Name: Eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Poznaj metodę eksplantacji membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo. Technika ta zachowuje integralność tkanek i umożliwia precyzyjne badania transportu leków do ucha wewnętrznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIDCD nr 1K08DC020780 i 5T32DC000027-33 oraz Rubenstein Hearing Research Fund.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (GP18M226). W niniejszej pracy wykorzystano świnki morskie albinosy Hartley (zarówno samce, jak i samice, o masie 500-700 g).
1. Przygotowanie i przygotowanie procedury
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia tlenkiem etylenu przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem. 
	UWAGA: W obecnym badaniu zastosowano nienapełnioną komorę do uwolnienia 100% dwutlenku węgla (CO2) z komercyjnej butli. Do regulacji przepływu gazu zastosowano wbudowany ogranicznik, utrzymujący go w zakresie od 30% do 70% objętości komory na minutę zgodnie z wytycznymi AVMA 202011.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze i dozuj dwutlenek węgla przez 5 minut. Przepływ CO2 utrzymuje się przez 1 minutę po zatrzymaniu oddechu.</li>
	<li>Wykonaj dekapitację po zatrzymaniu oddechu, aby zapewnić eutanazję.</li>
</ol>
2. Podejście chirurgiczne i eksplantacja
<ol>
	<li>Wyciągnij kość skroniową z czaszki świnki morskiej w zwykły sposób12. Usuń nadmiar tkanki miękkiej za pomocą rongeur. Zidentyfikuj zewnętrzny przewód akustyczny, pęcherz skroniowy i kanał twarzowy13 (Rysunek 1).</li>
	<li>Wywiercić brzuszne aspekty pęcherza skroniowego za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 6 mm (patrz tabela materiałów), odsłaniając obwodowo przestrzeń ucha środkowego i zewnętrzny przewód słuchowy.</li>
	<li>Za pomocą rongeurs delikatnie usunąć zewnętrzny przewód słuchowy i pierścień bębenkowy, jednocześnie oddzielając staw inkudomalleolarny. Zidentyfikuj kowadełko, staw wklęsły, ślimak, poziomy kanał półkolisty i kanał twarzowy13 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Oddziel staw inkubpedowy i usuń kowadełko za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj kostną niszę okrągłego okna.</li>
	<li>Użyj wiertła diamentowego o średnicy 6 mm, aby wywiercić blaszkę kostną łączącą ślimak ze ścianą przyśrodkową jamy bębenkowej w kierunku kanału napinacza błony bębenkowej. Ostrożnie zdekompresować kanał kostny napinacza błony bębenkowej i usunąć mięsień napinacza błony bębenkowej za pomocą igły 28 G. 
	UWAGA: Przyśrodkowa ściana dołu tensora błony bębenkowej łączy się bezpośrednio z kością ślimaka wokół RWM i należy uważać, aby nie spowodować złamań, które mogą rozciągać się do okrągłego okienka.</li>
	<li>Wywierć blaszkę kostną łączącą ślimak z dolną ścianą jamy bębenkowej, aż pozostanie 1 mm kostnej półki przylegającej do ślimaka (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 2 mm (patrz Tabela materiałów) wykonaj ślimakotomię w zwoju podstawowym ślimaka, pozostawiając około 2 mm kości do okrągłego okienka. Kontynuuj cochleostomię niżej w płaszczyźnie równoległej do okrągłej błony okiennej, aby oddzielić podstawę od wierzchołka ślimaka.</li>
	<li>Przedłuż ślimakotomię przeciąć przez podstawę czaszki, która jest znacznie gęstsza, co daje widok przekrojowy podstawnego zwoju ślimaka. 
	UWAGA: Skierowanie wiertła w stronę przewodu słuchowego wewnętrznego powoduje trajektorię, która maksymalizuje usuwanie kości, unikając jednocześnie przechodzenia zbyt blisko okrągłego okienka.</li>
	<li>Zbadaj próbkę od strony podstawy czaszki i, jeśli jeszcze tego nie zrobiono, zidentyfikuj wewnętrzny przewód słuchowy i wywierć do otworu ślimakowego. Usunąć nerw ślimakowy za pomocą igły 28 G.</li>
	<li>Zbadaj próbkę od strony wewnątrzślimakowej. Zidentyfikuj i usuń kostną blaszkę spiralną w zwoju podstawowym oraz pozostały modiolus za pomocą kleszczy lub igły 28 G.</li>
	<li>Obficie przepłukać zunifikowaną jamę przedsionkową scala tympani-scala, aby usunąć zanieczyszczenia. Okrągłe okienko powinno być wyraźnie widoczne z miejsca kokektomii, bez żadnych leżących nad nim odłamków (Rysunek 2C).</li>
	<li>Następnie zbadaj próbkę od strony ucha środkowego. Wywierć boczny kanał półkolisty i kanał twarzowy do poziomu okienka owalnego. Delikatnie usuń strzemiączko za pomocą kleszczy, odsłaniając owalną wnękę okienną. Warto zauważyć, że między skorupą strzemiączka znajduje się kostny mostek znany jako krista strzemiączko.</li>
	<li>Za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów) otwórz przedsionek jeszcze bardziej, przedłużając owalne okienko wzdłuż powierzchni okrągłego okna, uważając, aby 1-2 mm kości ślimakowej przylegało do okrągłej niszy okiennej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Uzupełnij nacięcia kości skroniowej, łącząc nacięcia okienka owalnego z nacięciami po kokchlektomii po obu stronach okrągłego okienka. 
	UWAGA: Ze względu na kruchość kości ślimaka, zachowanie dołu tensora błony bębenkowej w próbce i unikanie jej przecięć pomoże zapobiec złamaniom kości ślimaka, które rozciągają się do RWM i zagrażają jego integralności.</li>
	<li>Wykonaj ostatnie mocowania do gęstej kości podstawy czaszki przylegającej do wewnętrznego kanału słuchowego i delikatnie ogol się, aby uzyskać wyciętą próbkę RWM (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A).</li>
</ol>

