Name: Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj termoplazmoniczne nakłucie błon do badania naprawy błon komórkowych z udziałem białek aneksyńskich w żywych komórkach i wesykulach GUV. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować uszkodzenie i obserwować rekrutację białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Jesperowi Nylandstedowi za dostarczenie nam rekombinowanych białek aneksyny i plazmidów kodujących aneksyny. Prace te były wspierane finansowo przez Duńską Radę ds. Niezależnych Badań Nauk Przyrodniczych (DFF-4181-00196), Interdyscyplinarny Program Synergii 2018 Fundacji Novo Nordisk (NNF18OC0034936), Komitet Naukowy Duńskiego Towarzystwa Onkologicznego (R90-A5847-14-S2), Fundację Lundbeck (R218-2016-534) oraz Centrum Doskonałości Fundacji Lundbeck (Biomembrany w Nanomedycynie).

Laser Induced Thermoplasmonic Puncture for the Study of Plasma Membrane Repair

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniu podkreślono, że podejście termoplazmoniczne jest obiecującą techniką badania odpowiedzi białek w żywych komórkach i błonach modelowych po przerwaniu błony. Metoda ta dostarcza nie tylko obszernych informacji na temat rekrutacji białek, ale także na temat biofizycznej funkcji białek biorących udział w dynamice białko-błona. W związku z tym ułatwia identyfikację składników molekularnych odpowiedzialnych za naprawę powierzchni i pogłębia zrozumienie złożonej, ale istotnej maszynerii naprawy błon plazmatycznych. Chociaż istnieją różne metody indukowania przerwania błony, takie jak techniki mechaniczne, chemiczne i optyczne, metody te mają ograniczenia, takie jak brak specyficzności dla komórek, generowanie wielu uszkodzeń błony komórkowej lub powodowanie znacznych uszkodzeń błony komórkowej i ablacja wewnętrznego materiału komórkowego wzdłuż ścieżki lasera podczas korzystania z laserów impulsowych o dużej mocy. Podczas gdy integracja mikroskopii konfokalnej i pęsety optycznej dostarcza najbardziej wszechstronnych informacji, można również zastosować alternatywne metody obrazowania. Na przykład, ponieważ obrazowanie plazmonicznej nanocząstki uzyskuje się za pomocą mikroskopii refleksyjnej, wbudowanego trybu obrazowania w mikroskopach konfokalnych Leica, dodatkowe techniki obrazowania, takie jak mikroskopia ciemnego pola65,66, inne metody rozpraszania, takie jak iSCAT67,68 lub fluorescencyjne znakowanie nanocząstki, mogą być stosowane do wizualizacji AuNP, chociaż może to ograniczyć możliwość zastosowania metody.
Prezentowana metoda jest dodatkowo zdolna do indukowania nanoskopowych otworów w błonach modelowych, umożliwiając badanie efektów synergii między różnymi aneksynami. Osiąga się to poprzez enkapsulację różnie znakowanych rekombinowanych aneksyn, np. odpowiednio RFP i GFP, a następnie nakłucie termoplazmoniczne. Ten system modelowy zapewnia wgląd w to, w jaki sposób aneksyny oddziałują z membranami w pobliżu wolnych krawędzi, jak pokazano na rysunku 2D. Jednak w przeciwieństwie do komórek, wyrządzone GUV nadal się rozszerzają, a następnie następuje destabilizacja pęcherzyka. Obrazowanie ewolucji otworu za pomocą mikroskopii konfokalnej może być trudne ze względu na szybkie rozszerzanie się średnicy otworu, ale można to osiągnąć, rejestrując kilka stosów z w czasie. Alternatywną metodą byłoby użycie wirującego dysku konfokalnego w celu szybszego obrazowania. Co więcej, podejście termoplazmoniczne zazwyczaj daje ograniczoną liczbę optymalnych wyników na godzinę w przypadku zastosowania do pojedynczych komórek lub eksperymentów GUV, zwykle od dwóch do trzech, w temperaturach próbki od 20 °C do 30 °C. Aby uzyskać najdokładniejszą obserwację dynamiki białko-błona, zaleca się przechowywanie komórek w buforze zawierającym HEPES i wymianę próbki co godzinę. Alternatywnie, okno doświadczalne można rozszerzyć, przeprowadzając doświadczenia w komorze inkubacyjnej komórki, tj. w stałej temperaturze 37 °C z 5%CO2. Co więcej, połączenie tego podejścia z innymi technikami obrazowania, takimi jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), może zapewnić głębsze zrozumienie funkcji biofizycznych i interakcji kluczowych białek zaangażowanych w naprawę błony na poziomie pojedynczej cząsteczki. Może to dostarczyć szczegółowych informacji na temat miejsca urazu, w tym geometrii rany i lokalizacji białek aneksyny, a także zidentyfikować inne kluczowe czynniki zaangażowane w naprawę powierzchni błony.
