Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55
13 października 2023
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.
Nasze badania koncentrują się na eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EIE), który może znacznie poszerzyć zrozumienie obwodowego mechanizmu immunologicznego i ocenić procesy neurozapalne i częściowo demielinizacyjne. Model ten jest również szeroko stosowany do opracowywania i testowania szerokiej gamy leków terapeutycznych. Ze względu na nieznaną etiologię i złożoność stwardnienia rozsianego, żaden model zwierzęcy nie podsumowuje obecnie wszystkich cech klinicznych i radiologicznych występujących u ludzi.
W związku z tym wyzwaniem dla naukowców jest wybranie modelu zwierzęcego najbardziej pasującego do konkretnego pytania eksperymentalnego. EAE jest szeroko stosowanym modelem stwardnienia rozsianego. Jednak ze względu na kilka problemów przeprowadza się tylko niektóre badania, a ten model uwzględniał obie płcie.
Dzięki naszemu protokołowi chcemy umożliwić włączenie obu płci do badania prowadzonego w tym modelu. W szczególności nasz protokół zaproponował ocenę kliniczną opartą na dwóch metodach, ocenie wyniku klinicznego i teście rotarod, prowadząc do bardziej ilościowej, mniej subiektywnej i bardziej precyzyjnej oceny klinicznej przebiegu choroby. Mimo że model ten nie odtwarza w pełni dymorfizmu płciowego stwardnienia rozsianego, ma potencjalne zalety.
Połączenie indukcji z innymi możliwymi czynnikami ryzyka, zwłaszcza środowiskowymi, może pomóc w zrozumieniu specyficznych skutków takich czynników i określeniu specyficznej roli w niektórych dymorficznych płciowo aspektach choroby. Na początek przygotuj peptyd glikoproteinowy oligodendrocytów mielinowych w temperaturze od 35 do 55 lub roztwór MOG 35-55 w szklanej zlewce. W tym celu należy dodać płynny składnik do zlewki, a następnie dodać odpowiedni szczep Mycobacterium tuberculosis.
Umieścić szklaną zlewkę zawierającą roztwór w łaźni lodowej. Za pomocą szklanej strzykawki z igłą o rozmiarze 18 należy rozpocząć proces emulgowania i kontynuować emulgowanie roztworu przez co najmniej 15 minut. Aby ocenić jakość emulsji, należy dozować kroplę emulsji do przezroczystego pojemnika wypełnionego wodą.
Uznaj, że emulsja jest gotowa, jeśli kropla zachowuje swoją strukturę i pozostaje nienaruszona. Przenieść emulsję bezpośrednio do jednomililitrowych strzykawek przeznaczonych do celów uodparniających. Napełnione strzykawki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
Rozpocznij immunizację myszy, wykonując dożylne wstrzyknięcie PT do jej bocznej żyły ogonowej. W tym celu delikatnie zatkaj ogon odpowiednio znieczulonej myszy roztworem etanolu, który działa jak środek rozszerzający naczynia krwionośne, uwidaczniając żyły. Skupiając się na jednej z dwóch bocznych żył ogona, użyj strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30, aby wstrzyknąć 500 nanogramów PT. Następnie należy przystąpić do podawania podskórnych iniekcji emulsji MOG 35-55 przygotowanej wcześniej w jednomililitrowych strzykawkach.
Za pomocą strzykawek z igłami o rozmiarze 26 należy wykonać dwa wstrzyknięcia podskórne po 100 mikrolitrów każde pod rostralną częścią boków. Następnie podać jedno wstrzyknięcie 100 mikrolitrów u podstawy ogona. Po wywołaniu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy, poproś zaślepionego badacza o codzienną ocenę wyników klinicznych zwierzęcia.
Oceń każde zwierzę w skali od zera do pięciu, aby ocenić postęp choroby. Aby ocenić sprawność motoryczną, należy codziennie inicjować sesje rotarodowe dla myszy, zaczynając od jednego DPI, aż do momentu, gdy badanie będzie tego wymagać. Każdą sesję przeprowadzaj przez 300 sekund, podczas których zwiększaj liniowo prędkość obrotową pręta od czterech do 40 obrotów na minutę.
Kiedy zwierzę traci równowagę i spada z urządzenia rotarodowego, ląduje na ziemi, uruchamiając czujnik, który rejestruje czas. Rejestruj wydajność zwierzęcia i oceniaj ją jako opóźnienie do upadku. Znaczny wzrost wyniku klinicznego lub CS z czasem zaobserwowano zarówno u samców, jak i samic myszy, począwszy od 10 DPI do punktu końcowego.
Samice wykazywały wyższy CS niż mężczyźni, ale nie znacząco. Tendencję do wcześniejszego początku choroby zaobserwowano również u kobiet w porównaniu z mężczyznami. Co więcej, kobiety wykazywały znacznie wyższy skumulowany CS w porównaniu z mężczyznami.
Znaczny spadek wydajności rotarodu w czasie zaobserwowano zarówno u samców, jak i samic myszy. W szczególności mężczyźni wykazywali minimalną wydajność przy 16 DPI, podczas gdy kobiety przy 17 DPI. Samce osiągały lepsze wyniki niż samice, zwłaszcza w przewlekłej fazie choroby, prawdopodobnie w wyniku niższego CS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE), powszechnie stosowanym mysim modelu stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem mielinowej glikoproteiny oligodendrocytów, co umożliwia badanie procesów neurozapalnych oraz testowanie leków terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Neurozapalenie
Wstęp
- Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako model do zrozumienia stwardnienia rozsianego.
