Name: Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj dwie uzupełniające się metody badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki przy użyciu cytometrii przepływowej. Techniki mt-Keima i MtPhagy umożliwiają ilościową analizę mitofagii w pojedynczych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.L-D. dziękuje za wsparcie ze strony NIH (T32-AI007413 i T32-AG000114). SAS dziękuje za wsparcie ze strony JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Departamentu ds. Weteranów (I01 BX004444), rodziny Brehm i rodziny Anthony.

Badania na zwierzętach przedstawione w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Do tego badania wykorzystano dwudziestotygodniowe samce myszy C57BL / 6J, na 15-tygodniowej regularnej diecie tłuszczowej (RFD) lub diecie wysokotłuszczowej (HFD).
1. Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwniku (Metoda 1)
<ol>
	<li>Przygotowanie i leczenie mysich wysepek
	<ol>
		<li>Wykonaj hodowlę wysp trzustkowych i ekspozycję na walinomycynę, wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Wyizoluj wysepki z regularnej diety tłuszczowej (RFD) lub diety wysokotłuszczowej (HFD, 60 kcal% Fat19) myszy, postępując zgodnie z wcześniej opisanymi metodami2,10.</li>
			<li>Próbki wysepek trzustkowych hodować przez noc w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI uzupełnione 100 jednostkami/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów). Podłoże to będzie określane jako "podłoże wysepkowe".</li>
			<li>Za pomocą pipety pobrać 100 wysepek na 6-centymetrowe szalki Petriego w 2 ml pożywki z wysepek. 
			UWAGA: Warunki zastosowane w tym protokole: (1) Niebarwiona kontrola: niebarwione wysepki RFD; (2) Kontrola tylko DAPI: wysepki RFD barwione DAPI; (3) Kontrola tylko Fluozyna-3-AM: wysepki RFD barwione Fluozyną-3-AM; (4) Kontrola tylko MtPhagy: wysepki RFD barwione MtPhagy; (5) Kontrola tylko TMRE: wysepki RFD barwione TMRE; (6) RFD nieleczone: wysepki RFD barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (7) Wysepki RFD narażone na działanie walinomycyny: Wysepki RFD wystawione na działanie walinomycyny i barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (8) HFD nieleczone: wysepki HFD barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (9) Wysepki HFD narażone na działanie walinomycyny: Wysepki HFD wystawione na działanie walinomycyny i wybarwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI.</li>
			<li>W warunkach (7) i (9) (patrz UWAGA powyżej) narażonych na walinomycynę, dodać 2 μl 250 nΜ walinomycyny (patrz tabela materiałów) do wysepek na szalce Petriego przez 3 godziny w celu wywołania mitofagii.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj dysocjację pojedynczej komórki.
		<ol>
			<li>Po 3 godzinach ekspozycji na walinomycynę pobrać 100 wysepek z każdego stanu do oddzielnych probówek do mikrowirówek za pomocą pipety.</li>
			<li>Obracać wysepki w temperaturze 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
			<li>Próbki przemywać 2x 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), z etapami wirowania (350 x g/1 min, 10 °C) między każdym płukaniem. Po każdym przemyciu wyrzucić sklarowany osad pipetą.</li>
			<li>Aby rozdzielić wyspy trzustkowe na pojedyncze komórki, dodaj 500 μl 0,05% trypsyny (wstępnie podgrzanej do 37 °C) do probówki mikrowirówkowej jednej próbki, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu wysp. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aż wysepki zostaną widocznie rozproszone.</li>
			<li>Natychmiast dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki z wysepek, aby zneutralizować trypsynę. Powtórz trypsynizację i neutralizację dla każdej próbki, pojedynczo.</li>
			<li>Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu. 
			UWAGA: Osad będzie delikatny w przypadku próbek wystawionych na działanie walinomycyny.</li>
			<li>Przemyj próbki 2x pożywką RPMI, bez czerwieni fenolowej, uzupełnioną 100 jednostkami/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Medium to będzie określane jako "medium przepływowe z wysepek". Uwzględnij etapy wirowania (350 x g/1 min, 10 °C) między każdym praniem. Po każdym przemyciu wyrzucić sklarowany osad pipetą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybarwić komórki za pomocą MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI, aby przygotować się do cytometrii przepływowej.
