Name: Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę ciągłego obrazowania liści ziemniaka w celu badania inicjacji śmierci komórki. Protokół umożliwia precyzyjne określenie czasu powstawania zmian chorobowych w odpowiedzi nadwrażliwej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Barbarze Jaklič za pomoc techniczną. Badania te były wspierane finansowo przez Słoweńską Agencję ds. Badań i Innowacji (podstawowe finansowanie badań nr P4-0165 oraz projekt Z4-3217: Deciphering redox-related signaling interconnectedness in potato resistance against viruses).

UWAGA: Sekcje 1 i 2 opisują zmodyfikowany protokół przygotowania materiału roślinnego oparty na metodach opisanych przez Lukan et al.7. W szczególności dokonano pewnych modyfikacji kontrolowanych warunków środowiskowych i preparatu inokulum.
1. Uprawa ziemniaków
<ol>
	<li>Uprawiaj zdrowe ziemniaki cv. Rośliny Rywal w kulturze tkankowej węzła łodygi8.</li>
	<li>Po 6-8 tygodniach wytnij dziesięć eksplantatów o długości 1 cm zawierających węzły z roślin ziemniaka na sterylnym papierze w sterylnych warunkach za pomocą sterylnej pęsety i noża skalpela.</li>
	<li>Przenieś je do plastikowych pudełek z pożywką Murashige i Skoog (MS30) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych (22 °C w świetle i 19 °C w ciemności przy promieniowaniu 250 μE lub μmol/m2/s i 16-godzinnym fotoperiodze, przy wilgotności względnej 55% ± 5%).</li>
	<li>Przenieś je do gleby 2 tygodnie po mikrorozmnażaniu.
	<ol>
		<li>Napełnij doniczki (r = 10 cm) ziemią. Palcem utwórz otwór o głębokości 3-4 cm w glebie na środku doniczki, napełnij otwór wodą i poczekaj, aż się wchłonie.</li>
		<li>Umieść jedną roślinę na doniczkę w dołku, pozostawiając liście nad powierzchnią. Delikatnie przykryj korzenie ziemią (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Niektóre rośliny mogą nie mieć korzeni. Należy wykluczyć te rośliny z analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawiaj rośliny w glebie w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach środowiskowych (22 °C w świetle i 19 °C w ciemności, przy wilgotności względnej 55% ± 5%, przy promieniowaniu 250 μmol/m2/s i 16-godzinnym fotoperiodzie).</li>
	<li>Po 3-4 tygodniach rośliny są gotowe. Użyj tych roślin do zaszczepienia. 
	UWAGA: Rośliny powinny mieć co najmniej 3-4 w pełni rozwinięte liście z widocznymi listkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Powinny wyglądać zdrowo, bez widocznych objawów (żółte lub brązowe liście), które można pomylić ze zmianami wywołanymi przez PVY. Aby osiągnąć porównywalne wyniki, rośliny powinny być inokulowane w tym samym czasie (np. o 9 rano) we wszystkich eksperymentach, aby uniknąć możliwego wpływu rytmu okołodobowego na odpowiedź immunologiczną roślin i tworzenie się zmian chorobowych9,10,11.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum i inokulacja ziemniaków
<ol>
	<li>Zaszczepić roślinę szczepem PVY N-Wilga (PVYN-Wi; nr akcesyjny. EF558545) Inokulum zgodnie z poniższymi informacjami. 
	UWAGA: Więcej roślin można zaszczepić równolegle, jeśli dostępny jest więcej niż jeden mikroskop cyfrowy. Rośliny powinny mieć co najmniej trzy w pełni rozwinięte liście przed inokulacją (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). PVYN-Wi jest rozmnażany i utrzymywany w ziemniaku odmiany Pentland.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor fosforanowy, uzupełniony dietylotitiokarbaminianem sodu (DIECA), do inokulacji: Wymieszać 1,3 ml 0,2 M NaH2PO4, 8,7 ml 0,2 M Na2HPO4 i 0,225 g DIECA. Uzupełnić objętość do 100 ml za pomocą ddH20. Doprowadzić pH do 7,6, dodając 1 M roztwór NaOH lub 1 M HCl.</li>
		<li>Zebrać 6-8 tygodniowe ziemniaki zakażone PVYN-Wi odmiany Pentland z hodowli tkankowych w workach ekstrakcyjnych z siatką filtracyjną (0,5 g na 6 roślin) i dodać bufor fosforanowy uzupełniony DIECA (4x masa materiału roślinnego, stosunek masy do objętości). Użyj homogenizatora ręcznego przez 1-2 minuty, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
		<li>Pierwsze trzy dolne, w pełni rozwinięte liście 3-4 tygodniowych roślin ziemniaka (od kroku 1.6) lekko oprószyć proszkiem karborundowym. 
		UWAGA: Dostosuj ilość proszku karborundowego. Zbyt duża ilość może spowodować szkody, podczas gdy zbyt mała może skutkować nieskuteczną infekcją. Optymalnie stosuje się 0,1 mg/cm proszku karborundowego, co daje około 1,5 mg proszku na liść średniej wielkości (około 15cm2).</li>
		<li>Delikatnie natrzyj liście inokulum (~100 μL na liść). Po 10 minutach dokładnie umyj liście wodą z kranu.
		<ol>
			<li>Uważaj, aby nie uszkodzić liści. Nie należy przekraczać czasu inkubacji. Dostosuj ilość inokulum w zależności od wielkości liścia - 6,5 μL/cm, co daje około 100 μL na liść średniej wielkości (około 15 cm2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieś rośliny do komory wzrostowej i hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych (28 °C w świetle i 28 °C w ciemności przy wilgotności względnej 55% ± 5%, przy promieniowaniu 250 μmol/m2/s i 16 godzinnym fotoperiodze) przez 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie roślin i użycie mikroskopu cyfrowego do rejestrowania rozwoju zmian
<ol>
	<li>Przenieść zaszczepione rośliny z komory wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 28 °C do komory wzrostowej w temperaturze 22 °C 3 dni po inokulacji, w innych warunkach opisanych w kroku 1.5.</li>
	<li>Wybierz roślinę do obserwacji. Unieruchomić drugi zaszczepiony liść za pomocą taśmy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1D). Upewnij się, że żądany liść jest całkowicie unieruchomiony przed rozpoczęciem obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Zainstaluj aplikację do przechwytywania obrazu na laptopie. Podłącz mikroskop cyfrowy do komputera. Otwórz oprogramowanie. 
	UWAGA: Upewnij się, że roślina, mikroskop cyfrowy i laptop są umieszczone na półce w pobliżu gniazdka, aby podłączyć komputer. Decyzja o wyborze liści, które mają być monitorowane, może zależeć od badanego zagadnienia biologicznego, np. rodzaju procesu, który prowadzi do powstania ograniczonej zaprogramowanej śmierci komórki.</li>
	<li>Ustaw mikroskop nad unieruchomionym skrzydłem. Ustaw ostrość za pomocą pokrętła na mikroskopie cyfrowym (pokazanym na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że linia wzroku jest jak najszersza, aby zwiększyć szanse na uchwycenie powstawania zmiany, ale nadal wystarczająco powiększona, aby dostrzec wygląd zmiany (zazwyczaj stosuje się powiększenie 25x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj ustawienia aparatu. Kliknij przycisk Ustawienia w prawym górnym rogu obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, zakreślony część 1) i dostosuj ustawienia kamery: Jasność (60-70), Kontrast (10-15), Odcień (0), Balans bieli, Nasycenie (45-50), Ostrość (0), Gamma (5) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Ustawienia użyte w tym badaniu były następujące: Jasność (64), Kontrast (14), Odcień (0 ), Nasycenie (47), Ostrość (0), Gamma (5). 
	UWAGA: Ustawienia aparatu należy dostosować do światła zewnętrznego, aby zapewnić najlepszą jakość obrazu. Ustawienia można dostosować do warunków użytkownika w komorze wzrostowej.</li>
	<li>Ustaw ustawienia przechwytywania obrazu, klikając ikonę przechwytywania obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, zakreślony część 2). Kliknij na przycisk Time-Lapsed Video i ustaw Image Capture co 15 minut przez 24 godziny (Rysunek 2C). 