Aby osiągnąć maksymalną skuteczność i precyzję w wywoływaniu uszkodzenia błony, konieczne jest sprawdzenie położenia ogniska laserowego przed każdym eksperymentem i upewnienie się, że położenie osiowe ogniska lasera pokrywa się z ogniskiem konfokalnym. To wyrównanie optymalizuje intensywność podczas obrazowania AuNP, co prowadzi do maksymalnego wzrostu temperatury lokalnej i w konsekwencji uszkodzenia błony przy niższej mocy lasera. Proces ten jest wykonywany ręcznie, a zatem podatny na zmienność skuteczności pękania błony, ponieważ ognisko jest ręcznie przesuwane na pozycję, która pokrywa się z położeniem cząstki. W mikroskopach, które nie mają trybu odbicia, jak w niektórych systemach komercyjnych, kolokacja ogniska lasera i cząstki może być wyzwaniem. W takich przypadkach można zastosować alternatywne tryby obrazowania (np. jasne pole) i wykonać powolne skanowanie rastrowe wokół oczekiwanej pozycji cząstek. Należy zauważyć, że niska moc lasera może wywołać tylko przepuszczalność membrany, podczas gdy wysoka moc lasera może generować temperatury wokół NP, które przekraczają temperaturę wrzenia wody, nawet jeśli powierzchnia szkła ma efekt chłodzenia. Szacuje się, że tworzenie się nanopęcherzyków otaczających nanocząsteczki zachodzi między 200 °C a 300 °C 25,48, gdzie wybuchowe ciepło może powodować przemieszczenie cząstek z ogniska lasera lub fragmentację cząstek. Dodatkowo tworzenie się nanopęcherzyków lub mikropęcherzyków podczas ogrzewania stanowi wyzwanie dla tej metody. Ponieważ interfejsy powietrzne odwilżają błony i mogą powodować destabilizację białek, co jest niepożądane, konieczne jest ograniczenie ogrzewania podczas badania naprawy membrany. Warto zauważyć, że złote nanopowłoki nie tolerują wysokich temperatur i ulegają degradacji w tych warunkach, jak wykazano za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości58.
W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół stosowania termoplazmoniki do wykonywania wysoce zlokalizowanych nakłuć w błonach, który ma zastosowanie zarówno do komórek, jak i błon modelowych. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć zakres ogrzewania, można wykorzystać mniejsze nanocząstki rezonansujące ze światłem NIR, umożliwiające wewnątrzkomórkowe nakłucia w endosomach, retikulum endoplazmatycznym i otoczce jądrowej. Takie nanocząstki, w tym pręciki i nanomatrioszki48, mogą być wykorzystywane do badania naprawy otoczki jądrowej poprzez celowanie w endocytozowane nanocząstki złota, które są łatwo wychwytywane na powierzchni komórki i transportowane w kierunku jądra69. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta umożliwia identyfikację i badanie kluczowych składników molekularnych zaangażowanych w PMR, wyjaśniając ich biofizyczną funkcję i rolę, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek.

Błona komórkowa, pełniąc funkcję zarówno bariery fizycznej, jak i platformy sygnałowej, ma kluczowe znaczenie dla przeżycia komórki1. W trakcie całego cyklu komórkowego błona plazmatyczna (PM) ulega uszkodzeniom, takim jak urazy wywołane stresem mechanicznym2,3,4,5 oraz chemicznym6. Aby zachować integralność błony i zapewnić przeżycie komórki, wyewoluowały ona skuteczne mechanizmy naprawy błony plazmatycznej (PMR). Mechanizmy te opierają się na różnych strategiach, takich jak reorganizacja cytoszkieletu, fuzja błon oraz strategie wymiany błony7,8,9,10,11, z których wszystkie zależą od rekrutacji specyficznych białek. W szczególności członkowie rodziny białek aneksyn zostali zidentyfikowani jako kluczowe białka związane z procesami PMR1,9,12,13,14,15,16. Po uszkodzeniu PM w komórce następuje napływ jonów wapnia (Ca2+), co stanowi bezpośrednie zagrożenie dla przeżycia komórki17. W odpowiedzi na napływ Ca2+ białka aneksyny, zlokalizowane głównie w cytozolu, wiążą się z wewnętrzną warstwą uszkodzonej błony plazmatycznej w ramach strategii PMR18. Aneksyna A2 (ANXA2) była jednym z pierwszych członków rodziny aneksyn powiązanych z PMR w dystrofii mięśniowej z niedoborem dysferliny; zasugerowano, że pośredniczy ona w naprawie poprzez fuzję pęcherzyków wewnątrzkomórkowych z PM w pobliżu miejsca urazu5,19,20,21. Następnie aneksynom przypisano szereg funkcji22, a ich rola w PMR zyskała zwiększoną uwagę w ciągu ostatnich 20 lat. Jednak dokładna rola aneksyn w procesie PMR nie jest jeszcze w pełni zrozumiana15,18,21,22.
Niniejszy artykuł proponuje metodę badania oddziaływań białko-błona oraz dynamiki błon w sposób kontrolowany i wysoce zlokalizowany, wykorzystując kombinację mikroskopii konfokalnej, pęsety optycznej i nanocząsteczek złota (AuNPs). Metoda ta umożliwia ilościowe badanie oddziaływań białek, lipidów i małych cząsteczek w odpowiedzi na uszkodzenie błony i napływ jonów Ca2+. Pomimo złożoności i wielości komponentów biorących udział w procesie naprawy błony, do uzyskania głębszego zrozumienia mechanizmów dynamiki błon oraz odpowiedzi białek z rodziny aneksyn na przerwanie ciągłości błony16 wykorzystano uproszczone systemy błonowe naśladujące błonę plazmatyczną. Jako modelowy system błonowy o określonym składzie lipidowym wybrano gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (GUVs). GUVs generowano metodą hydratacji wspomaganej żelem, a konkretnie hydratacją w żelu z alkoholu poliwinylowego, zgodnie z opisem Weinbergera i wsp.23, co pozwoliło na efektywną enkapsulację aneksyn wewnątrz GUVs.
