Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Poznaj metodę generowania iTenocytów z komórek iPSC poprzez nadekspresję Scleraxis i jednoosiowe rozciąganie w bioreaktorze 2D. Technika ta poprawia różnicowanie komórek i może wspierać skuteczniejszą terapię uszkodzeń ścięgien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez NIH/NIAMS K01AR071512 i CIRM DISC0-14350 dla Dmitriya Sheyna. Dwa plazmidy pakujące lentiwirusa były prezentem od laboratorium Simona Knotta (Wydział Nauk Biomedycznych, Centrum Medyczne Cedars-Sinai).

Harnessing iPSC-Derived iTenocytes for Effective Cell-Based Therapy

<ol><li>Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+tendon+and+ligament+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Current progress in tendon and ligament tissue engineering.</a> Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).</li>
<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiate+into+functional+mesenchymal+stem+cells+and+repair+bone+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).</li>
<li>Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenogenic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+dictated+by+properties+of+braided+submicron+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).</li>
<li>Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tendon-specific+markers+in+various+human+tissues%2C+tenocytes+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells.</a> Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).</li>
<li>Shukunami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleraxis+is+a+transcriptional+activator+that+regulates+the+expression+of+Tenomodulin%2C+a+marker+of+mature+tenocytes+and+ligamentocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).</li>
<li>Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tendon+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tendon cell fate during development.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).</li>
<li>Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tppp3%28%2B%29Pdgfra%28%2B%29+tendon+stem+cell+population+contributes+to+regeneration+and+reveals+a+shared+role+for+PDGF+signalling+in+regeneration+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis.</a> Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).</li>
<li>Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+and+ligament+regeneration+and+repair%3A+clinical+relevance+and+developmental+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+loading+models+for+tendon+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro loading models for tendon mechanobiology.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).</li>
<li>Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cellular+strain+models+of+tendon+biology+and+tenogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).</li>
<li>Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+the+effects+of+the+hierarchical+structure+of+tendon+fascicles+on+micromechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%22%5BJournal%5D)">An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).</li>
<li>Tatullo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influence+of+tissue+culture+plates+and+extracellular+matrix+on+mesenchymal+stem+cell+behavior%3A+A+topical+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Immunopathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).</li>
<li>Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+behavior+using+biophysical+and+biochemical+cues%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).</li>
<li>Papalamprou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+iPSC+differentiation+into+iTenocytes+using+combined+scleraxis+overexpression+and+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).</li>
<li>Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+tendon+reporters%2C+ScxGFP+and+ScxAP%2C+using+regulatory+elements+of+the+scleraxis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-based+product+characterization+for+clinical+trials%3A+an+FDA+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).</li>
<li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal%2Fstem+cells%3A+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+%28IFATS%29+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li>
<li>Dunkman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tendon+injury+response+is+influenced+by+decorin+and+biglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+transcription+factors+in+tendon+development+and+differentiation%3A+their+potential+for+tendon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).</li>
<li>Bloor, A. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+safety+and+efficacy+of+iPSC-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+acute+steroid-resistant+graft+versus+host+disease%3A+a+phase+I%2C+multicenter%2C+open-label%2C+dose-escalation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).</li>
<li>McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compatible+and+xeno-free+cultivation+of+mesenchymal+progenitors+derived+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).</li>
<li>Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).</li>
<li>Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifactorial+bottom-up+bioengineering+approaches+for+the+development+of+living+tissue+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes.</a> FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).</li>
<li>Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell-cell+contact+on+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 98, 184-191 (2016).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+orientation+is+guided+by+strain+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28United+Kingdom%29%22%5BJournal%5D)">Cellular orientation is guided by strain gradients.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).</li>
<li>Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+scleraxis+overexpression+combined+with+cyclic+strain+enhances+ligament+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+scleraxis+synergistically+promote+the+commitment+of+human+ES+cells+derived+MSCs+to+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes.</a> Scientific Reports. 2, 977(2012).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neo-genesis+of+tendon%2Fligament-like+tissue+by+combination+of+mohawk+and+a+three-dimensional+cyclic+mechanical+stretch+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

W tym protokole iTenocyty są generowane w trzech głównych etapach: (1) indukcja iPSC do iMSC, (2) nadekspresja SCX za pomocą wektora lentiwirusowego oraz (3) dojrzewanie komórek poprzez jednoosiowe napięcie 2D.
Przedstawiony protokół różnicowania iPSC na iMSC został wcześniej opisany przez naszą grupę2. Od czasu tej publikacji opracowano wiele protokołów, w tym ustalony protokół stosowania iMSC w badaniach klinicznych 21,22,23, a także dostępne na rynku zestawy różnicujące. Wcześniej badano również przegląd potencjału trójliniowego iMSC2. Chociaż metodologie różnią się, wszystkie protokoły podkreślają potrzebę ekspansji iMSC po różnicowaniu przez kilka pasaży, aby zapewnić stabilną ekspresję markerów powierzchniowych MSC. Na tym etapie zastosowanie proporcji 1:3 przy około 70% konfluencji spowoduje powstanie stosunkowo zlewającej się płytki w ciągu 4-6 dni po pasażowaniu.
Przy wyborze optymalnego miana do transdukcji ważne jest, aby zachować równowagę między żywotnością komórek a wydajnością. Podczas gdy iMSC transdukowane 100% mianem mogą wykazywać najwyższy poziom komórek SCX-GFP dodatnich, warto zauważyć, że komórki te przestały dzielić trzy przejścia po transdukcji (Figura 3C), prawdopodobnie z powodu toksyczności wywołanej DNA. Dlatego zaleca się stosowanie miana mniejszego niż 100%. Przed wysiewem płytek silikonowych zaleca się ponowną ocenę poziomów SCX-GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Jeśli dane wskazują, że wydajność jest poniżej pożądanego progu, zaleca się sortowanie komórekiMSC SCX+ przed wysiewem, szczególnie w przypadku zastosowań in vivo .
Po wysianiu komórekiMSC SCX+ na płytkach silikonowych, należy je inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przyczepienie komórek przed rozciąganiem. Opisana gęstość komórek 1,25 x 104 komórek/cm2 w płytkach silikonowych została zoptymalizowana, aby zapobiec przerostowi monowarstwy, co może przyczyniać się do naprężeń statycznych24. Ponadto badania sugerują, że bezpośredni kontakt między komórkami w zlewających się kulturach w podłożach o różnej sztywności może zmieniać zachowanie komórek 24,25,26. Podczas eksperymentów pilotażowych zaobserwowano pewne widoczne oderwanie komórek od płytek silikonowych, szczególnie w późniejszych punktach czasowych (ryc. 4D). Można to przypisać tworzeniu się arkuszy komórek ECM z powodu nadmiernej konfluencji24. Dlatego krytyczne parametry obejmują gęstość komórek i liczbę napadów rozciągania. W obecnych metodach komórki pobrano w 3. i 7. dniu w celu oceny potencjału tenogennego za pomocą analizy ekspresji genów. Zaleca się jednak, aby komórki były rozciągane w bioreaktorze 2D przez co najmniej trzy dni, a następnie monitorowane są rozciągnięte i statyczne płytki, aby zapobiec przerostowi i oderwaniu komórek.
Po kilku napadach rozciągania można zaobserwować pewien stopień wyrównania i organizacji komórek (ryc. 4C1,E). Jest to zgodne z wieloma badaniami, w których obserwuje się wyrównanie komórek prostopadłe do osi szczepu w odpowiedzi na jednoosiowy szczep in vitro24,27. Dla porównania, płytka statyczna przedstawia stochastyczną organizację komórek (rysunek 4C2,E).
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, tylko kilka badań dotyczyło synergicznego wpływu nadekspresji SCX i mechanicznej stymulacji na różnicowanie MSCs w tenocyty lub więzadła 24,28,29. Gaspar i in. zastosowali podobny system bioreaktorów 2D, jak ten opisany tutaj, ale zastosowali wyższe poziomy całkowitego odkształcenia (10% przy 1 Hz przez 12 godzin / dzień). Co ciekawe, nie byli w stanie wykryć zmian w ekspresji SCX, TNMD i COL1a1 w BM-MSC i ludzkich tenocytach. Można to jednak przypisać szczepom częściej stosowanym w ich badaniu24. Chen i wsp. wykorzystali wektor lentiwirusowy do nadekspresji SCX w hESC-MSC złożonych w wielowarstwowe arkusze. Zastosowali jednoosiowe obciążenie cykliczne (10% odkształcenia przy 1 Hz przez 2 godziny/dzień przez okres do 21 dni) i zaobserwowali regulację w górę COL1a1, COL1a2, COL14 i TNMD, a także zwiększoną depozycję ECM29. Nichols i in. przejściowo transfekowali komórki C3H10T1/2 mysim cDNA Scx o pełnej długości i hodowali komórki w hydrożelach kolagenowych 3D pod jednoosiowym cyklicznym szczepem (1%, 1 Hz, 30 min / dzień przez okres do 14 dni). Podobnie jak nasze ustalenia, ich grupa zaobserwowała podwyższoną ekspresję SCX i COL1A1 w napiętych i nadmiernie eksprymowanych konstruktach, ale nie znalazła żadnej zmiany w ekspresji TNMD w odpowiedzi na cykliczne rozciąganie28.