		<ol>
			<li>Zawiesić próbki wysepek w 500 μl pożywki przepływowej z wysepek.</li>
			<li>Dodaj 0,25 μl 100 μM materiału MtPhagy (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik MtPhagy (warunki 4, 6, 7, 8 i 9, UWAGA do kroku 1.1.1).</li>
			<li>Dodaj 0,25 μl 100 μM zapasu TMRE (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik TMRE (warunki 5, 6, 7, 8 i 9).</li>
			<li>Dodaj 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik Fluozyna-3-AM (warunki 3, 6, 7, 8 i 9).</li>
			<li>Wiruj rurki z niską prędkością przez 5 sekund, aby wymieszać.</li>
			<li>Owinąć probówki do mikrowirówek folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W połowie inkubacji probówki wirować z niską prędkością przez 5-10 sekund, aby się wymieszać.</li>
			<li>Po inkubacji odwirować próbki o masie 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
			<li>Zawiesić próbki w podłożu przepływowym o objętości 500 μl. Dodać 0,2 μg/ml DAPI (patrz Tabela materiałów) do warunków 2, 6, 7, 8 i 9.</li>
			<li>Wirować próbki w temperaturze 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w 500 μl pożywki przepływającej na wysepkach.</li>
			<li>Umieść próbki na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Uruchom przyrząd (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Każdy cytometr przepływowy z odpowiednimi filtrami będzie działał. W pracy wykorzystano następujące filtry: (1) VL1 dla DAPI: wzbudzenie/emisja - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 dla fluozyny-3-AM: wzbudzenie/emisja - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 dla barwnika MtPhagy: wzbudzenie/emisja - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 dla TMRE: wzbudzenie/emisja - 561 nm/585 nm (16 nm).</li>
		<li>Dostosuj napięcia dla rozproszenia do przodu (FSC) i bocznego (SSC), aby upewnić się, że populacje komórek znajdują się w środku wykresu punktowego. W przypadku tego protokołu zastosowano napięcia 120 V dla FSC i 260 V dla SSC, aby zapewnić równomierne opadanie ogniw w FSC-A vs. Wykres SSC-A (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Aby wykluczyć komórki inne niż pojedyncze, dodaj bramkę prostokątną na FSC-H vs. FSC-W, a następnie SSC-H vs. SSC-W (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C).</li>
		<li>Dostosuj napięcia i kompensację DAPI, aby filtrować pod kątem ogniw β pod napięciem. Ustaw bramki fluorescencyjne dla każdego użytego fluoroforu na podstawie niebarwionej próbki RFD (<silna klasa="xfig">Rysunki 1D-F). 
		UWAGA: Napięcia używane dla każdego kanału: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.</li>
		<li>Po ustanowieniu bramek zbierz 10 000 zdarzeń na próbkę. 
		UWAGA: Wykorzystując to podejście do bramkowania, poziomy mitofagii w warunkach podstawowych i po indukcji walinomycyny oceniano zarówno w wysepkach RFD, jak i HFD (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
		<li>Zapisywanie danych jako plików FCS do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena mitofagii za pomocą genetycznie kodowanego reportera mt-Keima (Metoda 2)
<ol>
	<li>Przygotowanie mysich wysp trzustkowych i dysocjacja pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Wykonaj hodowlę wysp trzustkowych i ekspozycję na walinomycynę, wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Wyizoluj wyspy trzustkowe od myszy typu dzikiego (WT) i mt-Keima/+ (mt-Keima)6. W tej metodzie wykorzystano 20-tygodniowe samce myszy RFD karmione WT lub mt-Keima/+</li>.
			<li>Hodować próbki wysepek przez noc w temperaturze 37 °C w pożywce z wysepek.</li>
			<li>Za pomocą pipety pobierz 100 wysepek na 6-centymetrowe szalki Petriego z 2 ml pożywki dla wysepek. 