- Model ten pomaga oceniać mechanizmy immunologiczne oraz opcje terapeutyczne.
- Umożliwia on badanie różnic między płciami w obrazie klinicznym choroby.
- Model ten posiada ograniczenia w pełnym odwzorowaniu charakterystyki choroby u ludzi.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu indukcji EAE, który obejmuje obie płcie w badaniach.
- Poprawa dokładności ocen klinicznych poprzez zastosowanie oceny punktowej stanu klinicznego oraz testów na rotarodzie.
- Zbadanie roli środowiskowych czynników ryzyka w progresji choroby.
Zastosowane metody
- Główna platforma obejmuje immunizację myszy C57BL/6J peptydem MOG 35-55.
- W celu oceny różnic między płciami w przebiegu EAE uwzględniono obie płcie myszy.
- Po immunizacji przeprowadzane są codzienne oceny stanu klinicznego oraz testy sprawności na rotarodzie.
- Stopień trudności sesji na rotarodzie jest zwiększany w celu oceny funkcji motorycznych w czasie.
- Badacze pracujący w ślepej próbie oceniają progresję kliniczną w skali od 0 do 5.
Główne wyniki
- U obu płci odnotowano wzrost wyników klinicznych w czasie, przy czym samice osiągały wyższe wartości, choć nie była to różnica istotna statystycznie.
- Samce radziły sobie lepiej niż samice w testach na rotarodzie, szczególnie w chronicznej fazie choroby.
- Dane sugerują, że u samic może dochodzić do wcześniejszego wystąpienia choroby.
- Wyniki podkreślają potencjalne różnice w progresji choroby w zależności od płci.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia metodę analizy EAE z uwzględnieniem obu płci, co pozwala na lepsze zrozumienie stwardnienia rozsianego.
- Wyniki wskazują na istotne różnice związane z płcią w postępie choroby oraz sprawnością ruchową w modelu EAE.
- Praca ta przyczynia się do zrozumienia złożoności związanych z modelami stwardnienia rozsianego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Modelowanie stwardnienia rozsianego (MS) z wykorzystaniem eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) indukowanego MOG35-55 u obu płci pozwala zespołom biofarmaceutycznym na badanie specyficznych dla płci mechanizmów choroby oraz ścieżek neurozapalnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków i pozwala na podejmowanie decyzji skorygowanych o ryzyko w zakresie celowania terapeutycznego w heterogenicznych autoimmunologicznych zaburzeniach OUN. Włączenie modeli męskich i żeńskich zwiększa trafność translacyjną oraz spójność portfolio w procesie poszukiwania leków na MS.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw patogenezy SM u obu płci.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościowe określanie procesów neurozapalnych i demielinizacyjnych.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego dzięki analizie porównawczej progresji choroby w zależności od płci.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze kandydatów w wskazaniach autoimmunologicznych OUN.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do oceny interwencji terapeutycznych skierowanych przeciwko neurostanowi zapalnemu.
- Standaryzuje ocenę kliniczną oraz testy sprawności motorycznej w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Umożliwia ślepą, obiektywną ocenę przebiegu choroby, co wspiera rzetelną ewaluację związków.
- Przygotowuje skalowalną platformę do przesiewowego badania czynników immunomodulujących w modelach istotnych dla stwardnienia rozsianego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do heterogeniczności chorób ludzkich poprzez uwzględnienie płci jako zmiennej biologicznej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej w przypadku stwardnienia rozsianego oraz powiązanych zaburzeń neurozapalnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile skuteczności i bezpieczeństwa specyficzne dla płci.
- Ułatwia opracowywanie biomarkerów translacyjnych dzięki ilościowym punktom końcowym w badaniach behawioralnych i histologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy model EAE wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając walidację celów terapeutycznych, identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne nad lekami w terapii SM.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących ścieżek odpornościowych i neurozapalnych u obu płci.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne odczyty sprawności klinicznej i motorycznej do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników klinicznych oraz pomiarów czasu opóźnienia na rotarodzie do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie cech choroby specyficznych dla płci.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę in vivo dla programów badawczych nad SM i innymi autoimmunologicznymi chorobami OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w SM.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność in vivo modeli neurozapalnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez modelowanie heterogeniczności choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów w obszarze SM i neurozapalenia.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuroimmunologii oraz behawioralnej oceny in vivo.
- Wymaga dostępu do pomieszczeń dla zwierząt, aparatury do testu rotarod oraz protokołów ślepej oceny.
- Konieczna jest standaryzacja testów sprawności klinicznej i motorycznej pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych szczepów myszy lub czynników ryzyka środowiskowego może wpływać na wierność modelu.
- Model nie odtwarza w pełni wszystkich cech ludzkiego stwardnienia rozsianego, co ogranicza bezpośrednią translację kliniczną.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:05
Preparation of MOG35‐55 Emulsion for Immunization of Mouse
3:02
Immunization of Mouse with MOG35‐55 to Induce Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
3:53
Clinical Score and Motor Performance Evaluation of Mouse Induced with ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis
