Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D
1 marca 2024
Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.
Uraz ścięgna jest jednym z najczęstszych problemów mięśniowo-szkieletowych w USA, dotykającym około 33 milionów ludzi rocznie. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu podejścia inżynierii komórkowej i tkankowej do naprawy ścięgien, które może drastycznie poprawić wyniki leczenia pacjentów. Obecne technologie wykorzystywane do rozwoju badań nad ścięgnami obejmują wykorzystanie komórek macierzystych z różnych źródeł, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, w połączeniu z wykorzystaniem bioreaktorów, biomateriałów inżynierii genetycznej i innych technik inżynierii tkankowej w celu naśladowania sygnałów środowiskowych potrzebnych dla ścięgien.
Nasza wiedza na temat tego, jak rozwijają się ścięgna od ich początków, jest ograniczona. Istnieje kilka dobrze znanych genów, które ulegają bardzo wysokiej ekspresji podczas dojrzewania ścięgien. Jednak niestety nie są one unikalne dla tkanki ścięgna.
Utrudnia to naukowcom standardową ocenę skutecznego różnicowania ścięgien. Nasz protokół wykorzystuje niezwykły potencjał zmian IPC i to, co wiemy do tej pory na temat rozwoju ścięgien. Naszym celem jest opracowanie allogenicznego źródła komórek do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.
Nasze laboratorium koncentruje się na wyjaśnieniu szlaków związanych z losem komórek ścięgien, aby lepiej zrozumieć rozwój ścięgien. Chcemy wykorzystać tę wiedzę w połączeniu z technologiami inżynierii tkankowej i biomateriałami, aby opracować skuteczniejsze alternatywy dla tradycyjnej naprawy ścięgien. Po autoklawowaniu dwóch płytek silikonowych, w sterylnych warunkach wyjmij płytki z worka autoklawu i umieść je w płytkach o średnicy 150 milimetrów.
Dodaj 400 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej studzienki z silikonowych płytek. Następnie ponownie zawiesić indukowane twardówką mezenchymalne komórki zrębu w pożywce MSC i policzyć żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Obliczyć objętość zawiesiny komórek wymaganą do uzyskania 1,25 razy 10 czwartych komórek na centymetr kwadratowy.
Usuń tę objętość pożywki rozciągliwej MSC z 15-mililitrowej stożkowej rurki i dodaj wymaganą objętość zawiesiny indukowanych mezenchymalnych komórek zrębu z dodatnim wynikiem twardziny. Odwróć probówkę, aby uzyskać jednorodność zawiesiny nowej komórki. Dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki obu płytek silikonowych.
Przykryj z powrotem pokrywką 150-milimetrowe płytki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. W celu uzyskania naprężenia jednoosiowego należy przepłukać aparat rozciągający wodą podwójnie destylowaną, a następnie 70% etanolem. Wytrzyj aparat, umieść go w kapturze do hodowli komórkowych i wystaw na działanie światła ultrafioletowego przez 15 minut.
Następnie umieść jedną płytkę w inkubatorze jako kontrolę statyczną. Umieść drugą osadzoną płytkę silikonową w aparacie do rozciągania, wyrównując z otworami w płytce silikonowej. Następnie umieść pokrywkę na urządzeniu.
Przymocuj aparat z osadzoną silikonową płytką do źródła elektronicznego i umieść go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw program cyklicznego rozciągania na 4% sinusoidalne napięcie w 0,5 herca przez dwie godziny dziennie. Rozpocznij rozciąganie, naciskając przycisk start.
Podczas mechanicznego obciążania mezenchymalnych komórek zrębu wywołanych twardówką, zbyt duża gęstość osadzenia prowadziła do przedwczesnego skurczu komórek i wczesnej śmierci komórek. Po kilku dniach rozciągania zaobserwowano pewien stopień organizacji komórek w grupie rozciągniętych mezenchymalnych komórek zrębu indukowanych twardówką, w porównaniu z losową organizacją komórek w grupie statycznej. Barwienie faloidyną włókien aktonu wykazało, że komórki rosły prostopadle do kierunku rozciągania, w przeciwieństwie do losowej organizacji komórek obserwowanej na płytkach statycznych.
Analiza ekspresji genów wykazała znaczną regulację w górę genów tenogennych zarówno po trzech, jak i siedmiu dniach, w porównaniu z samymi iMSC w dniu zero. Odkładanie się kolagenu w pożywce po siedmiu dniach rozciągania było znacznie wyższe w grupie rozciągniętych mezenchymalnych komórek zrębu indukowanych twardówką w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nowatorskie podejście do naprawy ścięgien z wykorzystaniem mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z iPSC. Metoda ta polega na nadekspresji Scleraxis za pomocą wektora lentiwirusowego oraz zastosowaniu jednokierunkowego rozciągania w bioreaktorze 2D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkanek i komórek
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Biologia ścięgien
Wstęp
- Urazy ścięgien dotykają każdego roku milionów osób w USA.