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

W miejscowym dostarczaniu leków do ucha, RWM jest główną drogą przejścia, aby leki docierały do ucha wewnętrznego. Potrzebny jest dokładny i niezawodny model laboratoryjny, aby lepiej zrozumieć mechanizmy transportu i przepuszczalność w nowych pojazdach dostawczych oraz opracowywać leki. W tym badaniu wykazaliśmy, że eksplantacja RWM świnki morskiej jest wykonalną i niezawodną procedurą, która pozwala na systematyczne badanie interakcji lek-błona. Lundman i wsp. oraz Kelso i wsp. opisali wcześniej użycie podobnego modelu przepuszczalności RWM 2,16; jednak do tej pory nie opisano szczegółowo konkretnych etapów ekstrakcji chirurgicznej, a kruchość kości ślimaka i złożona anatomia stanowiły wyzwanie dla konsekwentnego, en bloc zbioru nienaruszonych RWM.
Świnka morska RWM znajduje się na końcu błony bębenkowej ślimaka i jest otoczona cienką warstwą kości ślimakowej. Złamanie tej struktury kostnej podczas procesu eksplantacji może spowodować, że próbka stanie się bezużyteczna, ponieważ RWM ma tendencję do odrywania się, jeśli otaczająca kość ślimaka nie pozostaje nienaruszona. Nasza grupa zauważyła, że złamania najczęściej występowały podczas wiercenia w pobliżu połączenia między bardzo gęstą kością podstawy czaszki a kruchym ślimakiem, ponieważ zmiana gęstości kości zwiększała prawdopodobieństwo rozprzestrzeniania się złamania przez okrągłe okienko. Z tego powodu sugeruje się, że utrzymanie gęstszej kości dołu tensora błony bębenkowej, która jest przyczepiona do ślimaka w bliskiej odległości od RW, zwiększy wydajność pobierania próbek, szczególnie u starszych zwierząt. Przerwanie kości może również wystąpić podczas usuwania treści ślimaka; Należy zachować ostrożność, aby delikatnie usunąć spiralną blaszkę kostną przy minimalnej manipulacji otaczającą ją kością ślimakową.
Ważnym szczegółem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tego modelu, jest żywotność RWM po eksplantacji. Wcześniejsze grupy sugerowały, że RWM ssaków pozostaje żywotny przez 24-48 godzin po ekstrakcji17. Niniejsze badanie odzwierciedla te ustalenia; konsekwentne badania transportu i analizy histologiczne wykazujące nienaruszone struktury komórkowe (ryc. 2A) potwierdziły żywotność RWM świnki morskiej w czasie eksperymentów. Aby utrzymać ogólny stan zdrowia pobranej próbki, RWM jest ekstrahowany i osadzany w ciągu 3 godzin od eutanazji.
W badaniach farmakokinetyki leków w RWM in vivo nadal występują znaczne trudności techniczne w dokonywaniu pomiarów rozkładu i stężenia perylimfatycznego1. Zmiany w metodach podawania do błony bębenkowej i stosowanych ilościach przyniosły zróżnicowane wyniki terapeutyczne. Trudności te są potęgowane przez złożoną dynamikę płynów w labiryncie, a także nieregularne wychodzenie wstrzykiwanego materiału przez trąbkę Eustachiusza. Opisana metoda eksplantacji pozwala na izolowane badanie RWM oraz czynników wpływających na jego przepuszczalność jako model ex vivo . Co więcej, eksplant pozwala również na bezpośrednie badanie i wizualizację różnych metod stosowanych obecnie w celu zwiększenia przepuszczalności RWM, takich jak mikropęcherzyki ultradźwiękowe18 i chemicznie indukowana modulacja połączeniowa19. Przyszłe badania nad specyficznymi mechanizmami endocytozy związanymi z dostarczaniem leków również skorzystają z tego modelu laboratoryjnego.

