Name: Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS przy użyciu sortowania komórek z barwieniem mitochondriów. Technika ta pozwala uzyskać czyste populacje komórek wątrobowych z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii numer [23390072].

W tym badaniu użyto komercyjnie uzyskanych ludzkich komórek iPS (szczep 253G1) (zobacz Tabelę materiałów).
1. Utrzymanie ludzkich komórek iPS
<ol>
	<li>Utrzymuj ludzkie komórki iPS w warunkach wolnych od karmienia w pożywce AK02 na szalkach hodowlanych pokrytych 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Wątrobowe różnicowanie ludzkich komórek iPS w hodowlach 2D
UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1A dla dziennego harmonogramu różnicowania wątroby. W trakcie całego procesu należy używać 6-dołkowych płytek hodowlanych i dodawać 2 ml wyznaczonego roztworu do płukania lub pożywki do każdej studzienki. Utrzymuj stan hodowli komórkowej przy 100% wilgotności, 5% CO2 i 20% O2 w temperaturze 37 °C.
<ol>
	<li>Pokryć każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml macierzystej matrycy błony podstawnej (rozcieńczonej w stosunku 1:25 w PBS (-)) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przejście ludzkich komórek iPS na powlekane naczynie o gęstości 20 000-30 000 komórek/cm² przy użyciu pożywki AK02N uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632) (patrz tabela materiałów). Wymień pożywkę bez Y-27632 następnego dnia i hoduj przez dodatkowe 2 dni.</li>
	<li>Umyj ogniwa raz za pomocą pożywki RPMI-1640. Zainicjuj różnicowanie endodermy, zastępując pożywkę RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 Insulina + 1% Dipeptyd L-Alanylo-L-Glutamina) uzupełnioną 3-6 μM CHIR-99021 i 100 ng/ml Activiny A przez 24 godziny (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Zastąp pożywkę RPMI-B27-Glu uzupełnioną 50 ng/ml Activiny A na 24 godziny.</li>
	<li>Aby wywołać różnicowanie progenitorów wątroby, należy zastąpić pożywkę RPMI-B27-Glu uzupełnionym 1% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) przez 5 dni.</li>
	<li>Aby przyspieszyć dojrzewanie hepatocytów, przełącz się na pożywkę do dojrzewania hepatocytów: pożywkę L-15 firmy Leibovitz zawierającą 10 μM hydrokortyzonu 21-hemibursztynian, 8,3% bulionu z fosforanu tryptozy, 100 nM deksametazonu (DEX), 50 μg/ml L-askorbinianu sodu, 0,58% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 8,3% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy i 100 nM N-heksanoicznego-try-Ile-(6)-amino-sześcioheksanowego amidu (Dihexa) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 2 dni przez 20 dni. Sortuj komórki około 27 dni po zainicjowaniu różnicowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS
<ol>
	<li>Przemyć zróżnicowane komórki wątroby 2 ml PBS (-) na studzienkę.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu enzymatycznego na studzienkę, który zawiera 0,1% kolagenazy, 0,083% trypsyny, 10 μM inhibitora ROCK (Y-27632), 20 nM cyklosporyny A i 50 μg/ml L-askorbinianu sodu w buforze Ads (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM glukozy i 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) (patrz tabela materiałów). Oderwij komórki od płytek, obracając je poziomo w temperaturze 37 °C przez około 2 godziny.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że komórki są odłączone i zaokrąglone pod mikroskopem, rozproszyj je na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego pipetowania i zbierz je do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C w celu ich granulowania. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Wybarwić mitochondria komórek, rozpraszając je w 5 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 100 nM TMRM (tetrametylodamina, ester metylowy) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem, zawijając w folię aluminiową.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C w celu ich osadzenia. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki za pomocą 1-5 ml zimnego buforu reklamowego zawierającego 2% FBS.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą 0,4% roztworu błękitu trypanowego i płytki do liczenia komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu ich osadzenia. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-ALCAM (przeciwciało pierwszorzędowe, patrz tabela materiałów) w stosunku 1:50 w buforze Ads i dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała na 106 komórek. Plamić komórki przez 50 minut na lodzie. Przygotuj komórki, które nie są barwione pierwszorzędowym przeciwciałem jako kontrolę negatywną.</li>