	UWAGA: Interwał między wykonanymi zdjęciami i czas trwania obrazowania są w pełni elastyczne i można je dostosować do potrzeb eksperymentu. W czasie pomiędzy wykonaniem obrazu dioda LED jest wyłączana. Dioda LED jest automatycznie włączana podczas robienia zdjęć.</li>
	<li>Rozpocznij przechwytywanie obrazu, klikając przycisk START (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Po przeniesieniu z temperatury 28 °C do 22 °C rośliny powinny zacząć rozwijać zmiany chorobowe w ciągu 24 godzin. Jeśli nie, może to być oznaką nieskutecznego szczepienia. Dostosuj ilość proszku karborundowego, upewnij się, że czas inkubacji inokulum na liściach był prawidłowy i określ obfitość wirusa w inokulum za pomocą qPCR.</li>
	<li>Aby zapisać obrazy, zaznacz wszystkie obrazy i kliknij ikonę Zapisz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B, zakreślona część 3). Ustaw opcje eksportu. Ustaw DPI na maksimum (300) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Po zapisaniu usuń wszystkie zdjęcia w programie.</li>
	<li>Do analizy obrazu wystarczy dowolny program do przeglądania/edycji obrazu. Korzystanie z bezpłatnego oprogramowania do edycji obrazów, ImageJ, wyjaśniono poniżej.
	<ol>
		<li>Zaimportuj sekwencję czasową obrazów z pojedynczego pola widzenia (w lewym górnym rogu kliknij Plik, wybierz Importuj, a następnie Sekwencja obrazów). Wklej ścieżkę do katalogu z zapisanymi zdjęciami i naciśnij przycisk OK, aby rozpocząć konwersję.</li>
		<li>Po konwersji oprogramowanie automatycznie otwiera wewnętrzny odtwarzacz wideo, pokazując końcowy film. Wyeksportuj plik wideo, klikając opcję Plik > Zapisz jako i wybierając Format AVI. Otwiera się małe okienko. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 0.3 kl./s i naciśnij OK, aby zapisać wideo jako plik wideo AVI. 
		UWAGA: Czas rozwoju zmiany można również określić, ręcznie sprawdzając wszystkie obrazy i znajdując obraz, na którym pojawia się zmiana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantifying Cell Death Initiation Through Continuous Imaging

<ol><li>Karasev, A. V., Gray, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+emerging+challenges+of+potato+virus+y+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).</li>
<li>Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+Y%3A+A+major+crop+pathogen+that+has+provided+major+insights+into+the+evolution+of+viral+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).</li>
<li>Szajko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+gene+Ny-1+on+potato+chromosome+IX+confers+hypersensitive+resistance+to+Potato+virus+Y+and+is+an+alternative+to+Ry+genes+in+potato+breeding+for+PVY+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance.</a> Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).</li>
<li>Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ny-1+and+Ny-2+genes+conferring+hypersensitive+response+to+potato+virus+Y+%28PVY%29+in+cultivated+potatoes%3A+Mapping+and+marker-assisted+selection+validation+for+PVY+resistance+in+potato+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding.</a> Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).</li>
<li>Lukan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+is+not+sufficient+for+the+restriction+of+potato+virus+Y+spread+in+hypersensitive+response-conferred+resistance+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).</li>
<li>Baebler, Š, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+an+indispensable+component+of+the+Ny-1+resistance-gene-mediated+response+against+Potato+virus+y+infection+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato.</a> Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).</li>
<li>Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virus+spread+around+the+cell+death+zone+at+spatiotemporal+resolution+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).</li>
<li>Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+in+vitro+culture+techniques+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Fruit%2C+Vegetable+and+Cereal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potato in vitro culture techniques and biotechnology.</a> Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator).</a> Nature. 470, 110-115 (2011).</li>
<li>Roden, L. C., Ingle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+rhythms%2C+infection%3A+The+role+of+light+and+the+circadian+clock+in+determining+the+outcome+of+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions.</a> Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).</li>
<li>Srivastava, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+circadian+rhythm+in+plant+system%3A+An+update+from+development+to+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response.</a> Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).</li>
<li>Mulaosmanovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+detection+and+quantification+of+lesions+on+leaf+scale+based+on+trypan+blue+staining+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis.</a> Plant Methods. 16, 62(2020).</li>
<li>Martinelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+plant+disease+detection.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of plant disease detection. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).</li>
<li>Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+of+detecting+plant+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Rowarth, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+reveals+potential+regulators+of+programmed+cell+death+and+leaf+remodelling+in+lace+plant+%28Aponogeton+madagascariensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis).</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Zademonstrowany protokół pozwala użytkownikowi na dokładne określenie wskaźnika inicjacji śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Mimo że istnieje wiele sposobów monitorowania zmian chorobowych i występowania chorób roślin 12,13,14,15, protokół ten ma tę zaletę, że pomiar jest niezależny od światła bez zakłócania rytmu dobowego rośliny, ponieważ światło jest wyłączane między pomiarami.