Wykorzystanie naświetlania laserem w bliskiej podczerwieni (NIR) na nanocząstkach metalicznych (NP) indukuje znaczne nagrzewanie NP, co czyni tę metodę skutecznym sposobem tworzenia lokalnego źródła ciepła wykorzystywanego w zastosowaniach biomedycznych24. Metoda ta była początkowo stosowana do bezpośredniego pomiaru temperatury w otoczeniu pojedynczej AuNP w biomimetycznych testach 2D i 3D. W testach tych25,26 nanocząstki plazmoniczne naświetlano na podpartym dwuwarstwowym układzie lipidowym lub uwięziono optycznie w pobliżu GUV, które pod wpływem lokalnego nagrzewania przechodziły lokalne przejście fazowe termiczne, co umożliwiło kwantyfikację i kontrolę dokładnego profilu temperatury wokół cząstki. Ten referencyjny profil temperatury był wykorzystywany podczas badania lub manipulowania preparatami biologicznymi. Dalszy rozwój tej metody umożliwił indukowanie nanoscopyjnych porów w membranach27, co pozwoliło na fuzję pęcherzyków i komórek28,29. W innych badaniach analizowano zachowanie peryferyjnych białek błonowych w GUV29 oraz białek transbłonowych30 poprzez tworzenie nowatorskich pęcherzyków hybrydowych, natomiast badano również komórkową dostawę leków w celu kontroli i analizy odpowiedzi komórkowych lub ekspresji genów28,29,31,32,33. Niedawno metoda ta została wykorzystana do badania odpowiedzi białek na uszkodzenia błon32,34,35.
Istnieje wiele metod uszkadzania błony plazmatycznej w celu badania odpowiedzi komórkowych i naprawy błony. Obejmują one nakłuwanie mikroigłami, wstrząsanie mikrokulkami oraz skrobanie komórek, z których każda może mechanicznie przerwać ciągłość błony komórkowej14,36,37. Uszkodzenia indukowane chemicznie można osiągnąć poprzez dodanie detergentów5,38 lub toksyn bakteryjnych39,40, które destabilizują dwuwarstwę lipidową i tworzą pory w błonie plazmatycznej. Ponadto do badania składników PMR, takich jak białka anneksyny5,14,21,41, wykorzystywano obrażenia indukowane optycznie za pomocą laserów ciągłych i impulsowych w połączeniu z nanocząsteczkami plazmonicznymi42,43,44,45. Pomimo wydajności wysokomocnych laserów impulsowych, mogą one powodować znaczne obrażenia i uszkodzenia wnętrza komórki wzdłuż drogi wiązki. Co więcej, szczegółowe zmiany zachodzące w materii biologicznej pod wpływem naświetlania laserem impulsowym oraz kwestia tego, czy tworzy on wyraźnie zdefiniowany por, wymagają dalszych badań. W niniejszym artykule przedstawiono alternatywną metodę wykorzystującą termoplazmonikę do kontrolowanego indukowania nanoscopicznych otworów w PM34,35 bez powodowania znacznych uszkodzeń struktur wewnętrznych. Osiąga się to poprzez poddawanie plazmonicznych NPs silnie skupionej wiązce lasera NIR, co skutkuje niezwykle zlokalizowanym wzrostem temperatury, która może łatwo przekroczyć 200 °C, prowadząc do niewielkich nanoscopicznych eksplozji25,46,47. Proces ten można kontrolować poprzez regulację intensywności lasera, a także rozmiaru, kształtu i składu NPs48. Stosując tę technikę, badacze mogą zgłębić rolę białek w naprawie PM w żywych komórkach, co może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre nierozwiązane pytania dotyczące zaangażowania białek anneksyny w naprawę błony bez naruszania żywotności komórek.
Optyczne pułapkowanie nanocząstek plazmonicznych zostało dobrze opisane w poprzednich badaniach25,49,50,51,52; jednak dodatkowe informacje dotyczące właściwości termoplazmonicznych nanocząstek53,54,55 można znaleźć w materiałach uzupełniających (Supplementary File 1). Metoda termoplazmoniczna może być wykorzystana do tworzenia nanoscopyjnych otworów w PM w celu badania odpowiedzi komórkowej i mechanizmów naprawczych. Dokładniej, nakłucie można osiągnąć poprzez optyczne ogrzewanie AuNPs w bliskim sąsiedztwie błony, jak pokazano na Rysunkach 1A i B. To zlokalizowane nakłucie umożliwia napływ Ca2+, co zostało zweryfikowane za pomocą czujnika wapnia, aktywując tym samym mechanizmy PMR. W eksperymentach na żywych komórkach AuNPs o średnicy 200 nm zostały unieruchomione na powierzchni pod komórką, aby monitorować rolę ANXA2 w PMR za pomocą mikroskopii konfokalnej. Laser NIR (Rysunek 1A,B) o długości fali 1064 nm naświetla AuNP, wykorzystując jego właściwości plazmoniczne (Rysunek 1C), co skutkuje znacznym lokalnym nagrzaniem (Rysunek 1D) w biologicznym oknie przejrzystości49, powodując jednocześnie minimalne uszkodzenia samej komórki. Obszar wysokiej temperatury otaczający AuNP szybko maleje o 30-40% w odległości odpowiadającej promieniowi NP, jak przedstawiono na Rysunku 1E, co pozwala na uzyskanie niezwykle ograniczonego uszkodzenia we wszystkich trzech wymiarach.