	<li>Umyj komórki zimnym buforem reklamowym zawierającym dwukrotnie 2% FBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć IgG (przeciwciało drugorzędowe) osła Alexa Fluor 488 (przeciwciało drugorzędowe, patrz tabela materiałów) w stosunku 1:100 w buforze Ads i dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała na 10-6 komórek. Barwić komórki przez 30 minut na lodzie. Wybarwić komórki, które nie zostały wybarwione przeciwciałem pierwszorzędowym, przy użyciu przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Umyj komórki zimnym buforem reklamowym zawierającym dwukrotnie 2% FBS.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w buforze Ads i przefiltruj je przez sitko zatrzaskowe (siatka 35 μm) tuż przed sortowaniem przez FACS, aby usunąć duże grudki komórek i zanieczyszczenia.</li>
</ol>
4. Analizy FACS i sortowanie hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS
<ol>
	<li>Ustaw maszynę FACS do sortowania komórek zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Użyj dyszy o rozmiarze 85 μm lub 100 μm i filtra ND 2.0 dla hepatocytów. Użyj kanału FITC do wykrywania mąki Alexa 488 dla ALCAM oraz kanału PE do wykrywania fluorescencji TMRM dla mitochondriów.</li>
	<li>Dostosuj napięcia FSC (rozproszenie do przodu) i SSC (rozproszenie boczne), aby prawidłowo zobrazować populację komórek.</li>
	<li>Dostosuj napięcie kanałów fluorescencyjnych FITC i PE. Zacznij od nieoznaczonych komórek i wyśrodkuj populację komórek u dołu każdego wykresu kanału. Upewnij się, że oznaczone komórki są odpowiednio rozmieszczone na wykresie.</li>
	<li>Użyj wspólnej strategii bramkowania, aby wyeliminować dublety: Bramka główna FSC-A vs. Populacja SSC-A (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), a następnie FSC-H vs. -W, a następnie SSC-H vs. -W (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C).</li>
	<li>Bramka TMRMhi i ALCAM+ populacja (P2 w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E) w celu sortowania hepatocytów. Bramka populacjiTMRM hi i ALCAM- (P1 w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E) w celu sortowania niehepatocytów. Zebrać posortowane hepatocyty i niehepatocyty do 15 ml probówek zbiorczych zawierających pożywkę do dojrzewania hepatocytów.</li>
	<li>Odwirować probówkę zbiorczą zawierającą posortowane komórki o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do dojrzewania hepatocytów.</li>
	<li>Wysiewać komórki na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) traktowanych mitomycyną C lub żelowej macierzy błony podstawnej z pożywką do dojrzewania hepatocytów uzupełnioną 10 μM Y-27632 i 20 nM cyklosporyną A. Hodować komórki w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez 5 dni.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia do wykrywania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS
<ol>
	<li>Hodowane komórki należy myć przez 5 dni po sortowaniu za pomocą PBS (-).</li>
	<li>Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki buforem TBS-T (1x TBS z 1% Tween 20) dwukrotnie, aby usunąć paraformaldehyd.</li>
	<li>Inkubować komórki z 0,1% rozcieńczonym buforem TBS-T Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć ogniwa buforem TBS-T, aby usunąć Triton X-100.</li>
	<li>Dodaj dostępny w handlu roztwór blokujący (patrz tabela materiałów) do komórek na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko albuminie (marker hepatocytów) i ludzkiemu antygenowi jądrowemu (hNA, patrz tabela materiałów), rozcieńczone w stosunku 1:50 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc. Dwukrotnie przemyć ogniwa buforem TBS-T.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała drugorzędowe: Alexa Fluor 488 anty-królicze IgG i Alexa Fluor 546 osło anty-mysie IgG, rozcieńczone w stosunku 1:100 w roztworze blokującym (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dwukrotnie przemyć komórki buforem TBS-T.</li>
	<li>Oceń czystość hepatocytów, zliczając komórki albuminowo-dodatnie i hNA-dodatnie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obliczyć procent komórek albuminowo-dodatnich na komórkę hNA-dodatnią zarówno dla populacji P1, jak i P2.</li>
</ol>

