Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

W protokole tym ustaliliśmy dwa główne ustalenia. Po pierwsze, nasza platforma Ha-CoV-2 pokazuje, że nowo powstały podwariant Omikron jest bardziej zakaźny niż oryginalny szczep z Wuhan. Dodatkowo podwarianty Omikronu są bardziej odporne na przeciwciała neutralizujące indukowane przez poprzednie szczepy.

Badania nad SARS-CoV-2 wymagają zaplecza BSL-3, co utrudnia powszechnym laboratoriom monitorowanie wariantów SARS-CoV-2 i ilościowe określanie przeciwciał neutralizujących. Nasz system Ha-CoV-2 jest pseudotypem wirusa, który może być stosowany w powszechnych laboratoriach i zapewnia szybszy sposób ilościowego określania wariantów wirusa i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące. Ha-CoV-2 to cząsteczka podobna do wirusa, która posiada wszystkie białka strukturalne SARS-CoV-2 i przypomina SARS-CoV-2.

Ponadto Ha-CoV-2 wykorzystuje wektor wirusa alfa do solidnej i szybkiej ekspresji genów, dając szybkie wyniki i wysoki stosunek sygnału do szumu, co zapewnia doskonałą odtwarzalność. Zacznij od utrzymania komórek HEK293T i DMEM zawierających inaktywowany termicznie FBS, penicylinę i streptomycynę w kolbie T75. Do liczenia komórek zmieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego.

Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek zmieszanej z barwnikiem do komory zliczania komórek i policz liczbę komórek na mililitr. Wysiewaj HEK293T komórki w 10 mililitrach kompletnego DMEM na 10-centymetrowej szalce Petriego do hodowli komórek. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia usuń całe podłoże i zastąp je dziewięcioma mililitrami pożywki bez surowicy DMEM. Korzystając z podanych związków składania cząstek wirusa, należy przygotować mieszaninę kotransfekcji. Powoli dodaj mieszaninę na szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin.

Po inkubacji zastąp DMEM bez surowicy kompletną pożywką DMEM i kontynuuj inkubację w celu kotransfekcji przez okres do 48 godzin. Następnie odłącz komórki, wielokrotnie pipetując powierzchnię monowarstwy i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 g przez pięć minut.

Zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 mikrona. Filtrat zawierający pseudowirusa Ha-CoV-2 należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Rozpocznij od utrzymania HEK293T komórek ACE2 / TMPRSS2 w DMEM zawierających podgrzany aktywowany FBS, penicylinę i streptomycynę w kolbie T75.

Do liczenia komórek zmieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek zmieszanej z barwnikiem do komory zliczania komórek i policz liczbę komórek na mililitr. Wysiew 2,5 x 10 do mocy 4 HEK293T komórek ACE2/TMPRSS2 w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki DMEM do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.

Inkubuj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp 50 mikrolitrów DMEM 50 mikrolitrami zawiesiny wirusa i inkubuj przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodaj 7,5 mikrolitra buforu do lizy komórek do każdej studzienki i mieszaj na wytrząsarce orbitalnej przez dwie minuty.

Po lizie komórek dodaj świeżo przygotowany roztwór testowy lucyferazy świetlików i mieszaj je na wytrząsarce orbitalnej przez jedną minutę. Analizuj aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy. Do testu przeciwciał neutralizujących HEK293T się komórki nasienne w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM, jak wykazano wcześniej.

Do 96-dołkowej płytki dodać osiem mikrolitrów przeciwciała neutralizującego 27 BV i wykonać seryjne rozcieńczenia sześcioma mikrolitrami DMEM bez surowicy. Dodać 54 mikrolitry cząsteczki wirusa Ha-CoV2 do seryjnie rozcieńczonego przeciwciała i wymieszać zawiesinę. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny wirusa do studzienek zawierających HEK293T komórek. W przypadku kontroli dodać 50 mikrolitrów kompletnej pożywki DMEM do studzienek zawierających tylko HEK293T komórek. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 18 godzin.

Po lizie komórek, jak wykazano wcześniej, dodać świeżo przygotowany roztwór testowy lucyferazy świetlików i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez jedną minutę. Analizuj aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy Warianty Ha-CoV2 Omicron i Omicron generowały od czterech do dziesięciu razy wyższy sygnał niż Ha-CoV2 typu dzikiego, co sugeruje wyższą zakaźność. Przeciwciało 27 BV wykazało aktywność neutralizującą zarówno przeciwko wariantom Delta, jak i Omikron.

ID50 z 27 BV dla Omicron był około 10 razy słabszy niż ID50 dla typu dzikiego i Delta.