Eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo
23 lutego 2024
Ten protokół przedstawia metodę eksplantacji okrągłej błony okiennej z kości skroniowych świnki morskiej, stanowiąc cenne źródło do badań ex vivo.
Nasza grupa bada leki i środki dostarczania leków do leczenia chorób ucha wewnętrznego, takich jak utrata słuchu. Membrana z okrągłym okienkiem jest krytyczną barierą, która zapobiega przedostawaniu się leków stosowanych lokalnie do ślimaka, a obecnie pracujemy nad zrozumieniem, w jaki sposób można zaprojektować pojazdy dostarczające nanocząsteczki, aby przechodziły przez tę barierę. Zrozumienie, w jaki sposób działa błona okrągłego okienka pod względem transportu leków, ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych strategii dostarczania leków do ucha.
Świnka morska jest ważnym przedklinicznym modelem zwierzęcym do badania dostarczania leków do ucha. Jednak wyizolowanie tej delikatnej błony, która ma grubość zaledwie 17 mikronów, do badań nad transportem leków, pozostaje poważnym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy metodę ekstrakcji okrągłej membrany okiennej świnki morskiej, która pozwala na efektywne badania laboratoryjne nad transportem leków.
Obecne badania nad dostarczaniem leków do ucha wewnętrznego opierają się głównie na modelach eksperymentalnych in vivo, a następnie na próbkowaniu perylimfy, które nie pozwalają na specyficzne i ukierunkowane badanie mechanizmów transportu błony okienkowej. W tym badaniu pokazujemy ekstrakcję okrągłej błony okiennej świnki morskiej z otaczającym ją podparciem kostnym. Metoda ta zachowuje integralność natywnej architektury tkankowej i pozwala na precyzyjne i ukierunkowane badania dostarczania leku przez błonę okrągłego okna.
Na początek weź kość skroniową pobraną z czaszki prawidłowo poddanej eutanazji świnki morskiej i usuń nadmiar tkanki miękkiej. Następnie, za pomocą sześciomilimetrowego wiertła diamentowego, wywierć brzuszne aspekty pęcherza skroniowego, odsłaniając obwodowo przestrzeń ucha środkowego i zewnętrzny przewód słuchowy. Za pomocą rongeurs delikatnie usuń zewnętrzny przewód słuchowy i pierścień bębenkowy.
Równocześnie oddzielając staw inkubowo-calłkowy. Za pomocą kleszczy oddziel staw wklęsłowy i usuń kowadełko, aby zidentyfikować kostną niszę okrągłego okna. Następnie użyj sześciomilimetrowego wiertła diamentowego, aby wywiercić blaszkę kostną, łącząc ślimak z przyśrodkową ścianą jamy bębenkowej, w kierunku kanału tensora błony bębenkowej.
Ostrożnie odbarcz kanał kostny napinacza błony bębenkowej i za pomocą kleszczy usuń mięsień napinacza błony bębenkowej. Następnie wywierć blaszkę kostną łączącą ślimak z dolną ścianą jamy bębenkowej, aż pozostanie jeden milimetr kostnej półki przylegającej do ślimaka. Za pomocą dwumilimetrowego wiertła diamentowego wykonaj ślimakotomię u podstawy ślimaka, pozostawiając około dwóch milimetrów kości do okrągłego okna.
Kontynuuj cochleostomię niżej w płaszczyźnie równoległej do okrągłej błony okiennej, aby oddzielić podstawę od wierzchołka ślimaka. Przedłuż ślimakotomię przeciąć podstawę czaszki, która jest znacznie gęstsza, co daje widok przekrojowy podstawnego zwoju ślimaka. Zbadaj próbkę od strony podstawy czaszki i zidentyfikuj wewnętrzny przewód słuchowy.
Wywierć do otworu ślimakowego. Za pomocą igły o rozmiarze 28 usuń nerw ślimakowy. Zbadaj próbkę od strony wewnątrzgałkowej.
Za pomocą igły lub kleszczy o rozmiarze 28 zidentyfikuj i usuń spiralną blaszkę kostną w zwoju bazylii i pozostały modiolus. Obficie przepłukać zunifikowaną jamę przedsionkową błony bębenkowej, skalarnej, aby usunąć zanieczyszczenia. Zbadaj próbkę od strony ucha środkowego, wywierć boczny kanał półkolisty i kanał twarzowy do poziomu okienka owalnego.
Delikatnie usuń strzemiączko za pomocą igły o rozmiarze 28, odsłaniając owalną niszę okienną. Za pomocą jednomilimetrowego wiertła diamentowego otwórz przedsionek dalej, przedłużając owalne okno wzdłuż powierzchni okrągłego okna. Dbając o utrzymanie od jednego do dwóch milimetrów kości ślimakowej, przylegającej do okrągłej niszy okiennej.