- Obecne metody leczenia są ograniczone i często nieskuteczne.
- W celu naprawy ścięgien bada się zastosowanie komórek macierzystych i bioreaktorów.
- Zrozumienie rozwoju ścięgien jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
Cel badania
- Opracowanie metody wytwarzania iTenocytów.
- Poprawa wyników leczenia pacjentów poddawanych naprawie ścięgien.
- Zbadanie roli Scleraxis w dojrzewaniu ścięgien.
Zastosowane metody
- Generowanie mezenchymalnych komórek stromy pochodzących z iPSC.
- Nadekspresja Scleraxis przy użyciu wektora lentiwirusowego.
- Zastosowanie rozciągania jednowymiarowego w bioreaktorze 2D.
- Ocena różnicowania i funkcji komórek.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie iTenocytów z komórek pochodzących z iPSC.
- Zwiększona ekspresja genów związanych z więzadłami.
- Poprawiona funkcjonalność komórek pod wpływem stymulacji mechanicznej.
- Potencjał do opracowania lepszych strategii naprawy więzadeł.
Wnioski
- Badanie przedstawia obiecującą metodę inżynierii tkanki ścięgna.
- Nadekspresja Scleraxis jest kluczowa dla poprawy właściwości komórek.
- Rozciąganie mechaniczne w bioreaktorach może poprawić wyniki komórkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Generowanie iTenocytów z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia iPSC poprzez nadekspresję Scleraxis i naprężenie jednowymiarowe rozwiązuje problem skalowalnych, standaryzowanych źródeł komórek do naprawy ścięgien. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną terapii komórkowych poprzez integrację sygnałów genetycznych i mechanicznych, które są kluczowe dla specyfikacji linii ścięgnistej. Metoda ta wspiera rozwój portfolio, umożliwiając tworzenie powtarzalnych, gotowych do użycia produktów komórkowych do zastosowań w regeneracji układu mięśniowo-szkieletowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków różnicowania ścięgien poprzez kontrolowaną nadekspresję Scleraxis.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie mechanistycznej roli bodźców mechanicznych i genetycznych w determinacji losu tenogennego.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze źródeł komórek do portfolio medycyny regeneracyjnej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy pochodne od iMSC do dalszego przesiewu funkcjonalnego i fenotypowego.
- Standaryzuje protokoły różnicowania w celu poprawy powtarzalności i ilościowej oceny markerów ścięgnistych.
- Umożliwia skalowalną produkcję iTenocytów do opracowywania testów i oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność generowania tenocytów in vitro z biologią ścięgna istotną w kontekście chorób, co gwarantuje ciągłość translacyjną.
- Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając odnawialne źródło komórek do przedklinicznych modeli naprawy ścięgien.
- Usprawnia proces ograniczania ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie ekspresji genów i wyników funkcjonalnych z dojrzewaniem ścięgna.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesną weryfikację hipotez, przygotowanie testów analitycznych oraz opracowanie modeli translacyjnych dla strategii naprawy ścięgien.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących różnicowania linii komórkowej ścięgna za pośrednictwem Scleraxis i stymulacji mechanicznej.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla ekspresji markerów ścięgnistych i odkładania kolagenu.
- Analityka: Umożliwia analizę ekspresji genów i odczyty funkcjonalne w celu porównania warunków różnicowania.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z przedklinicznymi modelami naprawy ścięgien przy użyciu zestandaryzowanych populacji iTenocytów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat generowania komórek tenogennych w ramach wielu programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu terapii komórkowej ścięgien.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane, skalowalne i powtarzalne protokoły generowania komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej walidacji źródła komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów medycyny regeneracyjnej ukierunkowanych na naprawę ścięgien, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w hodowli iPSC, transdukcji lentiwirusowej oraz obsłudze bioreaktora.
- Konieczny jest dostęp do cytometrii przepływowej, analizy ekspresji genów oraz aparatury do obciążania mechanicznego.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów charakterystyki i różnicowania komórek pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji dla różnych modeli ścięgien lub systemów specyficznych dla danego gatunku.
- Gęstość komórek oraz parametry obciążenia mechanicznego muszą zostać zoptymalizowane, aby zapobiec przedwczesnemu kurczeniu się lub śmierci komórek.