Pojawiły się nowe klasy terapii w leczeniu odbiorczego ubytku słuchu. Przełożenie tych środków terapeutycznych na populacje kliniczne jest ograniczone przez bezpieczne i skuteczne drogi transportu do ucha wewnętrznego. Obecne metody dostarczania in vivo w badaniach na zwierzętach opierają się albo na fenestracji do ucha wewnętrznego, albo na dyfuzji przez błonę okrągłego okienka (RWM), barierę niekostną, która oddziela przestrzeń ucha środkowego od ślimaka1.
Chirurgiczne fenestracja i mikroiniekcja do ucha wewnętrznego są zarówno inwazyjne, jak i mogą stanowić zagrożenie dla resztkowej funkcji ucha wewnętrznego2. W związku z tym RWM jest ważną drogą lokalnego dostarczania leków, a świnki morskie są podstawowym przedklinicznym modelem zwierzęcym wykorzystywanym do badania lokalnej farmakokinetyki leków w RWM i w uchu wewnętrznym w celu opracowania farmaceutycznego3,4. Chociaż cieńszy niż ludzki RWM, świnka morska RWM ma identyczną trójwarstwową strukturę. Ma około 1 mm średnicy, 15-25 μm grubości i składa się z dwóch warstw komórek nabłonka umieszczonych w warstwie tkanki łącznej5. Warstwa nabłonkowa skierowana w stronę ucha środkowego jest gęsto upakowana i połączona ścisłymi połączeniami, podczas gdy warstwa skierowana w stronę ucha wewnętrznego i błony bębenkowej scala ma luźniejszą architekturę i nie ma znaczących zrostów międzykomórkowych.
Obecne badania przedkliniczne badające przepuszczalność leków u świnki morskiej RWM polegają na iniekcjach in vivo do ucha środkowego, a następnie pobieraniu próbek płynu perylimfatycznego w uchu wewnętrznym, co nie pozwala na konkretne badanie transportu RWM6,7. Fragmenty eksplantatów RWM były wykorzystywane w badaniach przedklinicznych, ale ze względu na ich kruchość i niewielkie rozmiary, nie nadają się do systematycznych, mikroprzepływowych badań transportu leków i pojazdów wymagających wodoszczelnego uszczelnienia w poprzek RWM2. Inne grupy zastosowały modele in vitro z hodowanymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, aby przybliżyć RWM8,9,10. Jednak większość tych konstruktów skupia się wyłącznie na zewnętrznej warstwie nabłonka i nie oddaje złożoności natywnej architektury tkankowej. Aby uzyskać bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów transportu w RWM, wymagane są ukierunkowane badania ex vivo.
W tym badaniu demonstrujemy eksplantację RWM świnki morskiej z otaczającym ją podparciem kostnym w celu zachowania integralności błony i ilustrujemy ich użycie w eksperymentalnym paradygmacie zaprojektowanym dla konkretnego badania transportu RWM pojazdów dostarczających leki.

<table><tbody><tr><td>Wiertło diamentowe kulkowe 1 mm</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło diamentowe kulowe 2 mm</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło diamentowe kulkowe 6 mm</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>Będzie działał każdy system wiercenia do cięcia kości</td></tr><tr><td>Igła BD Eclipse 27 G x 1/2 cala z odłączaną strzykawką BD Luer-Lok o pojemności 1 ml</td><td>Becton, Dickinson i spółka&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>Dowolna igła 27-28 G</td></tr><tr><td>Gorilla Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Skuteczne i minimalnie inwazyjne dostarczanie leków do ucha wewnętrznego jest poważnym wyzwaniem. Błona okienka okrągłego (RWM), będąca jednym z niewielu punktów wejścia do ucha wewnętrznego, stała się istotnym przedmiotem badań. Jednak ze względu na złożoność izolowania RWM, nasza wiedza na temat jego farmakokinetyki pozostaje ograniczona. RWM składa się z trzech odrębnych warstw: nabłonka zewnętrznego, środkowej warstwy tkanki łącznej i wewnętrznej warstwy nabłonka, z których każda może mieć unikalne właściwości dostarczania.
Obecne modele do badania transportu przez RWM wykorzystują modele zwierzęce in vivo lub modele RWM ex vivo, które opierają się na hodowlach komórkowych lub fragmentach błony. Świnki morskie służą jako zwalidowany model przedkliniczny do badania farmakokinetyki leków w uchu wewnętrznym i są ważnym modelem zwierzęcym dla rozwoju translacyjnego nośników do ślimaka. W tym badaniu opisujemy podejście do eksplantacji RWM świnki morskiej z otaczającą kością ślimakową do eksperymentów z podawaniem leków na zewnątrz. Metoda ta pozwala na zachowanie natywnej architektury RWM i może zapewnić bardziej realistyczne odwzorowanie barier transportowych niż obecne modele laboratoryjne.

Jak pokazano na Rysunku 3A, metoda ta umożliwia eksplantację nienaruszonej błony okna owalnego świnki morskiej wraz z otaczającym ją pierścieniem twardej kości. Błona okna owalnego powinna być w pełni połączona z kostnym pierścieniem w całym obwodzie. Nie powinno być widocznych żadnych złamań kości ślimaka. W porównaniu z ludzkimi preparatami okna owalnego, błona okna owalnego świnki morskiej nie posiada nakładającej się pseudobłony. Ponadto, w przeciwieństwie do ludzi, między ramionami strzemiączka świnki morskiej znajduje się mostek kostny, który wymaga złamania i usunięcia przed ekstrakcją nadbudowy strzemiączka. Analiza histologiczna (Rysunek 3B) reprezentatywnej błony okna owalnego wykazuje wyraźną trójwarstwową strukturę nabłonkową z przylegającą, nienaruszoną niszą okna owalnego.
Z perspektywy technicznej istnieją dwa krytyczne kroki. Po pierwsze, podczas wykonywania kochektomii w kroku 2.7, ważne jest użycie równika wiertła, a nie jego końcówki, do wykonania nacięcia, ponieważ drgania końcówki wiertła mogą prowadzić do traumatycznych złamań w obrębie ślimaka, które mogą sięgać błony okna owalnego. Po drugie, ważne jest całkowite wywiercenie kanału słuchowego wewnętrznego, ponieważ pozwala to na pełne usunięcie nerwu ślimakowego i łatwiejszą dyssekcję kostnej lamele spiralnej, co skutkuje powstaniem jednolitej jamy po stronie wewnątrzślimakowej do pobierania próbek eksperymentalnych (Rysunek 2C).
Po pomyślnym wyizolowaniu RWM, nasza grupa wykorzystała zmodyfikowaną komorę Ussinga do oceny właściwości farmakokinetycznych błony. Zmodyfikowana komora Ussinga została zwalidowana przez inne grupy w badaniach nad błoną bębenkową i błoną okrągłego okna, a także tkanką siatkówki, w celu oceny właściwości transportowych błon nabłonkowych14,15. To urządzenie wydrukowane w technologii 3D zostało wykonane z materiału Poly-Jet Vero i składa się z dwóch trójkątnych elementów podstawy, z których każdy posiada komorę z cieczą o pojemności 400 µL (Rycina 3). Kostny brzeg RWM zostaje przymocowany do podstawy za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej (Gorilla, patrz Tabela materiałów), a następnie uszczelniony silikonem (patrz Tabela materiałów) w celu zapewnienia wodoszczelności (Rycina 4). Zachowana jest szczególna ostrożność, aby żywica lub uszczelniacz nie miały kontaktu z błoną. Po umieszczeniu RWM pomiędzy podstawami, są one sklejone ze sobą żywicą epoksydową. Podczas eksperymentów transportowych komora załadowania (od strony ucha środkowego) jest wypełniana roztworem soli fosforanowej (PBS) zawierającym nośnik (lub dowolną badaną cząsteczkę), a komora pobierania próbek (od strony scala tympani) jest wypełniana samym PBS. W regularnych odstępach czasu ciecz z komory pobierania jest całkowicie aspirowana i zastępowana świeżym roztworem PBS.
Podczas każdego eksperymentu stosuje się środki kontroli jakości, aby upewnić się, że uszczelnienie wokół próbki wewnątrz aparatury jest wodoszczelne, a membrana w pełni nienaruszona i pozbawiona mikroperforacji. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu brązowego roztworu nanocząsteczek z rdzeniem żelaznym. Ilościowa weryfikacja wodoszczelności uszczelnienia jest przeprowadzana poprzez aspirację pełnej objętości komory próbkowania w każdym odstępie czasu próbkowania; wyciek cieczy z komory próbkowania spowodowałby odessanie objętości mniejszej niż pełna objętość aspiracji. Po zakończeniu każdego eksperymentu objętość cieczy w komorze załadowczej również powinna pozostać bez zmian. Ponadto, ze względu na brązowy kolor cieczy docelowej, ewentualny wyciek jest łatwo widoczny.
