Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zakres naszych badań polega na oczyszczeniu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą sortera komórek bez modyfikacji genetycznej. Naszym celem jest zajęcie się kwestią ryzyka rakotwórczego związanego z resztkowymi komórkami niezróżnicowanymi wśród tych różnicowanych z ludzkich komórek IP. Jednym z obecnych wyzwań eksperymentalnych jest niska żywotność komórek spowodowana naprężeniami mechanicznymi związanymi z sortowaniem.

Opracowujemy nową metodę oczyszczania, która wykorzystuje unikalne cechy metaboliczne hepatocytów do oczyszczania na dużą skalę. Jedna niezależna od komórek metoda sortowania komórek progenitorowych wątroby nie pozwala uzyskać czystych hepatocytów. Inny dla dojrzałych hepatocytów może leczyć tylko niewielką część hepatocytów ze względu na ograniczoną ekspresję białka markerowego.

W przeciwieństwie do tego, nasze podejście pozwala uzyskać hepatocyty na różnych poziomach dojrzewania z wyższym E. Hepatocyty pochodzące z ludzkich komórek iP są wyjątkowo niedojrzałe i wykazują bardziej zmniejszoną ekspresję makro hepatocytów po oczyszczeniu. Naszym przyszłym celem jest zwiększenie modulacji hepatocytów przy użyciu technologii organoidów i wykorzystanie tych postępów do rozwoju medycyny regeneracyjnej i odkrywania leków. Na początek pokryj każdą studzienkę sześciodołkowej płytki jednym mililitrem macierzy błony podstawnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Usunąć powlekaną matrycę z płytki i dodać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przygotowane w pożywce AK02N uzupełnione 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Po trzech dniach od rozpoczęcia różnicowania wątroby należy przemyć komórki raz pożywką RPMI 1640.

Następnie, aby zainicjować różnicowanie endodermy, dodaj do płytki RPMI B-27 GlutaMAX uzupełniony o trzy do sześciu mikromolowych CHIR-99021 i 100 nanogramów na mililitr aktywiny-A. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Pierwszego dnia zastąp istniejącą pożywkę RPMI B-27 GlutaMAX uzupełnioną o 50 nanogramów na mililitr aktywiny-A.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. W drugim dniu, w celu wywołania różnicowania progenitorów wątroby, zastąp istniejącą pożywkę pożywką RPMI B-27 GlutaMAX uzupełnioną 1% dimetylosulfotlenkiem i kontynuuj inkubację przez okres do pięciu dni. Siódmego dnia, aby rozpocząć dojrzewanie hepatocytów, zmień na pożywkę do dojrzewania hepatocytów i inkubuj przez 20 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W 27 dniu indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste wykazywały wielokątne kształty komórek i zaokrąglone jądra, co jest cechą charakterystyczną hepatocytów. Po 27 dniach od rozpoczęcia różnicowania wątrobowego indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, przemyj komórki dwoma mililitrami PBS na studzienkę. Przygotować roztwór enzymatyczny w buforze ADS, używając podanych składników.

Dodaj jeden mililitr roztworu na dołek płytki sześciodołkowej. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na obracającej się wytrząsarce na około dwie godziny, aby oderwać komórki od płytki. Potwierdź odłączenie komórki pod mikroskopem.

Następnie odpipetuj zawiesinę komórek, aby rozproszyć się na pojedyncze komórki i zebrać je w 50-mililitrowej probówce zawierającej pożywkę do dojrzewania hepatocytów. Odwirować zawiesinę komórkową o temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. I za pomocą aspiratora usuń supernatant.

Aby wybarwić mitochondria komórek, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 100 nanomolowych TMRM. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad w jednym do pięciu mililitrów zimnego buforu ADS zawierającego 2% FBS.

Po zliczeniu komórek przenieś 500 000 komórek do 1,5-mililitrowej probówki i oznacz ją jako kontrolę bez przeciwciał pierwotnych. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o masie 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na milion komórek.

Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki i inkubuj na lodzie przez 50 minut. Po inkubacji odwirować zawiesinę komórek i dwukrotnie przemyć komórki zimnym buforem ADS zawierającym 2% FBS. Teraz dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na milion komórek do pierwszorzędowych komórek barwionych lub niebarwionych przeciwciałami i inkubuj przez 30 minut na lodzie.

Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i dwukrotnie przemyć komórki zimnym buforem ADS zawierającym 2% FBS. Po ponownym zawieszeniu komórek w buforze ADS przefiltruj je przez sitko do komórek typu snap-cap i umieść probówkę na lodzie. Aby rozpocząć, skonfiguruj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub maszynę FACS do sortowania komórek zgodnie z instrukcjami producenta.

Umieść probówkę z próbką na maszynie FACS i załaduj ją. Bramka populacji o wysokim TMRM i ALCAM-ujemnej w regionie P1 w celu sortowania niehepatocytów. Następnie przeprowadź bramkę populacji o wysokiej TMRM i LCAM-dodatniej w regionie P2, aby posortować hepatocyty.

Zbierz posortowane komórki w 15-mililitrowych probówkach zbiorczych zawierających pożywkę do dojrzewania hepatocytów. Po posortowaniu wyjmij probówkę zbiorczą z maszyny FACS. Odwirować posortowaną zawiesinę komórkową o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki do dojrzewania hepatocytów z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK i 20 nanomolową cyklosporyną A. Zasiać komórki na mysich fibroblastach embrionalnych traktowanych mitomycyną C z pożywką do dojrzewania hepatocytów na sześciodołkowej płytce. Hoduj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni przed barwieniem immunologicznym w celu przeprowadzenia testu czystości hepatocytów. Analiza FACS przeprowadzona w 27 dniu różnicowania wątroby wykazała populację z wysokim TMRM i ALCAM-dodatnim.

Pokazano barwienie immunohistochemiczne komórek P1 i P2 hodowanych na mysich fibroblastach embrionalnych po sortowaniu. Test czystości polegający na zliczaniu komórek z albuminą dodatnią wykazał 0% P1, a około 97% komórek P2 było komórkami podobnymi do hepatocytów.