Plik uzupełniający 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary%20File%201_updated.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<img alt="Nagrzewanie nanocząsteczek złota; oddziaływanie lasera NIR; odpowiedź termiczna; schemat; analiza fototermiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny zarys metody eksperymentalnej. (A) Komórki z transfekcją ANXA znajdują się nad unieruchomionymi na powierzchni nanocząsteczkami złota (AuNPs), lub (B) gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) z enkapsulowanym ANXA są zawieszone w medium zawierającym AuNPs. (C) Pojedyncza nanocząsteczka AuNP jest naświetlana przez pułapkę optyczną NIR, gdzie oddziaływanie między nadchodzącym polem elektromagnetycznym a elektronami przewodnictwa prowadzi do kolektywnych oscylacji elektronów wewnątrz nanocząsteczki. (D) Proces ten skutkuje silnie ograniczonym, lecz znacznym wzrostem temperatury. Aby oszacować temperaturę na powierzchni nanocząsteczki, zastosowano teorię Mie, a następnie obliczono (E>) profil temperatury dla AuNP o średnicy 200 nm i natężeniu lasera I = 6.36 x 108 W/cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby zminimalizować efekt termiczny na błonie komórkowej, AuNPs są naświetlane tylko przez około 1 sekundę. Powoduje to przejściowy i lokalny wzrost temperatury, co ogranicza uszkodzenia białek, które zazwyczaj wymagają więcej czasu na rozfałdowanie. Po przebiciu błony, białka aneksyny są rekrutowane w ułamku sekundy, a w ciągu kilku sekund wokół miejsca uszkodzenia tworzy się pierścieniowata struktura aneksyn (Rysunek 2). Podejście to zastosowano również w celu zbadania udziału ANXA5 zarówno w żywych komórkach, jak i w błonach modelowych16, aby wyjaśnić pełny schemat procesów naprawczych. Choć głównym punktem zainteresowania była korelacja rekrutacji różnych białek aneksyn, aspekty biofizyczne mechanizmu naprawy nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione.
Do pełnego wdrożenia proponowanej metody wymagane są trzy kluczowe komponenty: mikroskopia konfokalna, pęseta optyczna oraz nanocząstki metaliczne. Pęseta optyczna służy do wychwytywania AuNPs, a jej konstrukcja może zostać zrealizowana zgodnie z procedurą opisaną przez Neumana i wsp.49. Jednak w przypadku, gdy budowa pęsety optycznej okaże się zbyt trudna, do naświetlania AuNPs unieruchomionych pod komórkami można zastosować silnie skupiony laser NIR. Choć w niniejszym protokole wybrano sferyczne AuNPs, do uzyskania silnie zlokalizowanego gradientu temperatury w obszarze NIR można wykorzystać również różne cząstki plazmoniczne o regulowanym widmie absorpcyjnym48.
Obrazowanie fluorescencyjne jest niezbędne do obserwacji roli białek znakowanych fluorescencyjnie, w związku z czym mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)56 mogłaby być rozważana jako alternatywa dla obrazowania konfokalnego. Jednak technika ta pozwala jedynie na obrazowanie powierzchni i nie byłaby kompatybilna z eksperymentami z pęcherzykami błon modelowych. W konsekwencji zarówno pęseta optyczna, jak i mikroskop konfokalny są niezbędne do precyzyjnej lokalizacji nanocząsteczki oraz szczegółowego badania obszaru lokalnego wokół uszkodzenia komórki. Aby efektywnie napromieniować nanocząsteczkę za pomocą ograniczonej dyfrakcyjnie plamki lasera, konieczna jest wizualizacja tej nanocząsteczki. Można to osiągnąć optymalnie za pomocą mikroskopii refleksyjnej, która jest standardową funkcją obrazowania w mikroskopach konfokalnych Leica. Jeśli jednak obrazowanie w odbiciu lub rozproszeniu nie jest dostępne, można rozważyć metody alternatywne, takie jak mniej wydajne znakowanie AuNP fluorescencyjnie.
Podsumowując, przedstawiona w niniejszym badaniu wysoce kontrolowana i zlokalizowana metoda termoplazmoniczna ma potencjał, aby służyć jako doskonała platforma do badania komponentów molekularnych zaangażowanych w odpowiedzi komórkowe oraz mechanizmy naprawy błony plazmatycznej (PM) w żywych komórkach. Poza badaniem odpowiedzi białek na uszkodzenie PM, podejście to może być również wykorzystane do lokalnego perforowania pęcherzyków, co umożliwia badanie odpowiedzi białek zarówno w dynamice białko-białko, jak i białko-błona. Co więcej, metoda ta pozwala na ilościową analizę oddziaływań między białkami, lipidami i małymi cząsteczkami w momencie przerwania ciągłości błon. Łącznie postępy te mają potencjał, aby rzucić światło na niektóre nierozwiązane kwestie dotyczące zawiłego i złożonego mechanizmu naprawy błony plazmatycznej.