Aby upewnić się, że w błonie nie występują żadne nieszczelności, zastosowano kilka podejść. Po pierwsze, wszystkie preparaty RWM wykorzystane w niniejszym badaniu zostały wyekstrahowane natychmiast, a obrazy z mikroskopii świetlnej, konfokalnej i elektronowej potwierdziły nienaruszone struktury komórkowe i błonowe, pozbawione mikroperforacji (Rysunek 3A,B). Po drugie, w podgrupie preparatów RWM celowo wykonano mikroperforacje, aby porównać ich wpływ na dostarczanie nanocząstek. Wizualna inspekcja aspiratu z komory pobierania i komory ładowania służy jako dalsze potwierdzenie integralności preparatu oraz szczelnego mocowania. W przypadku RWM z perforacjami następuje szybkie wyrównanie stężeń w komorze ładowania i pobierania, co można zaobserwować poprzez wyraźną zmianę koloru (Rysunek uzupełniający 1). Dodatkowo stwierdzono, że transport w mikroperforowanych RWM był wyższy niż maksymalna wariancja obserwowana w nienaruszonych błonach (Rysunek uzupełniający 2). Wspólnie metody te służą jako mechanizmy kontroli jakości w celu weryfikacji szczelności uszczelnienia wokół preparatu, a także samego RWM.
<img alt="Schemat anatomiczny kości skroniowej, z zaznaczoną bąblem bębenkowym i przewodem słuchowym zewnętrznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Obraz przedoperacyjny kości skroniowej świnki morskiej. Na tym obrazie przedoperacyjnym kości skroniowej świnki morskiej przedstawiono bąbel bębenkowy, przewód słuchowy zewnętrzny oraz kanał nerwu twarzowego (*). Pasek skali = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zdyseksektowane kości ślimaka i podstawy czaszki z opisami, przedstawiające szczegóły anatomii słuchowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy śródoperacyjne. Obrazy śródoperacyjne demonstrujące relację między błoną okna owalnego a obręczkiem (*) ślimakiem (**), strzemiączkiem (†) i zdekompresowanym kanałem słuchowym wewnętrznym (‡). Zacieniowane obszary wskazują części preparatu, które zostaną usunięte. (A) Jama ucha środkowego świnki morskiej po usunięciu błony bębenkowej i nerwu twarzowego (krok 2.3). (B) Jama ucha środkowego po dekompresji kanału mięśnia napinacza błony bębenkowej (krok 2.6). (C) Widok podstawowy błony okna owalnego (RWM) po cochleostomii i usunięciu zawartości ucha wewnętrznego (krok 2.11). (D) Widok błony okna owalnego (RWM) po usunięciu strzemiączka i identyfikacji przedsionka (krok 2.13). Pasek skali = A,B (1 cm); C,D (5 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Próbka i przekrój tkanki histologicznej pod mikroskopem; badanie i analiza histologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Końcowy preparat RWM i histologia. (A) Preparat makroskopowy RWM świnki morskiej z kostnym pierścieniem. Pasek skali = 1 cm. (B) Histologia wyeksplantowanej błony owalnej świnki morskiej wykazuje nienaruszoną strukturę trójwarstwową. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Schemat ucha środkowego i modele drukowane w 3D dla konfiguracji badań słuchowych i analizy eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Urządzenie mikroprzepływowe do eksperymentów transportu przezbłonowego. (A) Schemat urządzenia mikroprzepływowego użytego do eksperymentów transportu przezbłonowego. (B,C) Wydrukowane urządzenie mikroprzepływowe do eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Zawartość komory załadowczej i komory próbkowania w trakcie 5-godzinnego eksperymentu dostarczania nanocząstek z rdzeniem żelaznym. (A) Komora załadowcza nienaruszonej błony RWM wykazuje stopniowy spadek intensywności koloru wraz ze spadkiem stężenia nanocząstek. (B) Komora próbkowania nienaruszonej błony RWM wykazuje stabilne zabarwienie w czasie, co jest zgodne z niskim poziomem dostarczania nanocząstek. (C) Komora załadowcza perforowanej błony RWM wykazuje szybki spadek intensywności koloru w miarę wyrównywania się zawartości z komorą próbkowania. (D) Komora próbkowania perforowanej błony RWM wykazuje stopniowy wzrost intensywności koloru w czasie, co jest zgodne z wysokim poziomem dostarczania nanocząstek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Reprezentatywne wyniki transportu dla dostarczania nanocząsteczek. Reprezentatywne wyniki transportu dla dostarczania nanocząsteczek (rdzeń Fe3O4 z powłoką z glikolu polietylenowego, średni promień 77 nm) przez błony RWM świnki morskiej, zarówno nienaruszone, jak i z perforacjami (średnia ± SD, n ≥ 3 eksperymentów z RWM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół przedstawia metodę eksplantacji okrągłej błony okiennej z kości skroniowych świnki morskiej, stanowiąc cenne źródło do badań ex vivo.

Eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Nasza grupa bada leki i środki dostarczania leków do leczenia chorób ucha wewnętrznego, takich jak utrata słuchu. Membrana z okrągłym okienkiem jest krytyczną barierą, która zapobiega przedostawaniu się leków stosowanych lokalnie do ślimaka, a obecnie pracujemy nad zrozumieniem, w jaki sposób można zaprojektować pojazdy dostarczające nanocząsteczki, aby przechodziły przez tę barierę. Zrozumienie, w jaki sposób działa błona okrągłego okienka pod względem transportu leków, ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych strategii dostarczania leków do ucha.Świnka morska jest ważnym przedklinicznym modelem zwierzęcym do badania dostarczania leków do ucha. Jednak wyizolowanie tej delikatnej błony, która ma grubość zaledwie 17 mikronów, do badań nad transportem leków, pozostaje poważnym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy metodę ekstrakcji okrągłej membrany okiennej świnki morskiej, która pozwala na efektywne badania laboratoryjne nad transportem leków.Obecne badania nad dostarczaniem leków do ucha wewnętrznego opierają się głównie na modelach eksperymentalnych in vivo, a następnie na próbkowaniu perylimfy, które nie pozwalają na specyficzne i ukierunkowane badanie mechanizmów transportu błony okienkowej. W tym badaniu pokazujemy ekstrakcję okrągłej błony okiennej świnki morskiej z otaczającym ją podparciem kostnym. Metoda ta zachowuje integralność natywnej architektury tkankowej i pozwala na precyzyjne i ukierunkowane badania dostarczania leku przez błonę okrągłego okna.Na początek weź kość skroniową pobraną z czaszki prawidłowo poddanej eutanazji świnki morskiej i usuń nadmiar tkanki miękkiej. Następnie, za pomocą sześciomilimetrowego wiertła diamentowego, wywierć brzuszne aspekty pęcherza skroniowego, odsłaniając obwodowo przestrzeń ucha środkowego i zewnętrzny przewód słuchowy. Za pomocą rongeurs delikatnie usuń zewnętrzny przewód słuchowy i pierścień bębenkowy.Równocześnie oddzielając staw inkubowo-calłkowy. Za pomocą kleszczy oddziel staw wklęsłowy i usuń kowadełko, aby zidentyfikować kostną niszę okrągłego okna. Następnie użyj sześciomilimetrowego wiertła diamentowego, aby wywiercić blaszkę kostną, łącząc ślimak z przyśrodkową ścianą jamy bębenkowej, w kierunku kanału tensora błony bębenkowej.Ostrożnie odbarcz kanał kostny napinacza błony bębenkowej i za pomocą kleszczy usuń mięsień napinacza błony bębenkowej. Następnie wywierć blaszkę kostną łączącą ślimak z dolną ścianą jamy bębenkowej, aż pozostanie jeden milimetr kostnej półki przylegającej do ślimaka. Za pomocą dwumilimetrowego wiertła diamentowego wykonaj ślimakotomię u podstawy ślimaka, pozostawiając około dwóch milimetrów kości do okrągłego okna.Kontynuuj cochleostomię niżej w płaszczyźnie równoległej do okrągłej błony okiennej, aby oddzielić podstawę od wierzchołka ślimaka. Przedłuż ślimakotomię przeciąć podstawę czaszki, która jest znacznie gęstsza, co daje widok przekrojowy podstawnego zwoju ślimaka. Zbadaj próbkę od strony podstawy czaszki i zidentyfikuj wewnętrzny przewód słuchowy.Wywierć do otworu ślimakowego. Za pomocą igły o rozmiarze 28 usuń nerw ślimakowy. Zbadaj próbkę od strony wewnątrzgałkowej.Za pomocą igły lub kleszczy o rozmiarze 28 zidentyfikuj i usuń spiralną blaszkę kostną w zwoju bazylii i pozostały modiolus. Obficie przepłukać zunifikowaną jamę przedsionkową błony bębenkowej, skalarnej, aby usunąć zanieczyszczenia. Zbadaj próbkę od strony ucha środkowego, wywierć boczny kanał półkolisty i kanał twarzowy do poziomu okienka owalnego.Delikatnie usuń strzemiączko za pomocą igły o rozmiarze 28, odsłaniając owalną niszę okienną. Za pomocą jednomilimetrowego wiertła diamentowego otwórz przedsionek dalej, przedłużając owalne okno wzdłuż powierzchni okrągłego okna. Dbając o utrzymanie od jednego do dwóch milimetrów kości ślimakowej, przylegającej do okrągłej niszy okiennej.Uzupełnij nacięcia kości skroniowej, łącząc nacięcia okienka owalnego z nacięciami ektomijnymi po obu stronach okrągłego okienka. Wywierć ostatnie przyczepy do kości podstawy czaszki przylegającej do wewnętrznego kanału słuchowego i delikatnie ogol, aby uzyskać wyciętą okrągłą próbkę błony okiennej. Metoda ta doprowadziła do wyjaśnienia nienaruszonej okrągłej błony okiennej świnki morskiej z otaczającym ją pierścieniem sztywnej kości.Analiza histologiczna próbki wykazała wyraźną trójwarstwową strukturę nabłonka z przylegającą nienaruszoną okrągłą niszą okienną.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie pokazano, jak chirurgicznie zamknąć przewód endolimfatyczny świnki morskiej w celu wywołania wodniczki błony bębenkowej.