Purification of Human iPSC-Derived Hepatocytes by Mitochondrial-ALCAM Sorting

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na swoje funkcje w metabolizmie składników odżywczych i detoksykacji, hepatocyty posiadają stosunkowo dużą liczbę mitochondriów w porównaniu z innymi typami komórek15. ALCAM należy do nadrodziny immunoglobulin i odgrywa rolę w adhezji i migracji komórek. Ulega ekspresji w różnych typach komórek, w tym w komórkach wątrobowych, nabłonkowych, limfocytarnych, szpikowych, fibroblastach i komórkach neuronalnych16. Wykorzystując połączenie metody opartej na mitochondria...

Embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (odpowiednio ES i iPS) są uważane za obiecujące źródła komórek do terapii regeneracyjnych. Jednak skuteczność różnicowania tych komórek w określone typy komórek docelowych może się różnić, nawet przy użyciu tej samej linii komórkowej, protokołu i eksperymentatora1,2,3,4. Zmienność tę można przypisać wysokiej wrażliwości ludzkich komórek ES/iPS na środowisko. W związku z tym obecnie trudno jest konsekwentnie uzyskiwać czyste komórki docelowe. Aby osiągnąć wysoce bezpieczną medycynę regeneracyjną, kluczowe jest wyeliminowanie komórek proliferacyjnych i niezróżnicowanych komórek macierzystych w komórkach terapeutycznych, a zaawansowana technologia oczyszczania komórek docelowych jest niezbędna5,6,7.
Sorter komórek to urządzenie, które natychmiast analizuje pojedyncze komórki i sortuje żywe komórki na podstawie siły sygnału fluorescencyjnego, oferując obiecujące rozwiązanie. Można to osiągnąć poprzez barwienie przeciwciałami markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki lub poprzez wykorzystanie ekspresji genów reporterowych specyficznych dla typu komórki. Korzystając z tej techniki, istnieje kilka doniesień na temat metod oczyszczania pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych8,9,10 i hepatocytes11,12. Hattori i wsp. opracowali innowacyjną metodę oczyszczania mitochondriów przy użyciu sortera komórek13. Wykorzystując fakt, że kardiomiocyty mają wysokie zapotrzebowanie na energię poprzez aktywność mitochondriów, barwienie komórek żywym barwnikiem wskazującym na mitochondria TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy) może być używane do znakowania i wysoce oczyszczania kardiomiocytów za pomocą FACS z ludzkich ciał embrionalnych pochodzących z komórek ES zawierających różne typy komórek. Brak rakotwórczości potwierdzono w testach tworzenia potworniaków z oczyszczonymi kardiomiocytami. Co więcej, Yamashita i wsp. nieoczekiwanie odkryli metodę oczyszczania hepatocytów z ludzkich embrionów pochodzących z komórek ES poprzez izolowanie frakcji o wysokiej aktywności mitochondrialnej i ekspresji ALCAM-dodatniej14. Uzasadnieniem dla tej metody jest to, że hepatocyty mają również stosunkowo dużą liczbę mitochondriów ze względu na wysokie zużycie ATP do metabolizmu składników odżywczych i detoksykacji15, a hepatocyty wyrażają ALCAM, członka nadrodziny immunoglobulin, która odgrywa rolę w adhezji i migracji komórek16.
Poprzednie wysoce oczyszczające hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych wymagały modyfikacji genetycznych, a metody oczyszczania niegenetycznego miały niską skuteczność17. Niegenetyczna metoda mitochondrialna ma zalety w osiąganiu wysokiej czystości. Gdy potrzebne są komórki progenitorowe wątroby, można wybrać metody oparte na CD133 i CD13 lub Dlk118,19. Chociaż dokładność technologii edycji genomu uległa postępowi, nie można całkowicie wyeliminować potencjalnego ryzyka nieprzewidzianych zmian genomowych (np. kancerogenezy). Metody oparte na aktywności mitochondrialnej, bez ingerencji w modyfikację genetyczną, mogą być wolne od takich zagrożeń.
W wyniku badania różnych wskaźników mitochondrialnych w kardiomiocytach noworodków szczurów, zaobserwowano, że TMRM znika całkowicie w ciągu 24 godzin, podczas gdy inne barwniki pozostają przez co najmniej 5 dni13. Ponadto należy zauważyć, że TMRM i JC-1 nie wpłynęły na żywotność komórek, gdy oceniano je za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylo-tiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT), podczas gdy inne barwniki wykazywały różny wpływ na żywotność komórek13. TMRM wykazuje większe bezpieczeństwo.
Do tej pory opracowano kilka metod dwuwymiarowego (2D) różnicowania jako bardziej efektywne podejścia do wywoływania różnicowania w porównaniu do trójwymiarowego (3D) tworzenia ciał zarodkowych. Dzieje się tak, ponieważ stopniowe związki lub cytokiny indukujące różnicowanie mogą być równomiernie podawane komórkom na płaszczyźnie 2D, a nie w przestrzeni 3D. W tym badaniu wcześniej opisana metoda20 została zmodyfikowana w celu wywołania różnicowania w ludzkie hepatocyty pochodzące z komórek iPS. W tym miejscu opisano szczegóły procedur aktualnego różnicowania 2D i oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS.