Po zaszczepieniu rośliny powinny rosnąć w temperaturze 28 °C przez 3 dni. Gen oporności Ny-1 , który indukuje reakcję nadwrażliwości, jest zależny od temperatury, a u roślin uprawianych w wyższych temperaturach prowadzi do poronienia oporności, co objawia się brakiem tworzenia zmian chorobowych i ogólnoustrojowym rozprzestrzenianiem się wirusa3. Po przeniesieniu roślin do temperatury 22 °C inicjowana jest śmierć komórki, dlatego w celu uzyskania dokładnych wyników obserwację za pomocą mikroskopu cyfrowego należy rozpocząć jak najszybciej po tym przeniesieniu. Kolejnym kluczowym krokiem w przygotowaniu rośliny do obrazowania jest unieruchomienie liścia (ryc. 1D), ponieważ roślina będzie nadal rosła podczas obrazowania, co może spowodować przesunięcie obserwowanego liścia poza ostrość lub takie ustawienie nie przyniesie pożądanych rezultatów.
Jeśli opisany protokół jest stosowany na roślinach transgenicznych ze zmienionymi składnikami będącymi przedmiotem zainteresowania, co do których przypuszczalnie bierze się udział w inicjacji śmierci komórki, protokół umożliwia użytkownikowi określenie, czy obniżony poziom badanego składnika wpływa na szybkość inicjacji śmierci komórki. W ten sposób składniki zaangażowane w inicjację śmierci komórki można zidentyfikować w patosystemach, w których zachodzi zaprogramowana śmierć komórki, przy użyciu tego protokołu. Innymi metodami identyfikacji tych składników są na przykład analiza transkryptomiczna, taka jak sekwencja RNA lub różne formy mikroskopii, które mogą być kosztowne i czasochłonne16. Metoda opisana w tym protokole pozwala na łatwą i niedrogą identyfikację składników zaangażowanych w inicjację śmierci komórki poprzez obserwację różnic w wskaźnikach inicjacji śmierci komórki między roślinami transgenicznymi i kontrolnymi. Optymalnie, w takiej konfiguracji, należy użyć dwóch kamer cyfrowych, ponieważ roślina transgeniczna powinna być analizowana równolegle z rośliną kontrolną w ramach tego samego eksperymentu.
W tym protokole zastosowano szczep PVY N-Wilga; jednak inne szczepy tego wirusa, na przykład PVY oznaczone GFP (PVY-N605(123)-GFP)7, mogą być również stosowane. Co więcej, inne patosystemy, które powodują rozwój programowanej śmierci komórki, mogą być badane przy użyciu tego protokołu z niewielkimi modyfikacjami.