Chirurgiczna indukcja wodniaka błędnika poprzez obliterację kanału endolimfatycznego

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na ekstrakcji tkanek oskrzelików z pobranego płuca świni. Tkanka oskrzelików ex vivo może zostać wykorzystana do opracowania modeli infekcji do badania przewlekłych infekcji płuc.

Ekstrakcja tkanki oskrzelowej świni: procedura polegająca na wypreparowaniu skrawków tkanki oskrzelikowej z płuc świń

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Artykuł ten demonstruje podejście zewnątrztwardówkowe polegające na zniszczeniu endolymfatycznego worka świnki morskiej i uszkodzeniu przewodu endolimfatycznego drobnym wykończkiem, aby wywołać eksperymentalne hydropsy endolimfatyczne.

Zrewidowane podejście chirurgiczne indukujące hydrops endolymfatyczny u świnki morskiej

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Implantacja podsiatkówkowa pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) jest jednym z najbardziej obiecujących podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak wyniki badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych z dużymi oczami pozostają wyzwaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono wytyczne dotyczące podsiatkówkowego przeszczepiania RPE na nośniku komórkowym do świnek miniaturowych.

Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej

Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest idealnym markerem do oceny funkcji nerek. Jednak standardowa metoda pomiaru polegająca na wstrzykiwaniu inuliny z seryjną analizą krwi i moczu jest niepraktyczna. W artykule przedstawiono praktyczną metodę transdermalnego pomiaru GFR u prosiąt.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u prosiąt wentylowanych mechanicznie

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metodę eksplantacji membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo. Technika ta zachowuje integralność tkanek i umożliwia precyzyjne badania transportu leków do ucha wewnętrznego.

Eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo

Przeglądaj więcej filmów