<table><tbody><tr><td>Laser pułapkowy 1064 nm</td><td>Spectra Physics</td><td>N/A</td><td>Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser</td></tr><tr><td>160 nm Złote nanopowłoki</td><td>NanoComposix</td><td>NCXGSIR150</td><td></td></tr><tr><td>200 nm Nanocząstki złota</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC200/7</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szklana powierzchnia MatTex microwell</td><td>MATTEK</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła bursztynowego</td><td>Supelco Sigma Aldrich</td><td>243438</td><td></td></tr><tr><td>Annexin A2 plazmidy</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Otrzymane od naszego współpracownika w Duńskim Centrum Badań nad Rakiem</td></tr><tr><td>Aneksyna A4 rekombinowane białko&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>N-końcowego GFP oznaczonego ANXA4 otrzymanego od naszego współpracownika w Duńskim Centrum Badań nad Rakiem</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko Aneksyna A5&nbsp;</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy Nie dotyczy <td>N-terminala GFP oznaczonego ANXA5 otrzymanego od naszego współpracownika w Duńskim Centrum Badań nad Rakiem</td></tr><tr><td>beta-kazeiny</td><td>Sigma Life Science</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Suprlco (sigma Aldrich)</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Chemicals</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (Nunclon Delta Surface)</td><td>Thermo scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Znakowanie komórek DID Roztwór</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>7757</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>rozpuszczona w chloroformie&nbsp;</td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035C</td><td>Rozpuszczony w chloroformie</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eage's Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ dystrybucja ImageJ2</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6s-CAAX</td><td></td><td>N/A</td><td>Otrzymane od naszego współpracownika w Duńskim Centrum Badań nad Rakiem</td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Naukowe</td><td>11573397</td><td>10% pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>PROLABO</td><td>24 374.297</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Hamilton</td><td>Company</td><td>N/A</td><td>50 i 500 mikrolitrów</td></tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner PDG-002</td><td>Harrick Plasma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td></td><td>N/A</td><td>Otrzymane od naszego współpracownika w Duńskim Centrum</td></tr> <tr><td>Badań nad RakiemLeica Akustyczno-Optyczny Rozdzielacz Wiązki (AOBS)</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie Leica PL APO 63x, NA = 1.2</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP5</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15338030</td><td></td></tr><tr><td>MatLab</td><td>The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Podłoże o obniżonej surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>1% pożywki Sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Stopień piezoelektryczny (PI 731.20)</td><td>&nbsp; Physik Instrumente (Niemcy)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-100ML</td><td>0,01-0,1% do powlekania</td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>363065-25G</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko okrągłe 25 mm i Oslash;</td><td>VWR</td><td>631-1584</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Brandson 2800</td><td>Brandson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma Life Science</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T25</td><td>Falcon</td><td>353108</td><td>Niebieska wentylowana nasadka</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285901</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590626</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; VWR Mieszarka mini vortex 230V EU</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 12620-84</td><td>&nbsp; ECN: 444-2790, SN: 150713022</td></tr></tbody></table>

termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

Błona komórkowa jest kluczowa dla przetrwania komórki, a zapewnienie jej integralności jest niezbędne, ponieważ komórka doświadcza urazów przez cały cykl życia. Aby zapobiec uszkodzeniom błony, komórki rozwinęły skuteczne mechanizmy naprawy błony plazmatycznej. Te mechanizmy naprawcze można badać, łącząc mikroskopię konfokalną i termoplazmonikę w nanoskali w celu zidentyfikowania i zbadania roli kluczowych białek, takich jak aneksyny, zaangażowanych w naprawę powierzchni w żywych komórkach i systemach modelowych błon.
Metoda nakłuwania wykorzystuje laser do wywołania wysoce miejscowego ogrzewania po napromieniowaniu nanocząsteczkami. Zastosowanie światła bliskiej podczerwieni minimalizuje fototoksyczność w próbce biologicznej, podczas gdy większość absorpcji zachodzi w rezonansowej nanocząstce plazmonicznej w bliskiej podczerwieni. Ta metoda termoplazmoniczna została wykorzystana w potencjalnych badaniach fototermicznych i biofizycznych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów wewnątrzkomórkowych i odpowiedzi komórkowych poprzez badania fuzji pęcherzyków i komórek. Podejście to okazało się komplementarne z istniejącymi metodami rozrywania błony, takimi jak urazy wywołane mechanicznie, chemicznie lub optycznie, i zapewnia wysoki poziom kontroli poprzez zadawanie skrajnie zlokalizowanych urazów. Zakres uszkodzenia jest ograniczony do okolic sferycznej nanocząstki i nie dochodzi do szkodliwych uszkodzeń wzdłuż ścieżki wiązki, w przeciwieństwie do laserów impulsowych wykorzystujących różne długości fal. Pomimo pewnych ograniczeń, takich jak tworzenie się nanopęcherzyków, metoda termoplazmoniczna oferuje unikalne narzędzie do badania odpowiedzi komórkowych w naprawie błony plazmatycznej w prawie natywnym środowisku bez uszczerbku dla żywotności komórek.
Po zintegrowaniu z mikroskopią konfokalną, metoda nakłuwania może dostarczyć mechanistycznego zrozumienia dynamiki błony w modelowych systemach błonowych, jak również ilościowych informacji na temat reakcji białek na uszkodzenie błony, w tym rekrutacji białek i ich funkcji biofizycznej. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tej metody do zredukowanych systemów modelowych może poszerzyć naszą wiedzę na temat skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej w żywych komórkach.

W niniejszym badaniu metoda termoplazmoniczna została wykorzystana do zbadania odpowiedzi białka anneksyny na przerwanie błony plazmatycznej; jednakże za pomocą tego testu można zbadać każde białko, które może zostać zrekrutowane w wyniku uszkodzenia błony, pod warunkiem, że odpowiednie białko zostanie znakowane fluorescencyjnie. Rekrutacja i funkcja białek są monitorowane za pomocą obrazowania konfokalnego zarówno w ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK293T), jak i w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUVs). Szczegółowo, Rysunek 2 przedstawia warunki eksperymentalne, w których skupiona wiązka lasera NIR o długości fali 1064 nm jest używana do naświetlania pojedynczej AuNP (Rysunek 2A), co skutkuje uszkodzeniem błony i napływem Ca2+ do komórki, aktywując mechanizm PMR. Następnie anneksyny są szybko rekrutowane do miejsca uszkodzenia, gdzie wiążą się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na obwodzie rany, tworząc w ciągu kilku sekund strukturę pierścieniowatą (Rysunek 2B, i-iv). Eksperymenty na modelowych błonach z użyciem GUVs wykazały, że perforacje błony zostały szybko zamknięte w przypadku braku ANXA, jak pokazano na Rysunku 2C. Jednak w obecności ANXA po perforacji błony zaobserwowano szybką akumulację ANXA w miejscu uszkodzenia (Rysunek 2D). Co istotne, ANXA kontynuowała rolowanie odsłoniętych krawędzi, co ostatecznie doprowadziło do pęknięcia GUV. Przypuszcza się, że ten mechanizm rolowania wynika ze zdolności ANXA do indukowania krzywizny i zginania błon lipidowych20.