Ziemniak jest jedną z najczęściej uprawianych roślin spożywczych na świecie, na czwartym miejscu za ryżem, pszenicą i kukurydzą. Jednak na produkcję ziemniaków może mieć poważny wpływ wirus ziemniaka Y (PVY), który jest obecnie uważany za jego najważniejszy patogen wirusowy1,2. W roślinach ziemniaka odmiany cv. Przeciwnie, kilka szczepów PVY (w tym szczep PVY N-Wilga) wyzwala oporność wynikającą z odpowiedzi nadwrażliwości (HR), gdzie ograniczenie patogenu do miejsca infekcji objawia się zmianami nekrotycznymi na zaszczepionych liściach3. W tym patosystemie HR jest pośredniczony przez gen oporności na Ny-1, który jest zależny od temperatury, ponieważ rośliny uprawiane w niższych temperaturach skutecznie rozwijają zmiany nekrotyczne, podczas gdy u roślin uprawianych konstytutywnie w podwyższonej (28 °C) temperaturze poronienia oporności wykazuje się brakiem tworzenia zmian chorobowych i ogólnoustrojowym rozprzestrzenianiem się wirusa3,4. Po przeniesieniu roślin do niższej temperatury (22 °C) inicjowana jest śmierć komórki, którą można wykorzystać do śledzenia tempa inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki.
Ten protokół demonstruje prostą metodę określania szybkości inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Dzięki obrazowaniu zaszczepionych liści po przeniesieniu rośliny z 28 °C do 22 °C, mikroskop cyfrowy umożliwia ciągłą obserwację liścia w żądanych odstępach czasu. W przeciwieństwie do stosowania innych metod (na przykład mikroskopii konfokalnej lub obserwacji powstawania zmian gołym okiem), pozwala to na określenie dokładnego czasu powstawania zmiany, a tym samym szybkości inicjacji śmierci komórki z dokładnością do minut, a nie godzin w wyżej wymienionych metodach5,6. Korzystanie z mikroskopu cyfrowego jest również niezależne od światła i dlatego może być używane zarówno w dzień, jak i w nocy. Protokół ten może być również wykorzystany do identyfikacji składników zaangażowanych w inicjację śmierci komórki lub do określenia wpływu różnych składników na wskaźnik inicjacji śmierci komórki, jeśli używane rośliny są transgeniczne i mają zmienione poziomy składników będących przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Palnik alkoholowy</td><td>Mikro+Polo</td><td>SH-234002455</td><td>Do sterylizacji pęsetą i skalpelem</td></tr><tr><td>Autoklaw A-21 CAV</td><td>Kambi<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65824/65824eq01.jpg" style="margines: auto; "></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Proszek karborundowy</td><td>VWR Chemicals</td><td>22505297</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 </td><td>Oprogramowanie Dino-Lite</td><td>Version 2.0</td><td>do mikroskopu cyfrowego</td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy Dino-Lite Edge AM7915MZTL</td><td>AnMo Electronics Corporation</td><td>AM7915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70%</td><td>Stella Tech</td><td>P94000</td><td>Do sterylizacji pęsetą i skalpelem</td></tr><tr><td>Worki ekstrakcyjne</td><td>Bioreba</td><td>420100</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa FS-WI</td><td>Photon Systems Insturments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>ręczny Bioreba</td><td>400010</td><td></td></tr><tr><td>Hawita Special Substrate</td><td>HAWITA Gruppe</td><td>2000000071701</td><td>Gotowe do użycia podłoże, wykonane z torfu (H4-H6 i H6-H8)</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Merck</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Taśma etykietowa</td><td>Sigma</td><td>L8144-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Laptop z zainstalowanym DinoCapture 2.0 </td><td>Komputer HP</td><td>Z2V77EA#BED</td><td>musi być przenośny, ponieważ eksperyment bierze udział w komorze wzrostu</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M02220100</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Emsure</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Emsure</td><td>1064700250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta  0,5 ml</td><td></td><td></td> pH-metr marki 21500209 <td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>ML1601</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka plastikowe </td><td>Cvetlice Dornig</td><td>VCG10,5</td><td>Promień = 10,5 cm</td></tr><tr><td>Doniczki plastikowe </td><td>Współpracownicy laboratorium</td><td>DIS40003</td><td>Promień = 11,5 cm (góra), Promień = 9,8 cm (dół)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Kemika d.d.