Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego
10 listopada 2023
Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.
Ukryta oporność na nadwrażliwość jest skuteczną reakcją obronną determinowaną przez geny oporności na N. Przejawia się to w tworzeniu stref śmierci komórek na zaszczepionych windach. Badamy tempo inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liftów w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki.
Opracowaliśmy prostą metodę określania wskaźników inicjacji śmierci komórki w różnych planowanych patosystemach HR, która nie jest czasochłonna, nie jest kosztowna i jest łatwa w użyciu. Nasz protokół umożliwia ciągłą obserwację liści w intelektach pożądania, co oznacza, że możemy określić dokładny czas powstawania zmiany, a tym samym szybkość wysyłania tej inicjacji z dokładnością do kilku minut, a nie godzin w przypadku innych metod. Jeśli opisują, protokół jest stosowany na roślinach transgenicznych z innymi składnikami będącymi przedmiotem zainteresowania, przypuszczalnie zaangażowanymi w inicjację śmierci komórki.
Protokół umożliwia użytkownikowi określenie, czy obniżony poziom badanego składnika wpływa na szybkość inicjacji śmierci komórki. Dzięki temu można zidentyfikować składniki biorące udział w inicjacji śmierci komórki. Zacznij od rozmnażania zdrowych roślin ziemniaka i probówek zawierających pożywki do hodowli tkanek węzłów macierzystych.
Po sześciu do ośmiu tygodniach użyj sterylnej pęsety i skalpela, aby wyciąć dziesięć jednocentymetrowych roślin X zawierających węzły. Przenieś X roślin do plastikowych pudełek zawierających podłoże Murashige i Skoog. I hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych w komorze wzrostowej.
Po dwóch tygodniach napełnij kilka doniczek ziemią, aby przygotować się do przeniesienia roślin. Użyj palca, aby stworzyć głęboki na trzy do czterech centymetrów otwór w ziemi na środku doniczki. Teraz wlej wodę do otworu i pozwól jej wchłonąć się w glebę.
Następnie umieść każdą roślinę w dołku, upewniając się, że liście pozostają nad powierzchnią. Ostrożnie przykryj korzenie ziemią. Uprawiaj te rośliny w komorze wzrostowej w kontrolowanym środowisku.
W ciągu trzech do czterech tygodni rośliny są gotowe do zaszczepienia. Na początek użyj worków ekstrakcyjnych z siatką filtrującą, aby zebrać sześcio- do ośmiotygodniowych roślin ziemniaka zakażonych wirusem ziemniaka. Dodać cztery mililitry buforu fosforanowego uzupełnionego DIECA na każdy gram tkanki.
Następnie homogenizuj rośliny za pomocą homogenizatora ręcznego przez jedną do dwóch minut. Następnie delikatnie pokryj pierwsze trzy w pełni rozwinięte liście zdrowych roślin ziemniaka w wieku od trzech do czterech tygodni proszkiem karborundowym, delikatnie przetrzyj liście przygotowanym inokulum wirusowym. Po 10 minutach spłucz liście do czysta wodą z kranu.
Na koniec przenieś rośliny do komory wzrostowej, aby umożliwić im wzrost w kontrolowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy dni. Aby rozpocząć przenoszenie zakażonych wirusem roślin ziemniaka do komory wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Wybierz roślinę do obserwacji i użyj taśmy klejącej, aby całkowicie unieruchomić drugi zaszczepiony liść.
Następnie podłącz mikroskop cyfrowy do komputera i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Umieść liść pod mikroskopem. Następnie użyj pokrętła, aby ustawić ostrość na powierzchni liścia.
Aby dostosować ustawienia kamery, kliknij przycisk ustawień. Teraz ustaw jasność na 64, kontrast na 14, a odcień na zero. Następnie dostosuj balans bieli, a następnie ustaw nasycenie na 47, ostrość na zero i gamma na pięć.
Kliknij ikonę przechwytywania obrazu i wybierz opcję wideo poklatkowego. Następnie ustaw przechwytywanie obrazu co 15 minut, łącznie przez 24 godziny, naciśnij przycisk start, aby rozpocząć przechwytywanie obrazu. Aby zapisać przechwycone obrazy, zaznacz wszystkie obrazy i kliknij ikonę zapisywania.
Teraz wybierz opcje eksportu, a następnie ustaw kropki na cal na maksimum. Po zapisaniu usuń wszystkie obrazy z programu. Aby edytować obrazy, uruchom oprogramowanie do edycji, takie jak Image J.Kliknij plik, a następnie wybierz importuj i wybierz sekwencję obrazów, aby zaimportować sekwencje czasowe obrazów z jednego pola widzenia, wklej ścieżkę do katalogu zapisanych zdjęć i naciśnij OK, aby rozpocząć rozmowę.
Po zakończeniu konwersji Image J automatycznie uruchomi wewnętrzny odtwarzacz wideo, wyświetlając gotowy film. Kliknij plik, a następnie zapisz jako i wybierz format AVI, aby wyeksportować plik wideo. Gdy otworzy się małe okno, ustaw liczbę klatek na sekundę na 0,3 kl./s, a następnie naciśnij OK, aby zapisać wideo jako plik AVI.