<img alt="Proces translokacji błonowej AuNP; schematy przedstawiają przejście nanocząstek i powiązaną z tym analizę mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Odpowiedź anneksyn (ANXAs) na indukowane termoplazmonicznie przerwanie błony. Początkowo (A) błona plazmatyczna działa jako bariera pomiędzy środowiskiem pozakomórkowym o wysokim stężeniu jonów Ca2+ a środowiskiem wewnątrzkomórkowym z enkapsulowanymi ANXAs. Po naświetlaniu laserem bliskiej podczerwieni (NIR), AuNP generuje znaczną ilość ciepła, co powoduje przerwanie błony i dopływ jonów Ca2+. W konsekwencji aktywowany zostaje mechanizm naprawy błony plazmatycznej (PMR), który obejmuje rekrutację ANXAs do miejsca uszkodzenia, gdzie wiążą się one z ujemnie naładowanymi fosfolipidami. (B-D) Obrazy z mikroskopii konfokalnej komórki zawierającej ANXA2 oraz GUV zawierającej ANXA4 obrazują ten proces. (i) Przed naświetlaniem obrazy przedstawiają nienaruszoną komórkę lub GUV, a miejsca naświetlania zaznaczono białymi strzałkami. (ii) Po naświetleniu nanocząstek (B) ANXAs są szybko rekrutowane do miejsca uszkodzenia, tworząc strukturę pierścieniowatą wokół rany w błonie (B [ii-iv]). Panel (C) przedstawia GUV z barwioną błoną, ale bez ANXA, która po przebiciu szybko się zamyka, bez widocznego przebudowania błony. Z kolei panel (D) pokazuje GUV zawierającą rekombinowaną ANXA4, która jest już związana z błoną przed (i) naświetlaniem z powodu wycieku Ca2+ przez błonę. (ii) Po przebiciu ANXA4 wiąże się z wolnymi krawędziami, co powoduje zapadnięcie się GUV w miarę jak błona zwija się od krawędzi. Paski skali wynoszą 10 μm dla rysunku (B), 2 μm dla B (i), 10 μm dla (C) i 15 μm dla (D). Rycina ta została powielona z pracy Moreno-Pescador et. al16 za zgodą Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Analiza kompletnych struktur pierścieniowatych ANXA (Rycina 2B oraz Rycina uzupełniająca 1) dostarcza cennych informacji na temat rozmiaru i morfologii rany. Promień struktury pierścieniowatej ANXA można określać w czasie i przestrzeni, zgodnie z opisem w sekcji 5. Moreno i wsp.16 przeanalizowali ponad 135 uszkodzeń błony plazmatycznej w żywych komórkach, gdzie analiza struktur pierścieniowatych ANXA5 została przedstawiona na Rycini 3. Promień wyznaczano poprzez pomiar odległości od środka pierścienia do zewnętrznego promienia krzywej na podstawie pełnej szerokości połowicznym maksimum (FWHM) zredukowanego profilu intensywności (Rycina 3A). Wyniki wykazały heterogeniczny rozkład rozmiarów pierścieni ANXA5 (Rycina 3B), które pozostawały stałe w czasie (Rycina 3D,G,H) i przestrzeni (Rycina 3C,E,F). Wyniki te sugerują akumulację ANXA5 wokół miejsc uszkodzeń, co wskazuje na alternatywną dla hipotetycznego lejkowatego pączkowania do wewnątrz uszkodzonej błony5 strategię PMR zależną od ANXA5 w żywych komórkach.
<img alt="Analiza naprawy błony komórkowej, wykresy i obrazy mikroskopowe, intensywność fluorescencji, dane dotyczące nachylenia rany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Analiza struktur pierścieniowych ANXA5 wokół miejsca uszkodzenia w żywych komórkach. (ASchematyczny rysunek przedstawia podejście analityczne, oparte na pełnej szerokości połówce maksymalnej profilu intensywności linii ANXA.BHistogram przedstawia promienie 135 zmierzonych pierścieni ANXA5.C) Profile intensywności fluorescencji wzdłuż linii przecinających pierścień ANXA5-GFP dla każdego przekroju z serii z-stack. (DObrazy konfokalne przedstawiają ewolucję czasową rany, w której ANXA5-GFP gromadzi się na obwodzie rany bezpośrednio po urazie, po czym następuje stabilizacja rany. Klatki czasowe oznaczone numerami 1–6 zostały zarejestrowane w odstępach 0,66 s między klatkami. Pasek skali wynosi 2 μm. (EPromienie ran określono jako funkcję głębokości rany w oparciu o metodę przedstawioną w panelu A.FNachylenie rany analizowano jako promienie pierścieni ANXA5 w funkcji wysokości z na podstawie danych wyekstrahowanych z panelu E.GProfile linii intensywności fluorescencji zmierzono w poprzek pierścienia ANXA5-GFP z panelu D, gdzie każdy przedział czasowy 1-6 oznaczono jako przekrój 1-6. Na koniec (H) ewolucja czasowa promieni pierścieni ANXA5-GFP jest przedstawiona jako funkcja czasu obliczona na podstawie danych z panelu G. Rysunek ten został powielony z pracy Moreno-Pescador et al.16 za zgodą Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
W porównaniu do struktur pierścieniowatych powstających po samym uszkodzeniu błony komórkowej (Supplementary Figure 1), urazy w bliskim sąsiedztwie jądra (Supplementary Figure 2A) mogą wpływać na ewolucję i geometrię rany. Sporadycznie widoczna była tylko część pierścieni ANXA (Supplementary Figure 2B,C), co można analizować za pomocą wewnętrznego procesu analizy w programie MATLAB (patrz sekcja 5), choć może to prowadzić do utraty dodatkowych danych. Zazwyczaj formacje pierścieni ANXA obserwowane w komórkach nieprzywierających (Supplementary Figure 2C) znajdują się blisko jądra oraz peryferii komórki. W konsekwencji można zaobserwować bardziej wydłużoną strukturę pierścienia, co jest nieoptymalne dla prezentowanej analizy danych. Dodatkowo komórki nieprzywierające wydawały się bardziej podatne na śmierć komórkową po uszkodzeniu błony komórkowej. Ponadto, rozważając urazy wynikające z napromieniowania agregatów AuNP, należy zauważyć, że mogą być one poważniejsze i trudniejsze do kontrolowania. Wynika to ze znacznego wzrostu nagrzewania plazmonicznego, które może uszkodzić dużą część komórki. W rezultacie takie urazy nie zostały włączone do analizy pierścieni ANXA5.