</td><td></td><td></td>1800408</tr><tr><td>Dietyloditiokarbaminian sodu (DIECA)</td><td>Sigma-Aldeich</td><td>228680</td><td>Dityloditiokarbaminian sodu trójwodny, odczynnik ACS</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza chirurgiczne</td><td></td><td>Pęseta Braun</td> 4511733633 <td></td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>BD033R</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Odporność na nadwrażliwość (HR) jest skuteczną reakcją obronną, która może być określona przez geny odporności N. HR objawia się tworzeniem stref śmierci komórek na zaszczepionych liściach. W tym artykule przedstawiono protokół badania szybkości inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Mikroskop cyfrowy umożliwia ciągły proces obrazowania w żądanych odstępach czasu, co pozwala na dokładne określenie szybkości inicjacji śmierci komórki z dokładnością do kilku minut, w przeciwieństwie do godzin w przypadku tradycyjnych metod. Obrazowanie za pomocą mikroskopu cyfrowego jest również niezależne od światła, dzięki czemu może być stosowane w dzień i w nocy bez zakłócania rytmu dobowego rośliny. Różne patosystemy powodujące rozwój programowanej śmierci komórki mogą być badane przy użyciu tego protokołu z niewielkimi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, protokół umożliwia prostą, dokładną i niedrogą identyfikację wskaźnika inicjacji śmierci komórki.

Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół badania inicjacji śmierci komórek poprzez powstawanie zmian chorobowych u ziemniaka cv. Rywal z wykorzystaniem mikroskopu cyfrowego. Pozwala to na określenie dokładnego czasu rozpoczęcia programowanej śmierci komórek.
Rośliny, które rozwinęły korzenie, przeniesiono do gleby 2 tygodnie po mikrorozmnażaniu ziemniaka cv. Rywal (Rycina 1A,B). Po 3-4 tygodniach wzrostu w opisanych warunkach, do dalszych analiz wykorzystano rośliny posiadające co najmniej 3-4 w pełni rozwinięte liście z widocznymi listkami, które wyglądały na zdrowe i nie wykazywały oznak opadania (Rycina 1C). Przy użyciu mikroskopu cyfrowego, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, obserwowano ten sam obszar na inokulowanym liściu w odstępach 15-minutowych, określając moment wystąpienia oraz tempo powiększania się zmiany chorobowej w czasie (Rycina 3). Zmiana chorobowa pojawiła się po 15 h 30 min (Rycina 3).
<img alt="Etapy wzrostu rośliny; układ do mikrorozmnażania (A), sadzonka w doniczce (B), pomiar wzrostu (C), obserwacja łodygi (D), analiza mikroskopowa (E)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie rośliny do analizy za pomocą mikroskopu cyfrowego. (A) Plastikowe pudełko z pożywką MS 30 i eksplantami rośliny ziemniaka cv. Rywal zawierającymi węzły. (B) Roślina ziemniaka cv. Rywal w glebie (2 tygodnie po mikrorozmnażaniu). (C) Roślina ziemniaka cv. Rywal gotowa do inokulacji (4 tygodnie po przesadzeniu do gleby), posiadająca co najmniej trzy w pełni rozwinięte liście. (D) Drugi inokulowany liść (strzałka) rośliny ziemniaka cv. Rywal, ustawiony i unieruchomiony (strzałka) za pomocą taśmy. (E) Roślina ustawiona pod mikroskopem cyfrowym; strzałka wskazuje pokrętło służące do ustawiania ostrości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja analizy mikroskopowej z regulacją kamery, siatką obrazu, ustawieniami rejestracji oraz opcjami