwia badanie ścieżek naprawy błony w oparciu o hipotezy, zarówno w systemach natywnych, jak i biomimetycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalną platformę do generowania zlokalizowanych uszkodzeń błony przy minimalnej fototoksyczności.
- Dostarcza ilościowych wyników dotyczących dynamiki białek i kinetyki uszczelniania błony.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania modulatorów wpływających na naprawę błony.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modelowe systemy błonowe do procesów komórkowych związanych z chorobami w celu poszukiwania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych naprawy.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez wyjaśnienie funkcji białek w kontekstach istotnych fizjologicznie.
Integracja potoków i przepływów pracy
To podejście termoplazmoniczne wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne, umożliwiając precyzyjną, ilościową analizę zdarzeń naprawy błony oraz funkcji białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków mechanizmów naprawy błon.
- Przesiewy: Zapewnia systemy gotowe do analiz, z powtarzalnymi, zlokalizowanymi uszkodzeniami i ilościowymi odczytami.
- Analityka: Umożliwia pomiar rekrutacji białek, napływu wapnia oraz kinetyki uszczelniania błon.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane w systemach modelowych z odpowiedziami żywych komórek w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje standaryzowaną, skalowalną platformę do powtarzalnych badań mechanistycznych i przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad naprawą błon.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i małoinwazyjne protokoły uszkadzania błon.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie funkcji celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i mechanizmów szlaków naprawczych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii konfokalnej, pęset optycznych oraz obchodzenia się z nanocząstkami.
- Konieczne jest precyzyjne wyrównanie i kalibracja systemów laserowych oraz nanocząstek.
- Wymagana jest rozbudowana infrastruktura analityczna do obrazowania ilościowego i śledzenia białek.
- Standaryzacja w obrębie systemów modelowych jest niezbędna dla zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Potencjalne ograniczenia obejmują tworzenie się nanopęcherzyków oraz złożoność techniczną manipulacji nanocząstkami.