Ponadto wstępne wyniki wskazują, że przerwanie błony plazmatycznej przy użyciu termoplazmoniki prowadzi do podwyższenia wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+. Zaobserwowano to nawet przy niskim natężeniu naświetlania pojedynczych AuNP, co sugeruje permeabilizację błony plazmatycznej35, jak pokazano na Rysunku 4. Napływ Ca2+ zaobserwowano w komórkach wykazujących ekspresję związanej z błoną sondy wapniowej GCaMP6s-CAAX, która ulega zmianie konformacyjnej po napływie Ca2+, co pozwala na zaobserwowanie wzrostu jej intensywności64. Intensywność wapnia była ilościowo określana dla całego obszaru komórki w czasie. Aby wyeliminować szum tła, poziom Ca2+ w tle odliczono przed przerwaniem błony oraz po jej naprawie. Maksymalną intensywność określono poprzez normalizację średniej intensywności Ca2+ wewnątrz komórki, co doprowadziło do uzyskania krzywej intensywności wykazującej gwałtowny początkowy wzrost intensywności Ca2+, a następnie wolniejszy spadek, jak przedstawiono na Rysunku 4B.
Komórka osiągnęła maksymalną intensywność wapnia w czasie ~ 6,6 s, co jest zgodne z ustaleniami Klenow i wsp.64, którzy zasugerowali, że czas wystąpienia szczytu intensywności wapnia (t = tc) odpowiada czasowi wymaganemu do zamknięcia rany. Niemniej jednak, choć wymagane są dalsze badania w celu ustalenia mechanizmu naprawy błony i gojenia ran, wstępne wyniki wykazały, że ten proces Ca2+ obserwowano wyłącznie w komórce uszkodzonej, a nie w nieuszkodzonej komórce wykorzystanej jako kontrola pozytywna. Potwierdza to, że w komórce wystąpił napływ Ca2+ po termoplazmonicznej destabilizacji błony, przy czym nadmiar wapnia wewnątrzkomórkowego jest aktywnie wypompowywany po pomyślnej PMR, ponieważ poziom wapnia wewnątrzkomórkowego nie konkuruje już z napływem Ca2+, co w konsekwencji prowadzi do przywrócenia homeostazy komórkowej64.
<img alt="Analiza odpowiedzi komórkowej; zmiana intensywności w czasie; obrazy mikroskopii fluorescencyjnej i wyniki graficzne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Napływ wapnia podczas przerwania błony plazmatycznej komórki HEK293T za pomocą termoplazmoniki. Seria obrazów konfokalnych przedstawia dwie komórki (komórkę badaną oraz nieuszkodzoną komórkę użytą jako kontrolę pozytywną) wykazujące ekspresję związanej z błoną sondy wapniowej GCaMP6s-CAAX. Pasek skali wynosi 10 μm. (A) Przed naświetlaniem, w czasie 00:00 s, obrys dwóch komórek jest zaznaczony szarym punktowym linią, a miejsce naświetlania jest oznaczone żółtym okręgiem. Po naświetlaniu laserem obserwuje się gwałtowny napływ Ca2+, który osiąga maksymalną intensywność w ok. 6,6 s, co zaznaczono pomarańczową przerywaną linią; przyjmuje się, że punkt ten odpowiada czasowi zamknięcia rany64. (B) Profil intensywności wapnia uzyskany z sondy GCaMP6s-CAAX w komórce uszkodzonej (linia niebieska) porównano z intensywnością Ca2+ w sąsiedniej nieuszkodzonej komórce (szara punktowa linia), co wykazało wyraźny napływ Ca2+ wyłącznie po przerwie błony plazmatycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

Nasze badania koncentrują się na badaniu mechanizmów naprawy błony komórkowej zarówno w żywych komórkach, jak i w układach biomimetycznych zwanych gigantycznymi pęcherzykami jednowarstwowymi. Jesteśmy szczególnie zainteresowani zrozumieniem roli białek, takich jak aneksyny, w ułatwianiu naprawy powierzchni. Te skomplikowane procesy są badane przy użyciu naszej innowacyjnej techniki nakłuwania termoplazmonicznego.Obecnie naprawa komórek jest badana przy użyciu laserów impulsowych w połączeniu z biologią molekularną w celu identyfikacji białek, które są rekrutowane do miejsca urazu. Wadą tego podejścia jest to, że trudno jest kontrolować zakres uszkodzeń spowodowanych użyciem laserów impulsowych. Obecnie nasze eksperymenty wiążą się z kilkoma wyzwaniami.Pracujemy nad dostrojeniem ustawienia ostrości naszego lasera za pomocą nanocząsteczki, co ma kluczowe znaczenie dla precyzji. I chociaż może to być nieco trudne, aktywnie pracujemy również nad zminimalizowaniem tworzenia się nanopęcherzyków podczas procesu ogrzewania. Nasze badania wykazały, że białka aneksyny szybko reagują na napływ wapnia, odgrywając kluczową rolę w naprawie błony i ujawniając zróżnicowane zachowania poszczególnych anektyn.Aby lepiej zrozumieć związane z tym mechanizmy, zwracamy się do systemów biomimetycznych, które pozwalają nam precyzyjnie zmierzyć, w jaki sposób aneksyny wpływają na zginanie błony w pobliżu otworu błonowego. Nasz protokół wychodzi naprzeciw potrzebie precyzyjnego zlokalizowania