eksportu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Ustawienia oprogramowania cyfrowego do rejestrowania rozwoju zmian chorobowych. (A) Interfejs oprogramowania – okręgiem czerwonym zaznaczono opcje przycisku dla (1) kamera ustawienia, (2) obraz utrwalenie ustawieniaoraz (3) zapisywanie obrazy. (B) Okno z ustawieniami kamery, które otwiera się po kliknięciu w (1) w panelu A. Jasność, Kontrast, Nasycenie, Ostrośći Gamma powinny zostać odpowiednio dostosowane. (C) Okno z ustawieniami przechwytywania obrazu, które otwiera się po kliknięciu elementu (2) wskazanego na panelu A. (D) Okno z ustawieniami zapisywania obrazów, które otwiera się po kliknięciu elementu (3) wskazanego na panelu A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Powierzchnia liścia pod mikroskopem; postęp uszkodzeń w 4 etapach oznaczonych A-D czerwonymi strzałkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Tworzenie się zmian na zaszczepionym liściu obserwowane pod mikroskopem cyfrowym. Obrazy środkowej części liścia ziemniaka zaszczepionego PVY przy powiększeniu 23,6x obserwowane pod mikroskopem cyfrowym, wykonane w odstępach 5 min. Zaszczepione rośliny przetrzymywano w temperaturze 28 °C przez 3 dni, a trzeciego dnia o godzinie 7:00 rozpoczęto obserwacje mikroskopem cyfrowym w temperaturze 22 °C. (A) O godzinie 21:02 zmiana nie jest jeszcze widoczna, (B) 90 min później, o 22:32, zmiana jest widoczna. (C) Ekspansję zmiany zaobserwowano o 01:02 oraz (D) o 07:32 następnego ranka. Eksperyment powtórzono dwukrotnie, a zmiany wystąpiły odpowiednio 8 h 15 min oraz 12 h po zainicjowaniu śmierci komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

Ukryta oporność na nadwrażliwość jest skuteczną reakcją obronną determinowaną przez geny oporności na N. Przejawia się to w tworzeniu stref śmierci komórek na zaszczepionych windach. Badamy tempo inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liftów w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki.Opracowaliśmy prostą metodę określania wskaźników inicjacji śmierci komórki w różnych planowanych patosystemach HR, która nie jest czasochłonna, nie jest kosztowna i jest łatwa w użyciu. Nasz protokół umożliwia ciągłą obserwację liści w intelektach pożądania, co oznacza, że możemy określić dokładny czas powstawania zmiany, a tym samym szybkość wysyłania tej inicjacji z dokładnością do kilku minut, a nie godzin w przypadku innych metod. Jeśli opisują, protokół jest stosowany na roślinach transgenicznych z innymi składnikami będącymi przedmiotem zainteresowania, przypuszczalnie zaangażowanymi w inicjację śmierci komórki.Protokół umożliwia użytkownikowi określenie, czy obniżony poziom badanego składnika wpływa na szybkość inicjacji śmierci komórki. Dzięki temu można zidentyfikować składniki biorące udział w inicjacji śmierci komórki. Zacznij od rozmnażania zdrowych roślin ziemniaka i probówek zawierających pożywki do hodowli tkanek węzłów macierzystych.Po sześciu do ośmiu tygodniach użyj sterylnej pęsety i skalpela, aby wyciąć dziesięć jednocentymetrowych roślin X zawierających węzły. Przenieś X roślin do plastikowych pudełek zawierających podłoże Murashige i Skoog. I hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych w komorze wzrostowej.Po dwóch tygodniach napełnij kilka doniczek ziemią, aby przygotować się do przeniesienia roślin. Użyj palca, aby stworzyć głęboki na trzy do czterech centymetrów otwór w ziemi na środku doniczki. Teraz wlej wodę do otworu i pozwól jej wchłonąć się w glebę.Następnie umieść każdą roślinę w dołku, upewniając się, że liście pozostają nad powierzchnią. Ostrożnie przykryj korzenie ziemią. Uprawiaj te rośliny w komorze wzrostowej w kontrolowanym środowisku.W ciągu trzech do czterech tygodni rośliny są gotowe do zaszczepienia. Na początek użyj worków ekstrakcyjnych z siatką filtrującą, aby zebrać sześcio- do ośmiotygodniowych roślin ziemniaka zakażonych wirusem ziemniaka. Dodać cztery mililitry buforu fosforanowego