			UWAGA: Warunki zastosowane w tym protokole: (1) Niebarwiona kontrola: Niebarwione wysepki WT; (2) Kontrola tylko DAPI: wysepki WT barwione DAPI; (3) Kontrola tylko Fluozyna-3-AM: wysepki WT barwione Fluozyną-3-AM; (4) Tylko kontrola mt-Keima: niebarwione wysepki mt-Keima/+; (5) Nieleczone: wysepki mt-Keima/+ barwione Fluozin-3-AM i DAPI; (6) Walinomycyna: wysepki mt-Keima/+ wystawione na działanie walinomycyny i barwione Fluozyną-3-AM i DAPI.</li>
			<li>W przypadku warunku (6) z ekspozycją na walinomycynę, dodać 2 μl 250 nM bulionu walinomycyny do wysepek na szalce Petriego przez 3 godziny w celu wywołania mitofagii.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj dysocjację pojedynczej komórki.
		<ol>
			<li>Wykonaj kroki dysocjacji pojedynczej komórki, jak opisano w kroku 1.1.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybarwiaj komórki za pomocą Fluozin-3-AM i DAPI.
		<ol>
			<li>Zawiesić próbki wysepek w 500 μl pożywki przepływowej z wysepek.</li>
			<li>Dodaj 0,25 μl 1 mM bulionu Fluozin-3-AM do probówek otrzymujących barwnik Fluozin-3-AM (warunki 3, 5 i 6).</li>
			<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i przystąpić do poddawania działaniu DAPI, jak opisano w krokach 1.1.3.5-1.3.10.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Uruchom instrument. Będzie działał każdy cytometr przepływowy z odpowiednimi filtrami. 
		UWAGA: W tym badaniu zastosowano następujące filtry: (1) VL1 dla DAPI: Wzbudzenie/Emisja - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 dla fluozyny-3-AM: wzbudzenie/emisja - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 dla neutralnego mt-Keima: wzbudzenie/emisja - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 dla kwasu mt-Keima: wzbudzenie/emisja - 561 nm/620 nm (15 nm).</li>
		<li>Dostosuj napięcia FSC i SSC i wyklucz ogniwa inne niż pojedyncze, jak opisano w krokach 1.2.2-1.2.3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunki 3A-C).</li>
		<li>Dostosuj napięcia i kompensację dla DAPI, Fluozin-3-AM i mt-Keima za pomocą niebarwionych i jednododatnich kontroli (warunki 1-4), aby upewnić się, że populacje komórek fluorescencyjnie dodatnich są możliwe do odróżnienia od komórek niebarwionych. Po zastosowaniu odpowiedniej kompensacji do każdego kanału, ustaw bramkę ujemną DAPI i bramki dodatnie Fluozin-3-AM, aby filtrować żywe komórki β (<silna klasa = "xfig">Rysunki 3D-E).</li>
		<li>Ustaw schemat bramkowania trójkąta, używając dodatniej próbki mt-Keima (warunek 4), aby zidentyfikować kwaśne i obojętne populacje komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F). 
		UWAGA: Napięcia zwykle używane dla każdego kanału: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.</li>
		<li>Po ustanowieniu bramek zbierz 10 000 zdarzeń na próbkę. Schematy bramkowania dla warunków 5 i 6 są zilustrowane w Rysunek 3A-G.</li>
		<li>Zapisywanie danych jako plików FCS do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantitative Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells

<ol><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+%CE%B2-cell+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
<li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li>
<li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Research%22%5BJournal%5D)">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li>
<li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+protects+%CE%B2+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138(2020).</li>
<li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li>
<li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+%CE%B2-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867(2022).</li>
<li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361(2016).</li>
<li>Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+intracellular+K%28%2B%29+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+%CE%B2+cells+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li>
<li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li>
<li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li>
<li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li>
</ol>

SAS otrzymał dofinansowanie od Ono Pharmaceutical Co., Ltd. i jest konsultantem Novo Nordisk.