Uzupełnij nacięcia kości skroniowej, łącząc nacięcia okienka owalnego z nacięciami ektomijnymi po obu stronach okrągłego okienka. Wywierć ostatnie przyczepy do kości podstawy czaszki przylegającej do wewnętrznego kanału słuchowego i delikatnie ogol, aby uzyskać wyciętą okrągłą próbkę błony okiennej. Metoda ta doprowadziła do wyjaśnienia nienaruszonej okrągłej błony okiennej świnki morskiej z otaczającym ją pierścieniem sztywnej kości.
Analiza histologiczna próbki wykazała wyraźną trójwarstwową strukturę nabłonka z przylegającą nienaruszoną okrągłą niszą okienną.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy ekstrakcji błony okna owalnego z kości skroniowych świnki morskiej, co jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów transportu leków w badaniach nad uchem wewnętrznym. Protokół ten umożliwia prowadzenie badań ex vivo w celu opracowania skutecznych strategii dostarczania leków w leczeniu niedosłuchu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Choroby ucha wewnętrznego
- Mechanizmy dostarczania leków
- Modele przedkliniczne
Wstęp
- Znaczenie błony okna okrągłego w transporcie leków
- Wyzwania związane z izolacją tej delikatnej błony na potrzeby badań
- Świnia morska jako organizm modelowy w badaniach nad uchem wewnętrznym
Zastosowane metody
- Eksplantacja błony okna owalnego z kości skroniowych
- Świnka morska
- Techniki chirurgiczne precyzyjnej izolacji
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja błony z zachowaniem jej integralności strukturalnej
- Zapewnienie metody do badań nad ukierunkowanym transportem leków
- Analiza histologiczna potwierdziła nienaruszoną strukturę nabłonka
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę izolacji błony okna owalnego, która ma kluczowe znaczenie dla badań nad dostarczaniem leków.
- Niniejszy protokół poszerza wiedzę na temat transportu leków w uchu wewnętrznym, wspomagając opracowywanie strategii leczenia ubytków słuchu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne dostarczanie leków do ucha wewnętrznego pozostaje głównym wyzwaniem translacyjnym, przy czym błona okna owalne (RWM) stanowi krytyczną barierę biologiczną. Niniejszy protokół eksplantacji umożliwia badania ex vivo, które zachowują natywną architekturę RWM, wspierając predykcyjną ocenę transportu leków i nanocząsteczek. Metoda ta wzmacnia wczesną walidację celów oraz redukcję ryzyka w strategiach dostarczania substancji do ślimaka w przedklinicznych etapach badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów przenikania leków i nanocząstek przez RWM.
- Wspiera walidację funkcjonalną barier dostarczania w systemie istotnym fizjologicznie.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych prognoz dotyczących potencjalnych nośników dostarczania do struktur ucha wewnętrznego.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Zapewnia powtarzalną platformę ex vivo do ilościowych analiz transportu leków.
- Zachowuje integralność tkanki w celu standaryzowanego porównania sposobów dostarczania.
- Umożliwia skalowalny screening laboratoryjny wydajności formulacji i nośników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z walidowanymi modelami przedklinicznymi w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej w dostarczaniu leków do ślimaka.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój technologii dostarczania w kierunku walidacji in vivo.
- Usprawnia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację zjawisk transportu specyficznych dla RWM.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda eksplantacji łączy wczesny etap odkryć z oceną przedkliniczną, umożliwiając ukierunkowane, ilościowe badania transportu RWM poza ograniczeniami modeli całego organizmu.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez dotyczących przepuszczalności RWM oraz mechanizmu dostarczania.
- Przesiewanie: Potwierdza gotowość analizy do porównawczej oceny nośników leków.
- Analityka: Wspiera ilościowy pomiar transportu przez zachowane warstwy tkankowe.
- Badania translacyjne: Zapewnia spójność z modelami in vivo u świnek morskich w celu późniejszej walidacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę ex vivo do iteracyjnej optymalizacji dostarczania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie strategii dostarczania substancji do ucha wewnętrznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje badania transportu przez błonę okna okrągłego (RWM) w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach badań poprzez wczesne wyjaśnienie barier dostarczania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do dostarczania do ślimaka z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mikrosekcji oraz pracy z kością skroniową.
- Niezbędny jest dostęp do precyzyjnych instrumentów chirurgicznych oraz narzędzi do walidacji histologicznej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania tkanek.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla innych gatunków lub typów błon.
- Kruchość RWM nakłada praktyczne ograniczenia na wydajność i sposób obchodzenia się z próbką.