<table><tbody><tr><td>253G1 ludzka linia komórkowa iPS</td><td>Centrum Badawcze RIKEN BioResource HPS0002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aktywiny A, ludzki, rekombinowany</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyjądrowe, klon 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sortownik komórek</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Żelowa matryca membrany podstawnej</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023</td><td>Inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-kozie IgG (H+L) z adsorbcją, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko myszy, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórek Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica</td> <td>bydlęcaBiowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Dipeptyd L-alanylo-L-glutamina</td></tr><tr><td>Człowiek/Mysz/Szczur/Pies ALCAM/CD166 Przeciwciało</td><td>R& D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon 21-hemibursztynian sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 jedwab</td><td>Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td><td>CTKN001</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Suplement ITS-G(&razy; 100)</td> <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-heksanonowy-try-ile-(6)-amino-sześciokątny amid (Dihexa)</td> <td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalna albumina antyludzka królika</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polioksyetylenosorbitan Monolaurate (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylodamina, ester metylowy (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSYNA 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bulionu z fosforanu tryptozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ES) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) mają potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej opartej na komórkach do leczenia poważnie chorych narządów ze względu na ich nieograniczoną proliferację i właściwości pluripotencjalne. Jednak różnicowanie ludzkich komórek ES/iPS w 100% czyste typy komórek docelowych jest wyzwaniem ze względu na ich wysoką wrażliwość na środowisko. Nowotworzenie po przeszczepie jest spowodowane przez zanieczyszczone, proliferujące i niezróżnicowane komórki, co sprawia, że technologia wysokiego stopnia oczyszczania jest niezbędna do bezpiecznej realizacji medycyny regeneracyjnej. Aby zmniejszyć ryzyko nowotworzenia, opracowano technologię zaawansowanego oczyszczania ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek iPS. Metoda wykorzystuje FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją) przy użyciu kombinacji wysokiej zawartości mitochondriów i markera powierzchni komórki ALCAM (aktywowana cząsteczka adhezyjna komórek leukocytów) bez modyfikacji genetycznej. 97% ± 0,38% (n = 5) oczyszczonych hepatocytów tą metodą wykazywało ekspresję białka albuminowego. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowych procedur dla tej metody, zastosowanej do najnowszej metody dwuwymiarowego różnicowania ludzkich komórek iPS do hepatocytów.

Przedstawiono oś czasu procesów indukujących różnicowanie ludzkich komórek iPS w hepatocyty w hodowli 2D (Rycina 1A) oraz reprezentatywne cechy komórek (Rycina 1B>). Około 12. dnia różnicowania komórki zaczęły wykazywać wieloboczny kształt i okrągłe jądra, co jest charakterystyczne dla hepatocytów. Niektóre hepatocyty wykazywały również wielojądrowość.
Analizę FACS przeprowadzono na komórkach w 27. dniu różnicowania. Aby zidentyfikowa...