W protokole tym opisano dwie uzupełniające się metody ilościowego określania strumienia mitofagii w zdysocjowanych pierwotnych wyspach trzustkowych myszy. Stosując metodę mt-Keima, wzrost mitofagii określono ilościowo jako zwiększony stosunek komórek kwaśnych (561 nm) / obojętnych (405 nm), podczas gdy w metodzie MtPhagy zwiększony strumień mitofagii określono ilościowo jako wzrostpopulacji komórek o wysokiejzawartości Fluozin MtPhagyo wysokimTMRE. Metody te pozwalają na szybką, ilościową...

Komórki trz β ustkowe produkują i wydzielają insulinę, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne, a dysfunkcja komórek β jest odpowiedzialna za hiperglikemię i początek cukrzycy zarówno w cukrzycy typu 1, jak i typu 2. Komórki β łączą metabolizm glukozy z wydzielaniem insuliny poprzez energetykę mitochondrialną i produkcję metaboliczną, które zależą od rezerwy funkcjonalnej masy mitochondrialnej1,2,3. Aby utrzymać optymalne funkcjonowanie komórek β, komórki β polegają na mechanizmach kontroli jakości mitochondriów w celu usunięcia starych lub uszkodzonych mitochondriów i zachowania funkcjonalnej masy mitochondrialnej4. Selektywna autofagia mitochondrialna, znana również jako mitofagia, jest kluczowym elementem szlaku kontroli jakości mitochondriów.
Oceny mitofagii w żywych komórkach często opierają się na zmianach pH mitochondriów, które zachodzą podczas mitofagii. Mitochondria mają lekko zasadowe pH, a zdrowe mitochondria zwykle znajdują się w cytozolu o neutralnym pH. Podczas mitofagii uszkodzone lub dysfunkcyjne mitochondria są selektywnie włączane do autofagosomów i ostatecznie usuwane w kwaśnych lizosomach5. Kilka transgenicznych modeli myszy reporterowych mitofagii in vivo, takich jak mt-Keima6, mitoQC7 i CMMR8, a także transfekcyjne sondy mitofagii, takie jak Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, wykorzystuje tę zmianę pH do zapewnienia ilościowej oceny mitofagii. Wykorzystanie myszy transgenicznych z ekspresją wrażliwej na pH sondy metrycznej mt-Keima o podwójnym współczynniku wzbudzenia zostało zoptymalizowane pod kątem oceny mitofagii w wyspach trzustkowych i komórkach β za pomocą cytometrii przepływowej10,11. Stosunek emisji długości fali mt-Keima kwasowej do obojętnej (stosunek wzbudzenia kwasowego 561 nm do obojętnego 480 nm) można wykorzystać do solidnego ilościowego określenia mitofagii6,12.
Ten protokół opisuje zoptymalizowane podejście do oceny strumienia mitofagii w pierwotnych wyspach trzustkowych i komórkach β wyizolowanych od transgenicznych myszy mt-Keima10,11. Chociaż mt-Keima jest bardzo czułą sondą, wymaga albo skomplikowanych schematów hodowli zwierząt, albo transfekcji komórek, co często może być wyzwaniem w przypadku pracy w połączeniu z innymi modelami genetycznymi lub z pierwotnymi ludzkimi wyspami trzustkowymi. Ponadto zastosowanie wielu laserów fluorescencyjnych i detektorów do identyfikacji obojętnych i kwaśnych populacji komórek może ograniczyć kombinatoryczne zastosowanie innych reporterów fluorescencyjnych.
Aby przezwyciężyć te wyzwania, ten protokół opisuje również komplementarną, jednokanałową metodę opartą na barwniku do solidnego wykrywania mitofagii w β-komórkach z izolowanych mysich wysp trzustkowych. Podejście to, określane jako metoda MtPhagy, wykorzystuje kombinację trzech barwników przepuszczalnych dla komórek do selekcji komórek β, ilościowego określenia populacji komórek aktywnie przechodzących mitofagię i jednoczesnej oceny potencjału błony mitochondrialnej (MMP lub Δψm).
Pierwszym z tych barwników jest Fluozin-3-AM, przepuszczalny dla komórek wskaźnik Zn2+ o Ex/Em 494/516 nm13. Mysie wyspy trzustkowe stanowią niejednorodną populację funkcjonalnie odrębnych komórek, w tym komórek α-, β-, δ- i PP. Komórki β stanowią około 80% komórek w mysiej wyspie trzustkowej i można je odróżnić od innych typów komórek wysp trzustkowych ze względu na ich wysokie stężenie Zn2+ w ziarnistościach insuliny14,15, co pozwala na identyfikację komórek β jako populacjio wysokiej zawartości Fluozyny-3-AM. Barwnik MtPhagy, barwnik wrażliwy na pH, który jest unieruchomiony w mitochondriach za pomocą wiązania chemicznego i emituje słabą fluorescencję, jest również stosowany w tym protokole16. Po indukcji mitofagii uszkodzone mitochondria są włączane do kwaśnego lizosomu, a barwnik MtPhagy zwiększa swoją intensywność fluorescencji w środowisku o niskim pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Dodatkowo, Tetramethylrhodamine, ester etylowy (TMRE), jest używany do oceny MMP. TMRE jest przepuszczalnym dla komórek dodatnio naładowanym barwnikiem (Ex/Em 552/575 nm), który jest sekwestrowany przez zdrowe mitochondria ze względu na względny ładunek ujemny podtrzymywany przez ich potencjał błonowy17. Uszkodzone lub niezdrowe mitochondria rozpraszają swój potencjał błonowy, co skutkuje zmniejszoną zdolnością do sekwestracji TMRE. Wykorzystując te barwniki razem, β-komórki poddawane mitofagii można zidentyfikowaćjako populację owysokim poziomieFluozin, MtPhagyi wysokimTMRE, za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ mitofagia jest procesem dynamicznym, a nie statycznym, protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny strumienia mitofagii przy użyciu walinomycyny, jonoforu K+, który indukuje mitofagię po rozproszeniu MMP18. Porównanie mitofagii w obecności i braku walinomycyny pozwala na ocenę strumienia mitofagii w różnych grupach próbek.
Oparty na barwniku charakter obecnego podejścia pozwala na ekstrapolację go na ludzkie wyspy trzustkowe i inne trudne do transfekcji typy komórek i omija potrzebę skomplikowanych schematów hodowli zwierząt, w przeciwieństwie do protokołu mt-Keima. Nadrzędnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie mitofagii w komórkach β na poziomie pojedynczej komórki za pomocą dwóch niezależnych metod opartych na cytometrii przepływowej. Podsumowując, protokół ten opisuje dwie potężne i uzupełniające się metody, które pozwalają zarówno na precyzję, jak i elastyczność w ilościowym badaniu kontroli jakości mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Technologie życia</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Attune NxT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Szok cieplny bez kwasów tłuszczowych Proszek BSA</td><td>Equitech</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>Fluozyna-3AM&nbsp;</td><td>Thermofisher Naukowy&nbsp;</td><td>F24195</td><td>100 &mu; g Proszek Fluozin-3AM rozpuszczony w 51 &mu; L DMSO oraz 51 &mu; L Pluronic F-127 do osiągnięcia 1 mM kolby.</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; RPMI 1640 Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MtPhagy barwnik</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td>5 &mu; g Proszek MtPhagy rozpuszczony z 50 &mu; L DMSO, aby osiągnąć 100 &mu; M zapasów.&nbsp;</td></tr><tr><td>Barwnik MtPhagy</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1x Roztwór stosowany w prokotolu przez rozcieńczenie 1:10 w ddH2O</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>1x Roztwór stosowany w prokotolu przez rozcieńczenie 1:10 w ddH2O</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100x)</td><td>Życie Technologie</td><td>11360-070</td><td>5 &mu; g Proszek MtPhagy rozpuszczony z 50 &mu; L DMSO, aby osiągnąć 100 &mu; M zapasów.&nbsp;</td></tr><tr><td>TMRE [Tetrametylorodamina, ester etylowy, nadchloran]</td> <td>Anaspec</td><td>AS-88061</td><td>Proszek TMRE odtworzony w DMSO do osiągnięcia 100 &mu; M zapasów.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Proszek walinomycyny odtworzony w DMSO, aby osiągnąć 250 nM zapasu.</td></tr></tbody></table>

uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitofagia to mechanizm kontroli jakości niezbędny do utrzymania optymalnej funkcji mitochondriów. Dysfunkcyjna mitofagia komórek β powoduje niewystarczające uwalnianie insuliny. Zaawansowane ilościowe oceny mitofagii często wymagają użycia reporterów genetycznych. Mysi model mt-Keima, który wyraża ukierunkowaną na mitochondria sondę ratiometryczną o podwójnym wzbudzeniu pH, do ilościowego określania mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej, został zoptymalizowany w komórkach β. Stosunek emisji długości fal mt-Keima z kwasowości do obojętności można wykorzystać do solidnego ilościowego określenia mitofagii. Jednak korzystanie z reporterów mitofagii genetycznej może być trudne podczas pracy ze złożonymi genetycznymi modelami myszy lub trudnymi do transfekcji komórkami, takimi jak pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe. Protokół ten opisuje nowatorską, komplementarną metodę opartą na barwniku do ilościowego oznaczania mitofagii komórek β w pierwotnych wyspach trzustkowych za pomocą MtPhagy. MtPhagy to wrażliwy na pH, przepuszczalny dla komórek barwnik, który gromadzi się w mitochondriach i zwiększa intensywność fluorescencji, gdy mitochondria znajdują się w środowiskach o niskim pH, takich jak lizosomy podczas mitofagii. Łącząc barwnik MtPhagy z Fluozin-3-AM, wskaźnikiem Zn2 +, który selekcjonuje komórki β, oraz estrem etylowym tetrametylorodaminy (TMRE) w celu oceny potencjału błony mitochondrialnej, strumień mitofagii można określić ilościowo specyficznie w komórkach β za pomocą cytometrii przepływowej. Te dwa podejścia są wysoce komplementarne, co pozwala na elastyczność i precyzję w ocenie kontroli jakości mitochondriów w wielu modelach β-komórkowych.

Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwnikach 
Tę metodę opartą na barwnikach zoptymalizowano w celu analizy przepływu mitofagii w pierwotnych komórkach β myszy bez konieczności stosowania reportera genetycznego, wykorzystując Fluozin-3-AM, TMRE i MtPhagy, a także DAPI do wykluczenia martwych komórek. Poprzez połączenie tych barwników z walinomycyną w celu indukcji mitofagii, niniejszy protokół opisuje metodę opartą na barwnikach do selektywnego pomiaru przepływu mitofagii w pierwotny...

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Nasz protokół opisuje dwie uzupełniające się metody badania strumienia mitofagii komórek beta w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół mt-Keima wykorzystuje reporter mitofagii genetycznej, podczas gdy protokół MtPhagy łączy trzy barwniki fluorescencyjne, co ułatwia ekstrapolację na trudne do transfekcji komórki w próbkach ludzkich. Oceny mitofagii przy użyciu tradycyjnych podejść biochemicznych i metod obrazowania są zarówno czasochłonne, jak i trudne.Dlatego ważne jest, aby opracować nowe, solidne i skuteczne metody badania strumienia mitofagii w komórkach beta. Zarówno metoda mt-Keima, jak i MtPhagy są ocenami ilościowymi, które są skuteczne w badaniu strumienia mitofagii w komórkach beta trzustki. Tak więc laboratorium Soleimanpour skupia się na różnych mechanizmach, które napędzają niewydolność komórek beta trzustki i cukrzycę.W szczególności skupiamy się na różnych aspektach cyklu życia mitochondriów, w tym na mitofagii, aby zrozumieć, w jaki sposób defekty funkcji mitochondriów napędzają rozwój cukrzycy.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Metody eksperymentalne w inżynierii tkankowej

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Poznaj dwie uzupełniające się metody badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki przy użyciu cytometrii przepływowej. Techniki mt-Keima i MtPhagy umożliwiają ilościową analizę mitofagii w pojedynczych komórkach.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Przeglądaj więcej filmów