Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV
10 listopada 2023
Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.
Ogólnym celem tego testu jest zastosowanie podejścia multipleksowego do jednoczesnego wykrywania powszechnie krążących wirusów układu oddechowego, takich jak SARS-CoV-2, MERS, grypa A i grypa B. Dominujące technologie napędzające postęp w naszej dziedzinie obejmują CRISPR, testy aminowe przepływu bocznego, papierowe czujniki biomolekularne, testy Sherlock w jednym doniczce, aptamery DNA i multipleksowy RT-qPCR zintegrowany z amplifikacją izotermiczną za pośrednictwem pętli, LAMPA. Jednak multipleksowy RT-qPCR jest najbardziej czułym, powszechnym i jest złotym standardem w diagnozowaniu różnych wirusów. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest ustanowienie protokołu, który może być używany do wykrywania kopii RNA już od 10 kopii.
Do testu użyliśmy własnego zestawu RT-qPCR, który jest efektywny czasowo i kosztowo. Na początek przygotuj bufor 2x do RT-qPCR w wodzie wolnej od DNA/RNA Przechowuj bufor w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Następnie wymieszaj startery i sondy w 1,5 mililitrowej probówce.
Uzupełnić objętość buforem elucyjnym, a następnie przechowywać probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotuj mieszankę enzymów z polimerazą taq i MMLV-RT w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie. Uzupełnić objętość buforem do przechowywania polimerazy taq.
Teraz ponownie zawieś wirusowe syntetyczne RNA w oddzielnych probówkach ze 100 mikrolitrami buforu Tris-EDTA, aby uzyskać zapasy od 10 do szóstych kopii RNA na mikrolitr. Aby wymieszać zapasy wirusa, dodaj po pięć mikrolitrów SARS-CoV-2, grypy A i B do 50 mikrolitrów buforu Tris-EDTA. Podobnie wymieszaj SARS-CoV-2 i MERS-CoV, aby uzyskać drugą mieszankę wirusów.
Rozcieńczyć obie mieszaniny dziesięciokrotnie, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 10 kopii RNA na mikrolitr. Do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce odpipetować 2x bufor, starter, enzym, wodę wolną od DNA/RNA i odpowiednie mieszaniny RNA. Uszczelnij płytę za pomocą samoprzylepnej uszczelki płytowej.
Następnie odwiruj płytkę przez jedną minutę, aby zebrać płyn na dnie studzienki. Następnie zaprogramuj maszynę do PCR, aby zaakceptowała szybki 96-dołkowy typ bloku z typem eksperymentalnym ustawionym na krzywą standardową. Ustaw odczynniki na odczynniki TaqMan i wybierz standardowe właściwości uruchamiania.
Zdefiniuj cele genów i barwnik reporterowy. Następnie zdefiniuj nazwy próbek dla każdej badanej reakcji i przypisz cele i próbki do układu płytki. Teraz wprowadź program cyklu do instrumentu.
Przenieś płytkę do maszyny QPCR w czasie rzeczywistym we właściwej orientacji i naciśnij przycisk uruchom, aby rozpocząć cykl. Wybierz lokalizację pliku, aby zapisać dane eksperymentalne. Następnie należy sprawdzić wykresy amplifikacji dostarczone przez program QPCR.
Dwa opracowane zestawy były w stanie z powodzeniem amplifikować wszystkie trzy geny docelowe jednocześnie, przy zaledwie 10 kopiach RNA na reakcję. Skuteczność amplifikacji dla wszystkich miareczkowania wirusa wynosiła ponad 99%
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia opracowanie dwóch zestawów do jednokrokowego RT-qPCR opartych na sondach, zaprojektowanych do jednoczesnego wykrywania pospolitych wirusów układu oddechowego, w tym SARS-CoV-2, MERS oraz różnych szczepów grypy. Zestawy te zwiększają możliwości diagnostyczne wyspecjalizowanych laboratoriów dzięki zastosowaniu kosztowo i czasowo efektywnego podejścia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Wykrywanie wirusów układu oddechowego
- Technika RT-qPCR
- Opracowywanie testów multipleksowych
Wprowadzenie
- Konieczność szybkiej i czułej diagnostyki wirusów oddechowych.
- Ograniczenia obecnych technologii detekcji.
- Znaczenie podejścia multipleksowego w celu jednoczesnej detekcji.
Zastosowane metody
- Zestawy RT-qPCR opracowane wewnętrznie
- Wykrywanie viralnego RNA
- Multiplexowy RT-qPCR z zastosowaniem specyficznych sond
Główne wyniki
- Pomyślnie wykryto SARS-CoV-2 oraz MERS wraz z grypą typu A i B.
- Osiągnięto amplifikację przy liczbie kopii RNA tak niskiej jak 10 na reakcję.
- Wykazano wysoką wydajność amplifikacji powyżej 99% dla genów docelowych.
Wnioski
- Opracowane zestawy RT-qPCR są skuteczne w wielokrotnej detekcji wirusów oddechowych.
- Niniejsze badanie przyczynia się do opracowania lepszych strategii diagnostycznych w badaniach nad wirusologią.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multiplexowe testy RT-qPCR w czasie rzeczywistym dla SARS-CoV-2, grypy A/B oraz MERS-CoV odpowiadają na krytyczną potrzebę szybkiego, czułego i specyficznego wykrywania współkrążących wirusów oddechowych w badaniach podstawowych i translacyjnych. Testy te umożliwiają wysoką pewność różnicowania celów wirusowych, co wspiera rzetelną walidację celów i zmniejsza niejednoznaczność na wczesnych etapach opracowywania diagnostyki. Ich integracja zwiększa pewność prognostyczną oraz efektywność operacyjną w ramach portfeli B+R skoncentrowanych na zagrożeniach związanych z chorobami zakaźnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę celów wirusowych w celu walidacji funkcjonalnej w modelach chorób układu oddechowego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie blisko spokrewnionych patogenów wirusowych w złożonych próbkach.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w wyborze i segregacji celów dla programów diagnostycznych i terapeutycznych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy testów multipleksowych do późniejszego przesiewania związków przeciwwirusowych lub do diagnostyki.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe wyniki do benchmarkingu i optymalizacji testów.
- Umożliwia skalowalną gotowość do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu szybkiej oceny potencjalnych interwencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych, umożliwiając jednoczesne wykrywanie wielu wirusów oddechowych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, zapewniając solidną, ilościową detekcję wirusową.
- Zmniejsza ryzyko przy wdrażaniu kandydatów poprzez zapewnienie dokładnej identyfikacji patogenów w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analizy multiplex RT-qPCR wpisują się w kontinuum od odkrywania leku do badań przedklinicznych, wspierając wczesne testowanie hipotez, opracowywanie analiz oraz badania translacyjne w ramach portfeli chorób zakaźnych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia wysoką czułość detekcji w celu walidacji celów wirusowych opartych na hipotezach.
- Przesiewy: Oferuje powtarzalne, ilościowe wyniki służące do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza solidne dane dotyczące amplifikacji oraz wskaźniki specyficzności do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości między fazami badań.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę do multipleksowej detekcji wirusów w różnorodnych środowiskach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w detekcji wirusów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów diagnostycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego i dokładnego różnicowania patogenów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób zakaźnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu wirologii molekularnej oraz projektowania testów ilościowego PCR.
- Wymaga dostępu do aparatury do PCR w czasie rzeczywistym oraz infrastruktury oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie konfiguracji testów, interpretacji danych i kontroli jakości.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów próbek lub nowych wariantów wirusowych.
- Wydajność zależy od specyficzności starterów/sond oraz jakości RNA w materiale źródłowym.