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

Zakres naszych badań polega na oczyszczeniu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą sortera komórek bez modyfikacji genetycznej. Naszym celem jest zajęcie się kwestią ryzyka rakotwórczego związanego z resztkowymi komórkami niezróżnicowanymi wśród tych różnicowanych z ludzkich komórek IP. Jednym z obecnych wyzwań eksperymentalnych jest niska żywotność komórek spowodowana naprężeniami mechanicznymi związanymi z sortowaniem.Opracowujemy nową metodę oczyszczania, która wykorzystuje unikalne cechy metaboliczne hepatocytów do oczyszczania na dużą skalę. Jedna niezależna od komórek metoda sortowania komórek progenitorowych wątroby nie pozwala uzyskać czystych hepatocytów. Inny dla dojrzałych hepatocytów może leczyć tylko niewielką część hepatocytów ze względu na ograniczoną ekspresję białka markerowego.W przeciwieństwie do tego, nasze podejście pozwala uzyskać hepatocyty na różnych poziomach dojrzewania z wyższym E. Hepatocyty pochodzące z ludzkich komórek iP są wyjątkowo niedojrzałe i wykazują bardziej zmniejszoną ekspresję makro hepatocytów po oczyszczeniu. Naszym przyszłym celem jest zwiększenie modulacji hepatocytów przy użyciu technologii organoidów i wykorzystanie tych postępów do rozwoju medycyny regeneracyjnej i odkrywania leków. Na początek pokryj każdą studzienkę sześciodołkowej płytki jednym mililitrem macierzy błony podstawnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Usunąć powlekaną matrycę z płytki i dodać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przygotowane w pożywce AK02N uzupełnione 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Po trzech dniach od rozpoczęcia różnicowania wątroby należy przemyć komórki raz pożywką RPMI 1640.Następnie, aby zainicjować różnicowanie endodermy, dodaj do płytki RPMI B-27 GlutaMAX uzupełniony o trzy do sześciu mikromolowych CHIR-99021 i 100 nanogramów na mililitr aktywiny-A. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Pierwszego dnia zastąp istniejącą pożywkę RPMI B-27 GlutaMAX uzupełnioną o 50 nanogramów na mililitr aktywiny-A.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. W drugim dniu, w celu wywołania różnicowania progenitorów wątroby, zastąp istniejącą pożywkę pożywką RPMI B-27 GlutaMAX uzupełnioną 1% dimetylosulfotlenkiem i kontynuuj inkubację przez okres do pięciu dni. Siódmego dnia, aby rozpocząć dojrzewanie hepatocytów, zmień na pożywkę do dojrzewania hepatocytów i inkubuj przez 20 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W 27 dniu indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste wykazywały wielokątne kształty komórek i zaokrąglone jądra, co jest cechą charakterystyczną hepatocytów. Po 27 dniach od rozpoczęcia różnicowania wątrobowego indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, przemyj komórki dwoma mililitrami PBS na studzienkę. Przygotować roztwór enzymatyczny w buforze ADS, używając podanych składników.Dodaj jeden mililitr roztworu na dołek płytki sześciodołkowej. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na obracającej się wytrząsarce na około dwie godziny, aby oderwać komórki od płytki. Potwierdź odłączenie komórki pod mikroskopem.Następnie odpipetuj zawiesinę komórek, aby rozproszyć się na pojedyncze komórki i zebrać je w 50-mililitrowej probówce zawierającej pożywkę do dojrzewania hepatocytów. Odwirować zawiesinę komórkową o temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. I za pomocą aspiratora usuń supernatant.Aby wybarwić mitochondria komórek, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 100 nanomolowych TMRM. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad w jednym do pięciu mililitrów zimnego buforu ADS zawierającego 2% FBS.Po zliczeniu komórek przenieś 500 000 komórek do 1,5-mililitrowej probówki i oznacz ją jako kontrolę bez przeciwciał pierwotnych. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o masie 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na milion komórek.Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej probówki i inkubuj na lodzie przez 50 minut. Po inkubacji odwirować zawiesinę komórek i dwukrotnie przemyć komórki zimnym buforem ADS zawierającym 2% FBS. Teraz dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na milion komórek do pierwszorzędowych komórek barwionych lub niebarwionych przeciwciałami i inkubuj przez 30 minut na lodzie.Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i dwukrotnie przemyć komórki zimnym buforem ADS zawierającym 2% FBS. Po ponownym zawieszeniu komórek w buforze ADS przefiltruj je przez sitko do komórek typu snap-cap i umieść probówkę na lodzie. Aby rozpocząć, skonfiguruj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub maszynę FACS do sortowania komórek zgodnie z instrukcjami producenta.Umieść probówkę z próbką na maszynie FACS i załaduj ją. Bramka populacji o wysokim TMRM i ALCAM-ujemnej w regionie P1 w celu sortowania niehepatocytów. Następnie przeprowadź bramkę populacji o wysokiej TMRM i LCAM-dodatniej w regionie P2, aby posortować hepatocyty.Zbierz posortowane komórki w 15-mililitrowych probówkach zbiorczych zawierających pożywkę do dojrzewania hepatocytów. Po posortowaniu wyjmij probówkę zbiorczą z maszyny FACS. Odwirować posortowaną zawiesinę komórkową o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki do dojrzewania hepatocytów z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK i 20 nanomolową cyklosporyną A. Zasiać komórki na mysich fibroblastach embrionalnych traktowanych mitomycyną C z pożywką do dojrzewania hepatocytów na sześciodołkowej płytce. Hoduj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni przed barwieniem immunologicznym w celu przeprowadzenia testu czystości hepatocytów. Analiza FACS przeprowadzona w 27 dniu różnicowania wątroby wykazała populację z wysokim TMRM i ALCAM-dodatnim.Pokazano barwienie immunohistochemiczne komórek P1 i P2 hodowanych na mysich fibroblastach embrionalnych po sortowaniu. Test czystości polegający na zliczaniu komórek z albuminą dodatnią wykazał 0% P1, a około 97% komórek P2 było komórkami podobnymi do hepatocytów.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Poznaj metodę oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS przy użyciu sortowania komórek z barwieniem mitochondriów. Technika ta pozwala uzyskać czyste populacje komórek wątrobowych z wysoką wydajnością.

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów