Name: Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących przy użyciu pseudowirusa Ha-CoV-2. Platforma umożliwia bezpieczne badanie zakaźności Omikrona w zwykłych laboratoriach bez konieczności stosowania poziomu bezpieczeństwa BSL-3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wewnętrzny fundusz badawczy Uniwersytetu George'a Masona.

1. Wirus i cząsteczki wirusa
<ol>
	<li>Wektory: Kup komercyjnie wektory ekspresyjne dla SARS-CoV-2 M, E lub N, a także SARS-CoV-2 S (typ dziki, Wt), Delta (B.1.617.2) i Omicron (B.1.1.529). 
	UWAGA: Sekwencje białek wektorów ekspresyjnych znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Dostawcę tych wektorów wyrażeń można również znaleźć w tabeli materiałów.</li>
	<li>Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj HEK293T komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. 
	UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza. Transfekcja polietylenoiminy (PEI) zwykle wymaga 5-6 godzin inkubacji. Godziny rozpoczęcia muszą być wcześniej dokładnie przemyślane.</li>
	<li>Składanie wirusa i kotransfekcja oparta na PEI: Składanie cząstek Ha-CoV-2 przez kotransfekcję komórek HEK293T. Komórki nasienne w 10 cm kulturze komórkowej na szalce Petriego (4-5 x 106 komórek na szalkę) w 10 ml kompletnej pożywki DMEM na dzień przed kotransfekcją. W tym badaniu trzy szalki Petriego są używane do wysiewu komórek do składania Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta i Omicron, odpowiednio.</li>
	<li>Inkubować szalki Petriego przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Sprawdź szalki następnego ranka, aby upewnić się, że komórki zlewają się w 80%. Usuń całe podłoże i zastąp je 9 ml pożywki bez surowicy DMEM.</li>
	<li>Dla każdej potrawy należy przygotować mieszaninę kotransfekcji zawierającą 2,5 μg każdego z wektorów ekspresji białek strukturalnych SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (genom HaCoV2) i 2,5 μg wektora ekspresji białka S, wariantu Delta lub Omicron S oraz 45 μl odczynnika do transfekcji na bazie PEI. Pozostawić mieszaninę kotransfekcji do utworzenia kompleksów przez inkubację przez 13 minut (nie inkubować dłużej niż 30 minut).</li>
	<li>Po inkubacji powoli dodawać mieszaninę kotransfekcji do każdej szalki Petriego, kropla po kropli. Umieścić naczynia w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 6 godzin. Po 6 godzinach usuń DMEM bez surowicy i zastąp go kompletnym podłożem DMEM. Zebrać wirusa po 48-60 godzinach od kotransfekcji.</li>
	<li>Zbieranie i przechowywanie wirusa: Zbieranie cząstek po 48 godzinach od kotransfekcji. Oderwać komórki, kilkakrotnie pipetując po powierzchni monowarstwy i zebrać komórki z każdego naczynia, umieścić w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut. Zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 μM. Pseudowirus Ha-CoV-2 należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Test zakaźności wirusa
<ol>
	<li>Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Wysiewanie komórek HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): Dzień przed testem zakaźności wirusa należy wysiać komórki HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Na każdą 96-dołkową płytkę należy zasiać 2,5 x 104 komórki do każdej płytki, a na jedną płytkę potrzeba łącznie 2,5 x 106 komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na noc.</li>
	<li>Zakażenie HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Użyj cząstek wariantów Ha-CoV-2 do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Rano w dniu infekcji usuń 50 μl DMEM z wstępnie wysianej płytki 96-dołkowej. Zastąp pożywkę 50 μl Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta lub Omicron na 18 godzin w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji, a płytka nie będzie gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy. Powodzenie infekcji zależy od testu lucyferazy wynikającego z genu reporterowego lucyferazy ulegającego ekspresji w zakażonych komórkach, dlatego im więcej sygnału jest wytwarzane, tym skuteczniejsza jest infekcja wariantem Ha-CoV-2.</li>
	<li>Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy komórek bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całej 96-dołkowej płytce połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.</li>
	<li>Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA Ha-CoV-2 i ilościowa odwrotna transkryptaza PCR (RT-qPCR)
<ol>
	<li>Ekstrakcja wirusowego RNA: Wyodrębnij wirusowe RNA z cząstek Ha-CoV-2 typu dzikiego oraz Ha-CoV-2 Delta i wariantu Omicron za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowany wirusowy RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do RT-qPCR.</li>
	<li>RT-qPCR: Wykonaj RT-qPCR na wirusowym RNA przy użyciu jednoetapowej mieszanki głównej. Przeprowadź reakcję w komercyjnej maszynie do PCR. Należy pamiętać, że celem amplifikacji jest genomowy RNA Ha-CoV-2. Użyj wektora DNA Ha-CoV-2 jako standardu do tworzenia krzywej standardowej i obliczania liczby kopii RNA każdego wariantu.</li>
</ol>
4. Test przeciwciał neutralizujących
<ol>
	<li>Wysiew komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Dzień przed testem wysiewać komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Ogniwa HEK293T(ACE2/TMPRSS2) są kupowane komercyjnie.</li>
	<li>Do liczenia komórek należy uzyskać 20 μl komórek z kolby T75 zawierającej HEK293T(ACE2/TMPRSS2) komórek i wymieszać z 20 μl roztworu błękitu trypanowego. Dodać 20 μl tej mieszaniny do komory do liczenia komórek i policzyć liczbę komórek na ml. Aby wysiać 96-dołkową płytkę do infekcji, użyj 2,5 x 104 komórek na dołek, a w sumie potrzebnych będzie 2,5 x 106 komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na noc.</li>
	<li>Test przeciwciał neutralizujących: Na sterylnej 96-dołkowej płytce polipropylenowej przygotować standardowe przeciwciało neutralizujące 27BV i mieszaninę Ha-CoV-2. Dodać 8 μl 27BV (45 mg/mL) do płytki i wykonać seryjne rozcieńczenia przeciwciała 6 μl DMEM. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między dokładnymi transferami i upewnić się, że przeciwciało i pożywka bez surowicy są dokładnie wymieszane, aby uzyskać dokładne wyniki.</li>
	<li>Do seryjnie rozcieńczonego przeciwciała dodać 54 μl cząstek Ha-CoV-2 i wymieszać wirusa z przeciwciałem. Wstępnie inkubować cząstki Ha-CoV-2 z seryjnie rozcieńczanym 27BV przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Po 1 godzinnej inkubacji nanieść 50 μl mieszaniny przeciwciał i Ha-CoV-2 na 96-dołkową płytkę zawierającą komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 komórki na basenik) wysiane dzień wcześniej.</li>
	<li>W przypadku kontroli pozostaw co najmniej trzy studzienki zawierające tylko komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Dodaj 50 μl kompletnej pożywki do tych studzienek, aby służyły jako niezainfekowane studzienki dla sygnału tła odczytów testu lucyferazy. 
	UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C, a następnie płytka jest gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy.</li>
	<li>Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całą 96-dołkową płytkę połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.</li>
	<li>Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Gromadzenie danych: Wykonaj testy infekcji i lucyferazy w trzech egzemplarzach, jak wskazano (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Określ ilościowo ekspresję lucyferazy za pomocą odczytów testu lucyferazy. Średnia to średnia wartość trzech odczytów testu lucyferazy. Odczyty sygnału tła z niezainfekowanych studni są odejmowane od tej średniej wartości. Odchylenie standardowe (SD) określa się na podstawie średniej wartości odczytów testu lucyferazy.</li>
	<li>Analiza danych: Wykreśl aktywność neutralizacji przeciwciał i oblicz wartości ID50 (50% dawki hamującej) za pomocą komercyjnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Wartość ID50 definiuje się jako rozcieńczenia hamujące przeciwciała, przy których uzyskuje się 50% zmniejszenie infekcji komórek HEK293T(ACE2 / TMPRSS2) (na podstawie odczytów testu lucyferazy).</li>
</ol>

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Weekly+epidemiological+update+on+COVID-19%22">Weekly epidemiological update on COVID-19</a>. 143, 1(2023).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+emerging+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2%3A+Impacts%2C+challenges+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies.</a> Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+Disease+2019-COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coronavirus Disease 2019-COVID-19.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).</li>
<li>El-Shabasy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+waves+changes%2C+new+variant+strains%2C+and+vaccination+effect+against+COVID-19+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Interim+laboratory+biosafety+guidelines+for+handling+and+processing+specimens+associated+with+coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29%22">Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19)</a>. , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).</li>
<li>Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+biosafety+measures+involving+SARS-CoV-2+and+the+classification+as+a+Risk+Group+3+biological+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent.</a> Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).</li>
<li>Vanderheiden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Rapid+Focus+Reduction+Neutralization+Test+Assay+for+Measuring+SARS-CoV-2+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116(2020).</li>
<li>Dieterle, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Replication-Competent+Vesicular+Stomatitis+Virus+for+Studies+of+SARS-CoV-2+Spike-Mediated+Cell+Entry+and+Its+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition.</a> Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+a+pseudovirus+neutralization+assay+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.</a> Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+effectiveness+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+system+as+determined+by+neutralizing+efficiency+and+entry+inhibition+test+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosafety+and+Health%22%5BJournal%5D)">Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro.</a> Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).</li>
<li>Hetrick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+hybrid+alphavirus-SARS-CoV-2+pseudovirion+for+rapid+quantification+of+neutralization+antibodies+and+antiviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+methods%22%5BJournal%5D)">Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs.</a> Cell reports methods. 2 (3), 100181(2022).</li>
<li>Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).</li>
<li>Jackson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA+Vaccine+against+SARS-CoV-2+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).</li>
<li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li>
<li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+evolution+of+coronavirus+spike+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins.</a> Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).</li>
<li>Donofrio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+SARS-CoV-2+Pseudovirus+Neutralization+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay.</a> Vaccines. 9 (4), 389(2021).</li>
<li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+and+Reagents+for+Pseudotyping+Lentiviral+Particles+with+SARS-CoV-2+Spike+Protein+for+Neutralization+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays.</a> Viruses. 12 (5), 513(2020).</li>
<li>Zettl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+SARS-CoV-2-Neutralizing+Antibodies+Using+Propagation-Defective+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes.</a> Vaccines. 8 (3), 386(2020).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963(2018).</li>
<li>Lundin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+firefly+luciferase+reaction+for+analytical+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).</li>
<li>Deshpande, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients.</a> The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+methods+for+detecting+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Analytical Biochemistry. 673, 115199(2023).</li>
<li>Manischewitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+vaccinia-neutralization+assay+based+on+reporter-gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).</li>
<li>Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omicron+Variant+%28B.1.1.529%29%3A+Infectivity%2C+Vaccine+Breakthrough%2C+and+Antibody+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).</li>
<li>Saxena, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+SARS-CoV-2+Omicron+%28B.1.1.529%29+variant+of+concern+and+its+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective.</a> Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).</li>
</ol>

Uniwersytet George'a Masona złożył wniosek patentowy i udzielił licencji firmie Virongy Biosciences Inc. na rozwój produktu. Y.W. jest założycielem i członkiem rady doradczej Virongy Biosciences. B. H jest obecnie dyrektorem generalnym i dyrektorem naukowym Virongy Biosciences. Autorzy nie mają innych konfliktów interesów.

Platforma Ha-CoV-2 zapewnia szybki, niezawodny i prosty przepływ pracy w celu ilościowego oznaczania wariantów wirusa i neutralizacji przeciwciał. Jest jednak kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Produkcja pseudowirusa Ha-CoV-2 powinna odbywać się przy użyciu komórek HEK293T o wysokiej żywotności. Efektywność kotransfekcji można monitorować 24 godziny po transfekcji za pomocą genu reporterowego GFP z genomu Ha-CoV-2. Genom Ha-CoV-2 może zawierać dwa reportery (GFP i Luc), a GFP może ulegać ekspresji podczas kotransfekcji i po zakażeniu Ha-CoV-2 komórek docelowych12. Komórki GFP+ z infekcji są zwykle na niskim poziomie procentowym (od 1% do 5%), ale każda zakażona komórka wyraża silne sygnały GFP (ryc. 3). Ten niski odsetek GFP może ograniczać stosowanie GFP jako solidnego odczytu do ilościowego określania neutralizacji przeciwciał, w porównaniu z reporterem Luc, który określa ilościowo całą populację zakażonych komórek.
Podczas wykonywania testu neutralizacji należy zmieniać końcówki pipet między dołamkami i upewnić się, że przeciwciało i pożywka wolna od surowicy są dokładnie wymieszane, aby uzyskać dokładne wyniki. Dodatkowo, podczas przeprowadzania protokołu testu lucyferazy, komórki muszą być w pełni poddane lizie przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i uwolnienie enzymu lucyferazy. Zapewni to dokładność testu. Dodatkowo, po dodaniu roztworu testowego lucyferazy świetlika do optycznych płytek 96-dołkowych o białych ściankach, płytkę należy przeanalizować w ciągu 10 minut, ponieważ początkowa emisja światła jest wysoka, ale zmniejsza się z czasem, gdy ATP jest wyczerpane21.
Ponieważ coraz więcej wariantów SARS-CoV-2 nadal ewoluuje, istnieje zwiększone zapotrzebowanie na platformy takie jak Ha-CoV-2 do szybkiego badania przesiewowego pod kątem zakaźności wariantu i wrażliwości wariantu na przeciwciała neutralizujące wywołane szczepionką. Platforma Ha-CoV-2 oferuje większą prędkość, wyższy stosunek sygnału do szumu i prosty protokół w porównaniu z istniejącymi testami neutralizacji opartymi na pseudowirusach 8,9,10,11. Platforma Ha-CoV-2 ma również tę zaletę, że może być stosowana w laboratoriach BSL-2 i nie wymaga korzystania z urządzeń BSL-3. Dzięki temu SARS-CoV-2 może być badany we wspólnych laboratoriach badawczych i klinicznych. Co więcej, platforma Ha-CoV-2 daje szybkie wyniki w porównaniu z innymi systemami. Na przykład w badaniu przeciwciał neutralizujących przeciwko zakaźnemu wirusowi SARS-CoV-2 często wykorzystuje się test neutralizacji z redukcją płytki nazębnej (PRINT)22. Chociaż PRINT daje wiarygodne wyniki, ręczne liczenie jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) jest powolne i wymaga 3-5 dni na uzyskanie wyników23,24. Inne systemy pseudotypów, takie jak lentiwirus-pseudowirus, potrzebują 24-72 godzin, aby wytworzyć wykrywalny sygnał reporterowy12. Dla porównania, test neutralizacji Ha-CoV-2 może przynieść wyniki w ciągu 18 godzin. Ha-CoV-2 stanowi wygodne narzędzie do szybkich badań przesiewowych i kwantyfikacji wariantów wirusa oraz przeciwciał neutralizujących do monitorowania pandemii.
Monitorowanie zakaźności SARS-CoV-2 jest niezbędne, ponieważ wciąż pojawia się więcej wariantów budzących obawy (LZO). Ha-CoV-2 ma tę zaletę, że szybko określa zakaźność LZO. W poprzednich badaniach wykorzystano modelowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI) do ilościowej analizy zakaźności podwariantu Omikron i innych wariantów SARS-CoV-2, takich jak wariant Delta25. Badania te wykazały, że wariant Omikron jest bardziej zaraźliwy niż oryginalny wirus i ma większe szanse na uniknięcie przeciwciał neutralizujących25. W badaniach tych z użyciem Ha-CoV-2 zaobserwowano podobne fenotypy. Dodatkowo, w testach neutralizacji przeciwciał, wariant Omikron jest dziesięciokrotnie mniej podatny na neutralizację przez 27BV niż szczepy Wuhan i Delta. Wyniki te są również zgodne z zgłaszaną wyższą transmisyjnością wariantu Omicron, który ma co najmniej 15 mutacji w domenie wiążącej receptor (RBD), co prawdopodobnie zwiększa powinowactwo wiązania wirusa z receptorem ACE2 w celu uzyskania wyższej zdolności przenoszenia i większej ucieczki immunologicznej26.

Od maja 2023 roku odnotowano już ponad 766 milionów przypadków COVID-191. Pomimo ogólnoświatowych kampanii szczepień, SARS-CoV-2 stale krąży i zakaża ludzi, głównie z powodu pojawienia się nowych wariantów, takich jak Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529), które napędzają nowe fale infekcji2,3,4. Biorąc pod uwagę, że SARS-CoV-2 stale ewoluuje, ważne jest, aby opracować szybkie testy, które mogą dokładnie mierzyć zakaźność pojawiających się wariantów i skuteczność przeciwciał neutralizujących wywołanych szczepionką przeciwko tym wariantom. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla nadzoru nad pandemią oraz dla określenia skuteczności szczepionek i ich dawek przypominających specyficznych dla danego wariantu.
Ze względu na wysoce zaraźliwy charakter SARS-CoV-2, Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) wymaga, aby badanie SARS-CoV-2 i jego wariantów było prowadzone w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 35,6. Ten wymóg BSL-3 ogranicza stosowanie żywych wirusów do ilościowego określania zakaźności wariantów wirusa i ich przeciwciał neutralizujących we wspólnych laboratoriach badawczych i klinicznych. Ponadto tradycyjne testy neutralizacji SARS-CoV-2, takie jak testy oparte na efektach blaszkowych lub cytopatycznych przy użyciu żywych wirusów kompetentnych do replikacji, są czasochłonne i wymagają długich okresów inkubacji7. Kilka pseudotypowanych białek kolców (S) pseudowirusów SARS-CoV-2 zostało opracowanych w celu ilościowego określenia skuteczności przeciwciał neutralizujących8,9,10,11,12. W SARS-CoV-2 białko S jest głównym białkiem, które pośredniczy w wnikaniu wirusa13 i jest głównym antygenem stosowanym w szczepionkach przeciwko SARS-CoV-29,10,14,15,16. Wiriony pseudotypowane białkiem S, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) lub lentiwirus, zostały wykorzystane do ilościowego określenia przeciwciał neutralizujących17,18,19. Niemniej jednak pseudowirus oparty na lentiwirusie zwykle wymaga od 2 do 3 dni infekcji w celu ilościowego określenia sygnałów reporterowych. Systemy pseudowirusowe oparte na VSV często zawierają szczątkowe wirusy VSV, które mogą powodować wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich i zazwyczaj wymagają 24 godzin infekcji20.
Nowy system pseudowirusów SARS-CoV-2, hybrydowy pseudowirus alfawirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), został niedawno opracowany przez Hetrick et al12. Ha-CoV-2 zapewnia nowe narzędzie do szybkiej kwantyfikacji zakaźności wirusa i wrażliwości wirusa na przeciwciała neutralizujące we wspólnych laboratoriach BSL-2. Strukturalnie Ha-CoV-2 przypomina cząstkę wirionu SARS-CoV-2, składającą się z białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym białka S (S), błony (M), nukleokapsydu (N) i otoczki (E) i nie ma białka strukturalnego z innych wirusów. Dodatkowo cząstka Ha-CoV-2 zawiera szybko ulegający ekspresji genom RNA z alfawirusa do szybkiej ekspresji reporterowej w komórkach. Wykazano, że Ha-CoV-2 szybko mierzy neutralizującą aktywność przeciwciał w surowicy osób zaszczepionych i rekonwalescentów12. Jak wykazano przez Hetricka i wsp., w porównaniu z pseudowirusem SARS-CoV-2 opartym na lentiwirusie w teście przebiegu czasu, Ha-CoV-2 wykazywał ekspresję reportera Luc już 2-4 godziny po zakażeniu, podczas gdy pseudowirus lentiwirusa wyrażał Luc po 24 h12. Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV (patrz rysunek uzupełniający 1)12. W niniejszej pracy szczegółowo opisano wykorzystanie platformy Ha-CoV-2 do szybkiego oznaczania zakaźności wariantów SARS-CoV-2 na przykładzie wariantów Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529). Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV12.

<table><tbody><tr><td>27VB1 20 i mikro; g Standardowe przeciwciało neutralizujące SARS-CoV-2</td><td>Virongy Biosciences</td><td>27VBI-01</td><td></td></tr><tr><td>500 ml - Pochodzenie z USA FBS</td><td>Neuromics</td><td>FBS001</td><td></td></tr><tr><td>AB Płytka mieszająca: Olympus 96-dołkowa płytka do PCR, ultracienka ścianka bez spódnicy, naturalna, 25 płytek/szt&nbsp;</td><td>Genesee Scientific Cat</td><td># 24-300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra 6R</td><td>Redlica Beckman</td><td>2043-30-1158</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x)&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>- GenClone 25-209 - Kolby poddane działaniu TC, 250 ml, Powierzchnia wzrostu wentylacji: 75,0 cm2, 5 na rękaw, 100 kolb / jednostkę</td><td>Genesee Scientfic</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek GlowMax Discover</td><td>Promega&nbsp;</td><td>GM3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wektor Ha-CoV-2 E&nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_E</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 M Wektor&nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_M</td><td></td></tr><tr><td>wektor Ha-CoV-2 N&nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_N</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_WT S</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Hek293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlenie Firefly Lucyferazy Ulepszony zestaw testowy 1000 testów</td><td>Gold Bio&nbsp;</td>Płytka infekcyjna <td>I-930-1000</td><td></td></tr><tr><td>: 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej, Greiner Bio-One (z pokrywką, &mu; Przezroczysty biały płaski okrągły, komin)&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>Kot# 82050-758&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&Psi; (Genom Ha-CoV-2) Wektor&nbsp;</td><td>Własny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do transfekcji na bazie PEI</td><td>Virongy Biosciences</td><td>Transfektyna</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninamina, rozgałęziona</td><td>Millipore Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 7 Pro</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>A43163</td><td></td></tr><tr><td>Gotowe do użycia (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Komórki</td><td>Virongy Biosciences</td><td>Gotowe do użycia komórki</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S&nbsp; Wektor Omicron (B.1.1.529)</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2-B.1.1.529</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&nbsp; Vector</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2- B.1.617.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, PES, 0,22 i mikro; m</td><td>Genesee Scientfic</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4444432</tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr></tbody></table>

zastosowanie pseudowirusa ha-cov-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów sars-cov-2 i przeciwciał neutralizujących

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) uwypukliła potrzebę szybkich testów, aby dokładnie zmierzyć zakaźność pojawiających się wariantów SARS-CoV-2 oraz skuteczność indukowanych szczepionką przeciwciał neutralizujących przeciwko wariantom wirusa. Testy te są niezbędne do nadzoru nad pandemią i walidacji szczepionek i dawek przypominających specyficznych dla wariantu. Niniejszy manuskrypt demonstruje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) do szybkiej oceny ilościowej zakaźności wariantu SARS-CoV-2 i indukowanych szczepionką przeciwciał neutralizujących warianty wirusa. Ha-CoV-2 to cząsteczka podobna do wirusa SARS-CoV-2 składająca się z białek strukturalnych wirusa (S, M, N i E) oraz szybko eksprymującego się genomu RNA pochodzącego z alfawirusa, wirusa lasu Semliki (SFV). Ha-CoV-2 zawiera również zarówno białko zielonej fluorescencji (GFP), jak i geny reporterowe lucyferazy, które pozwalają na szybkie ilościowe określenie zakaźności wirusa. Na przykład określa się ilościowo zakaźność wariantów SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529), a także mierzy się ich wrażliwość na przeciwciało neutralizujące (27VB). Przykłady te pokazują ogromny potencjał Ha-CoV-2 jako solidnej platformy do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i ich podatności na przeciwciała neutralizujące.

Cząsteczki Ha-CoV-2 zmontowano przy użyciu pięciu różnych wektorów DNA kodujących genom RNA Ha-CoV-2 oraz białka strukturalne (M, N, E i S) SARS-CoV-2 w komórkach HEK293T. Wektor białka S różni się w zależności od wariantu S. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano białko S z pierwotnego szczepu Ha-CoV-2 z Wuhan (typ dziki, Wt), które zmontowano wraz z białkiem S z każdego z dwóch pozostałych wariantów: Delta (B.1.617.2) lub Omicron (B.1.1.529). W przypadku wszystkich wariantów zastosowano te same białka M, N i E. Cząsteczki Ha-CoV-2(Wt) oraz wariantów zebrano 48 h po kotransfekcji, a następnie wykorzystano je do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Zakaźność mierzono na podstawie ekspresji lucyferazy 18 h po zakażeniu. W tym systemie wyższe poziomy sygnału lucyferazy odzwierciedlają silniejszy stopień zakażenia komórek przez Ha-CoV-2. Sygnał lucyferazy znormalizowano względem liczby kopii RNA genomowego za pomocą RT-qPCR dla każdego wariantu. Jak pokazano na rycinie 1, wariant Omicron Ha-CoV-2 generował sygnał od 4 do 10 razy wyższy niż pierwotny Ha-CoV-2(Wt), co sugeruje wyższą zakaźność.
Ponadto określono zdolność przeciwciała 27BV do neutralizacji wariantów HaCoV-2(Wt), Delta oraz Omicron. 27BV jest króliczym przeciwciałem monoklonalnym opracowanym przeciwko domenie RBD białka S1 SARS-COV-2. W testach neutralizacji przeprowadzono seryjne rozcieńczenia 27BV na płytce 96-dołkowej, poddano je preinkubacji z Ha-CoV-2, a następnie dodano do komórek docelowych HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Wyniki wykazały, że 27BV posiadało aktywność neutralizującą wobec wszystkich badanych wariantów (Rycina 2). Co ciekawe, ID50 27VB dla wariantu Omicron było około 10 razy niższe niż ID50 dla Ha-CoV-2(WT) oraz Ha-CoV-2(Delta; Rycina 2). Wyniki te dowodzą, że platforma Ha-COV-2 może być wykorzystana jako szybka metoda ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących indukowanych szczepionką w przypadku pojawiających się wariantów.
<img alt="Metoda kotransfekcji SARS-CoV-2 z komórkami HEK293T; schemat i wykres słupkowy wyników sygnału lucyferazy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Montaż i kwantyfikacja wariantów Ha-CoV-2. (A) Ilustracja montażu cząsteczek Ha-CoV-2 i jego wariantów. Wektory ekspresyjne genomu reporterowego i białek strukturalnych (M, S, N i E) Ha-CoV-2 są kotransfekowane do komórek HEK293T. Cząsteczki zebrano 48 h po kotransfekcji (wizualizacja cząsteczki wirionu i komórek HEK293T została wykonana w Biorender.com). (B) Kwantyfikacja zakaźności wariantów Ha-CoV-2. Względna zakaźność dwóch wariantów (Delta i Omicron) została skwantyfikowana i znormalizowana przy użyciu kopii genomowego RNA poszczególnych wariantów Ha-CoV-2 (Luc). Typem dzikim jest Ha-COV-2 (Wt), który służy jako kontrola do porównania. Testy zakaźności i lucyferazy przeprowadzono 3x. RU, jednostka względna. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe neutralizacji przeciwciał: względna zakaźność w funkcji Log10 stężenia; warianty WT, Delta, Omicron." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ilościowe określenie aktywności neutralizacyjnej 27BV przeciwko wariantom Ha-CoV-2(Luc) Aktywność neutralizacyjną 27BV analizowano 18 h po zakażeniu komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ID50 obliczono na podstawie względnego wskaźnika zakażeń (aktywność lucyferazy) w zależności od stężenia 27BV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Komórki zakażone Ha-CoV-2; mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna GFP; metoda wizualizacji wirusa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zakażenie komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2) wirusem Ha-CoV-2(GFP). Cząsteczki Ha-CoV-2(GFP) zostały zmontowane, a następnie wykorzystane do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ekspresję GFP obserwowano 48 h po zakażeniu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Po lewej stronie przedstawiono pole jasne zakażonych komórek, a po prawej obrazowanie GFP. Biały pasek odpowiada 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1. Abstrakt graficzny. Struktura i zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2. Obraz utworzony za pomocą Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1. Sekwencje białek. Lista sekwencji białek S, M, N i E wirusa SARS-CoV-2. Sekwencje białka S obejmują również warianty SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) i Delta (B.1.617.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

W protokole tym ustaliliśmy dwa główne ustalenia. Po pierwsze, nasza platforma Ha-CoV-2 pokazuje, że nowo powstały podwariant Omikron jest bardziej zakaźny niż oryginalny szczep z Wuhan. Dodatkowo podwarianty Omikronu są bardziej odporne na przeciwciała neutralizujące indukowane przez poprzednie szczepy.Badania nad SARS-CoV-2 wymagają zaplecza BSL-3, co utrudnia powszechnym laboratoriom monitorowanie wariantów SARS-CoV-2 i ilościowe określanie przeciwciał neutralizujących. Nasz system Ha-CoV-2 jest pseudotypem wirusa, który może być stosowany w powszechnych laboratoriach i zapewnia szybszy sposób ilościowego określania wariantów wirusa i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące. Ha-CoV-2 to cząsteczka podobna do wirusa, która posiada wszystkie białka strukturalne SARS-CoV-2 i przypomina SARS-CoV-2.Ponadto Ha-CoV-2 wykorzystuje wektor wirusa alfa do solidnej i szybkiej ekspresji genów, dając szybkie wyniki i wysoki stosunek sygnału do szumu, co zapewnia doskonałą odtwarzalność. Zacznij od utrzymania komórek HEK293T i DMEM zawierających inaktywowany termicznie FBS, penicylinę i streptomycynę w kolbie T75. Do liczenia komórek zmieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego.Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek zmieszanej z barwnikiem do komory zliczania komórek i policz liczbę komórek na mililitr. Wysiewaj HEK293T komórki w 10 mililitrach kompletnego DMEM na 10-centymetrowej szalce Petriego do hodowli komórek. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia usuń całe podłoże i zastąp je dziewięcioma mililitrami pożywki bez surowicy DMEM. Korzystając z podanych związków składania cząstek wirusa, należy przygotować mieszaninę kotransfekcji. Powoli dodaj mieszaninę na szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin.Po inkubacji zastąp DMEM bez surowicy kompletną pożywką DMEM i kontynuuj inkubację w celu kotransfekcji przez okres do 48 godzin. Następnie odłącz komórki, wielokrotnie pipetując powierzchnię monowarstwy i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 g przez pięć minut.Zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 mikrona. Filtrat zawierający pseudowirusa Ha-CoV-2 należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Rozpocznij od utrzymania HEK293T komórek ACE2 / TMPRSS2 w DMEM zawierających podgrzany aktywowany FBS, penicylinę i streptomycynę w kolbie T75.Do liczenia komórek zmieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek zmieszanej z barwnikiem do komory zliczania komórek i policz liczbę komórek na mililitr. Wysiew 2,5 x 10 do mocy 4 HEK293T komórek ACE2/TMPRSS2 w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki DMEM do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.Inkubuj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp 50 mikrolitrów DMEM 50 mikrolitrami zawiesiny wirusa i inkubuj przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodaj 7,5 mikrolitra buforu do lizy komórek do każdej studzienki i mieszaj na wytrząsarce orbitalnej przez dwie minuty.Po lizie komórek dodaj świeżo przygotowany roztwór testowy lucyferazy świetlików i mieszaj je na wytrząsarce orbitalnej przez jedną minutę. Analizuj aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy. Do testu przeciwciał neutralizujących HEK293T się komórki nasienne w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM, jak wykazano wcześniej.Do 96-dołkowej płytki dodać osiem mikrolitrów przeciwciała neutralizującego 27 BV i wykonać seryjne rozcieńczenia sześcioma mikrolitrami DMEM bez surowicy. Dodać 54 mikrolitry cząsteczki wirusa Ha-CoV2 do seryjnie rozcieńczonego przeciwciała i wymieszać zawiesinę. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny wirusa do studzienek zawierających HEK293T komórek. W przypadku kontroli dodać 50 mikrolitrów kompletnej pożywki DMEM do studzienek zawierających tylko HEK293T komórek. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 18 godzin.Po lizie komórek, jak wykazano wcześniej, dodać świeżo przygotowany roztwór testowy lucyferazy świetlików i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez jedną minutę. Analizuj aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy Warianty Ha-CoV2 Omicron i Omicron generowały od czterech do dziesięciu razy wyższy sygnał niż Ha-CoV2 typu dzikiego, co sugeruje wyższą zakaźność. Przeciwciało 27 BV wykazało aktywność neutralizującą zarówno przeciwko wariantom Delta, jak i Omikron.ID50 z 27 BV dla Omicron był około 10 razy słabszy niż ID50 dla typu dzikiego i Delta.

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film prezentuje test neutralizacji mierzący skuteczność surowicy w neutralizacji wirusów SARS-CoV-2. Obejmuje wirusy pseudotypowane, rozcieńczenie surowicy i kwantyfikację na podstawie luminescencji, ujawniającą miano neutralizacji.

Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.

Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Poznaj metodę kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących przy użyciu pseudowirusa Ha-CoV-2. Platforma umożliwia bezpieczne badanie zakaźności Omikrona w zwykłych laboratoriach bez konieczności stosowania poziomu bezpieczeństwa BSL-3.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Przeglądaj więcej filmów