Trzy- lub czterotygodniowe inokulowane rośliny ziemniaka z co najmniej trzema do czterech w pełni rozwiniętymi liśćmi wykorzystano do cyfrowej analizy mikroskopowej. Ten sam obszar na zaszczepionym liściu obserwowano w odstępach 15-minutowych w celu określenia występowania zmiany i rozszerzania się w czasie. Po 14 godzinach obserwacji nie było widać żadnej zmiany.
Około 90 minut później zarejestrowano widoczną zmianę. Zmiany zaczęły się rozszerzać dwie godziny później i kontynuowały ekspansję przez następne osiem i pół godziny.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje tempo inicjacji programowanej śmierci komórek u roślin ziemniaka z wykorzystaniem protokołu ciągłego obrazowania w celu obserwacji zainokulowanych liści. Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie czasu powstawania nekroz, dostarczając informacji na temat dynamiki odpowiedzi nadwrażliwej w kontekście odporności.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Inicjacja śmierci komórki
- Reakcja nadwrażliwości
- Biologia roślin
Wprowadzenie
- Programowana śmierć komórki jest kluczowym mechanizmem obronnym u roślin.
- W badaniu wykorzystano rośliny ziemniaka jako system modelowy.
- Określenie czasu wystąpienia śmierci komórek może zwiększyć zrozumienie odporności roślin.
Zastosowane metody
- Ciągłe obrazowanie zainokulowanych liści
- Wykorzystanie roślin ziemniaka jako modelu biologicznego
- Analiza mikroskopowa w celu obserwacji rozwoju zmian w czasie rzeczywistym
Główne wyniki
- Zmiany chorobowe stały się widoczne około 90 minut po wstępnej inokulacji.
- Rozrastanie się zmian monitorowano przez okres 8,5 godziny.
- Metoda ta umożliwia wysokorozdzielcze rejestrowanie postępu choroby w technice time-lapse.
Wnioski
- Niniejszy protokół pozwala na skuteczne określenie szybkości inicjacji śmierci komórek u roślin ziemniaka.
- Stanowi on cenne narzędzie do dalszych badań nad mechanizmami obronnymi roślin przeciwko patogenom.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna kwantyfikacja inicjacji śmierci komórek w systemach roślinnych umożliwia rzetelną weryfikację hipotez dotyczących genetycznych i molekularnych determinantów reakcji nadwrażliwości. Cyfrowa mikroskopia o wysokiej rozdzielczości zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji komponentów modulujących programowaną śmierć komórek, co bezpośrednio wpływa na wczesne etapy odkryć i walidację celów w biotechnologii roślin. Możliwość ta wspiera decyzje dotyczące portfela badań poprzez umożliwienie szybkiej i powtarzalnej oceny funkcji genów kandydackich w systemach istotnych z punktu widzenia patologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie czynników genetycznych i molekularnych wpływających na inicjację śmierci komórki.
- Wspiera walidację funkcjonalną genów oporności oraz komponentów szlaków sygnałowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie perturbacji genów z efektami fenotypowymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze docelowych kandydatów w procesach opracowywania odporności roślin na choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania dla rozwoju testów.
- Umożliwia powtarzalny pomiar szybkości inicjacji i ekspansji zmian chorobowych.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w różnych patosystemach przy niewielkich modyfikacjach protokołu.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu związków chemicznych lub genetycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Pozwala na dopasowanie odczytów fenotypowych do mechanizmów zaprogramowanej śmierci komórki istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu – od odkryć genetycznych po walidację przedkliniczną w modelach roślinnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój cech odporności lub edycji genów w procesach ulepszania roślin uprawnych.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy niezbędny do opracowania translacyjnych biomarkerów w badaniach nad odpornością roślin.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół mikroskopii cyfrowej integruje się z wczesnym etapem procesu od odkrycia do walidacji, umożliwiając szybką weryfikację hipotez oraz ocenę funkcjonalną genów kandydackich lub metod leczenia w systemach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej dla funkcji genów w inicjacji śmierci komórkowej.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane dotyczące czasu powstawania i rozszerzania się zmian w celu przygotowania testu.
- Analityka: Zapewnia pomiary rozdzielone w czasie w celu porównania warunków genetycznych lub terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z walidacją przedkliniczną w modelach roślinnych istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczny, kosztowo efektywny proces obrazowania, który można dostosować do wielu patosystemów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne wyniki obrazowania.
- Wartość strategiczna: umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację interwencji genetycznych lub molekularnych w badaniach i rozwoju roślin z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu kultur tkanek roślinnych oraz obsługi mikroskopii cyfrowej.
- Wymagany jest dostęp do kontrolowanych komór wzrostowych oraz infrastruktury do obrazowania time-lapse.
- Konieczna jest standaryzacja odstępów czasowych obrazowania i parametrów analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych gatunków roślin i patosystemów przy niewielkich modyfikacjach protokołu.
- Powtarzalność wyników jest zależna od stałych warunków środowiskowych.