uzupełnionego DIECA na każdy gram tkanki.Następnie homogenizuj rośliny za pomocą homogenizatora ręcznego przez jedną do dwóch minut. Następnie delikatnie pokryj pierwsze trzy w pełni rozwinięte liście zdrowych roślin ziemniaka w wieku od trzech do czterech tygodni proszkiem karborundowym, delikatnie przetrzyj liście przygotowanym inokulum wirusowym. Po 10 minutach spłucz liście do czysta wodą z kranu.Na koniec przenieś rośliny do komory wzrostowej, aby umożliwić im wzrost w kontrolowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy dni. Aby rozpocząć przenoszenie zakażonych wirusem roślin ziemniaka do komory wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Wybierz roślinę do obserwacji i użyj taśmy klejącej, aby całkowicie unieruchomić drugi zaszczepiony liść.Następnie podłącz mikroskop cyfrowy do komputera i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Umieść liść pod mikroskopem. Następnie użyj pokrętła, aby ustawić ostrość na powierzchni liścia.Aby dostosować ustawienia kamery, kliknij przycisk ustawień. Teraz ustaw jasność na 64, kontrast na 14, a odcień na zero. Następnie dostosuj balans bieli, a następnie ustaw nasycenie na 47, ostrość na zero i gamma na pięć.Kliknij ikonę przechwytywania obrazu i wybierz opcję wideo poklatkowego. Następnie ustaw przechwytywanie obrazu co 15 minut, łącznie przez 24 godziny, naciśnij przycisk start, aby rozpocząć przechwytywanie obrazu. Aby zapisać przechwycone obrazy, zaznacz wszystkie obrazy i kliknij ikonę zapisywania.Teraz wybierz opcje eksportu, a następnie ustaw kropki na cal na maksimum. Po zapisaniu usuń wszystkie obrazy z programu. Aby edytować obrazy, uruchom oprogramowanie do edycji, takie jak Image J.Kliknij plik, a następnie wybierz importuj i wybierz sekwencję obrazów, aby zaimportować sekwencje czasowe obrazów z jednego pola widzenia, wklej ścieżkę do katalogu zapisanych zdjęć i naciśnij OK, aby rozpocząć rozmowę.Po zakończeniu konwersji Image J automatycznie uruchomi wewnętrzny odtwarzacz wideo, wyświetlając gotowy film. Kliknij plik, a następnie zapisz jako i wybierz format AVI, aby wyeksportować plik wideo. Gdy otworzy się małe okno, ustaw liczbę klatek na sekundę na 0,3 kl./s, a następnie naciśnij OK, aby zapisać wideo jako plik AVI.Trzy- lub czterotygodniowe inokulowane rośliny ziemniaka z co najmniej trzema do czterech w pełni rozwiniętymi liśćmi wykorzystano do cyfrowej analizy mikroskopowej. Ten sam obszar na zaszczepionym liściu obserwowano w odstępach 15-minutowych w celu określenia występowania zmiany i rozszerzania się w czasie. Po 14 godzinach obserwacji nie było widać żadnej zmiany.Około 90 minut później zarejestrowano widoczną zmianę. Zmiany zaczęły się rozszerzać dwie godziny później i kontynuowały ekspansję przez następne osiem i pół godziny.

studying-cell-death-initiation-using-a-digital-microscope

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. Tutaj opisujemy jednoetapowy test do oceny głównych trybów indukowanej przez IR klonogennej śmierci komórek w oparciu o morfologię jąder barwionych dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) uwidocznionych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metody charakterystyki pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie, w tym konwencjonalne i konfokalne obrazowanie za pomocą mikroskopii żywych komórek, skaningową mikroskopię elektronową i wiązanie lipidów oparte na NMR.

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania przeżywalności na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowania zmiennych, które znacząco przewidują śmierć komórki.

Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Poznaj metodę ciągłego obrazowania liści ziemniaka w celu badania inicjacji śmierci komórki. Protokół umożliwia precyzyjne określenie czasu powstawania zmian chorobowych w odpowiedzi nadwrażliwej.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Przeglądaj więcej filmów