błony uszkodzonej w zdrowych komórkach. Dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów naprawy błon komórkowych w żywych organizmach.Ponadto umożliwia badanie biofizycznej roli białek błonowych rekrutowanych do regionu anura w pobliżu główek porów w błonach biometrycznych. Na początek pokryj naczynie z mikrostudzienką 150 mikrolitrami 0,01% do 0,1% roztworu do mocowania komórek przed inkubacją. Po wysuszeniu naczynia na powietrzu dodaj kroplami 80 mikrolitrów roztworu nanocząstek złota na suchą powierzchnię.Następnego dnia usuń dodane podłoże hodowlane z mikrostudzienki. Następnie dodaj dwa mililitry transfekowanych komórek na wierzch unieruchomionych nanocząstek złota na powierzchni szkła. Inkubować płytkę przed rozpoczęciem eksperymentów.Użyj mikroskopu konfokalnego z laserem argonowym ustawionym na 488 nanometrów, aby zobaczyć fluorescencję GFP z białka aneksyny. Ustaw laser helowo-neonowy na 633 nanometry, aby obserwować odbicie nanocząstek złota. Wybierz pojedyncze komórki zamiast klastrów komórek, aby zapobiec nakładaniu się błon plazmatycznych.Upewnij się, że unieruchomione nanocząstki złota są obecne jako pojedyncze cząstki i odpowiednio rozmieszczone, aby zapobiec zwiększonemu gradientowi termicznemu. Użyj pęsety optycznej, aby napromieniować nanocząstkę złota przez jedną sekundę, aby przerwać błonę plazmatyczną. Aby wygenerować gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe lub GUV, nałóż 90 mikrolitrów podgrzanego 5% żelu PVA na szkiełko podstawowe.Rozprowadź żel równomiernie na szkiełku. Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia w komorze grzewczej w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 50 minut. Następnie za pomocą szklanej strzykawki nałóż 30 mikrolitrów mieszaniny lipidów.Za pomocą krawędzi igły rozprowadź mieszaninę w cienkiej warstwie. Zastosuj delikatny przepływ azotu gazowego w celu odparowania chloroformu z mieszaniny lipidów. Następnie suszyć szkiełka w próżni przez 1,5 do dwóch godzin.W osobnej dwumililitrowej probówce dodaj 400 mikrolitrów buforu do uprawy. Następnie dodać rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania do końcowego stężenia 500 nanomolowych. Odpipetować 400 mikrolitrów rozcieńczonego białka do zmontowanej komory wewnętrznej i owinąć komorę parafilmem.Po godzinnej inkubacji przenieś 400 mikrolitrów zawartości komory do dwumililitrowej probówki. Dodaj jeden mililitr buforu obserwacyjnego do zebranego roztworu, aby usunąć wszelkie niekapsułkowane białka. Następnie odwirować roztwór o sile 600 G przez 10 minut w temperaturze 13 stopni Celsjusza.Następnie zastąp jeden mililitr supernatantu buforem obserwacyjnym i delikatnie odpipetować, aby rozproszyć GUV. Wstaw do lodówki do rozpoczęcia eksperymentów. Aby nakłuć GUV, najpierw pokryj powierzchnię naczynia z 35-milimetrowym szklanym dnem beta-kazeiną.Następnie dodaj pięć mikrolitrów 150-nanometrowych złotych nano powłok do mieszaniny GUV zawierającej chlorek wapnia. Przenieś mieszaninę do komory i zamontuj ją na stoliku mikroskopu. Użyj pęsety optycznej, aby uwięzić pojedynczą złotą nanopowłokę na powierzchni GUV.Gdy uwięziona powłoka nano jest w bliskim kontakcie z membraną GUV, zwiększ moc lasera, aby przebić miejsce docelowe. Napromienianie nanocząstkami spowodowało uszkodzenie błony i spowodowało szybką rekrutację aneksin do miejsca urazu, po napływie wapnia w celu utworzenia struktury przypominającej pierścień. W eksperymentach GUV nakłucia membrany były szybko ponownie uszczelniane przy braku aneksin.Unikalne właściwości biofizyczne białka aneksyny A4 doprowadziły do pęknięcia GUV ze względu na jego zdolność do zwijania błon. Obecność aneksyny w GUV powodowała szybką akumulację w miejscu urazu po nakłuciu błony. Analiza pierścieni aneksyny A5 w eksperymentach komórkowych wykazała, że pozostały one stałe w czasie i przestrzeni.Rozerwanie błony plazmatycznej za pomocą termoplazmoniki spowodowało podwyższony poziom jonów wapnia. Komórki osiągnęły maksymalne natężenie wapnia po 6,6 sekundy, czyli w momencie, który przypuszcza się, że odpowiada czasowi zamknięcia rany.

a-thermoplasmonic-approach-for-investigating-plasma-membrane-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Poznaj termoplazmoniczne nakłucie błon do badania naprawy błon komórkowych z udziałem białek aneksyńskich w żywych komórkach i wesykulach GUV. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować uszkodzenie i obserwować rekrutację białek.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Przeglądaj więcej filmów