Dodatkowo intrygujące może być rozważenie nadekspresji innych markerów związanych ze ścięgnami, takich jak MKX. Tsutsumi i in. zbadali łączny efekt nadekspresji MKX w komórkach C3H10T1/2 i poddania ich cyklicznemu mechanicznemu rozciąganiu w systemie 3D. Wykazali znaczną regulację w górę SCX, COL1a1, DCN i COL3a1, wraz z wyrównaniem wiązek włókien kolagenowych i filamentów aktynowych30.
Ważne jest, aby przyznać, że ta metoda generowania iTenocytów ma swoje ograniczenia. Chociaż dostępny na rynku bioreaktor 2D jest korzystny dla prac sprawdzających słuszność koncepcji, jego rozmiar ogranicza wydajność. Jeśli komórki te są potrzebne do testów wysokoprzepustowych lub jako potencjalne źródło komórek w terapiach naprawy ścięgien, należy rozważyć zbadanie systemów zdolnych do realizacji jednoosiowego rozciągania na większą skalę. Co więcej, dalsze badania powinny obejmować ekspansję iTenocytów w celu potwierdzenia stabilnej ekspresji tenogennej, a ocena ich udziału w regeneracji in vivo ma kluczowe znaczenie dla oceny ich potencjału tenogennego.

Aby poradzić sobie ze współczesnymi problemami w naprawie ścięgien i więzadeł, potrzebny jest odpowiedni kandydat na komórkę odpowiedni do terapii komórkowych. Jednym z kierunków badań w inżynierii tkankowej w celu naprawy ścięgien jest badanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-MSC) i komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) jako potencjalnych strategii. Komórki te mają zdolność multipotencjalną, dużą obfitość i potencjał regeneracyjny in vivo. Dodatkowo wykazały zwiększoną zdolność gojenia i lepsze wyniki funkcjonalne w modelach zwierzęcych1. Niemniej jednak komórki te wykazują ograniczone zdolności do samoodnawiania, różnorodność fenotypową, a zwłaszcza ograniczoną zdolność do tworzenia ścięgien. Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi rozwiązanie tych ograniczeń ze względu na swoją niezwykłą zdolność do samoodnawiania się i niezrównane zdolności adaptacyjne do rozwoju. Nasz zespół badawczy i inni osiągnęli pomyślne różnicowanie iPSC w mezenchymalne jednostki podobne do komórek zrębu (iMSC)2,3. W związku z tym iMSC mają potencjał, aby stać się allogenicznym źródłem zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.
Twardówka (SCX) jest czynnikiem transkrypcyjnym niezbędnym do rozwoju ścięgien i jest uważana za najwcześniejszy wykrywalny marker dla zróżnicowanych tenocytów. Dodatkowo SCX aktywuje markery różnicowania ścięgien, w tym między innymi kolagen łańcuchowy typu 1a1 1 (COL1a1), irokez (MKX) i tenomodulinę (TNMD)4,5,6. Inne geny ulegające ekspresji podczas dojrzewania ścięgien obejmują białko promujące polimeryzację tubuliny 3 (TPPP3) i receptor alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRa) 7. Chociaż geny te są niezbędne do rozwoju i dojrzewania ścięgien, niestety nie są unikalne dla tkanki ścięgna i ulegają ekspresji w innych tkankach mięśniowo-szkieletowych, takich jak kości lub chrząstki5,7.
Oprócz ekspresji markerów podczas rozwoju ścięgien, mechanostymulacja jest niezbędnym elementem rozwoju i gojenia ścięgien embrionalnych4,5,6. Ścięgna są mechanofarelacyjne, a ich wzorce wzrostu zmieniają się w odpowiedzi na środowisko. Na poziomie molekularnym sygnały biomechaniczne wpływają na rozwój, dojrzewanie, utrzymanie i gojenie tenocytów8. Do modelowania obciążeń fizjologicznych i sygnałów biomechanicznych wykorzystano różne systemy bioreaktorów. Niektóre z tych systemów modelowych obejmują ładowanie tkanek ex vivo, systemy ładowania komórek 2D wykorzystujące napięcie dwuosiowe lub jednoosiowe oraz systemy 3D wykorzystujące rusztowania i hydrożele9,10. Systemy 2D są korzystne podczas badania wpływu stymulacji mechanicznej na geny specyficzne dla ścięgien lub morfologię komórek w kontekście losu komórki, podczas gdy systemy 3D mogą dokładniej replikować interakcje komórka-ECM9,10.
W systemach ładowania 2D, szczep między komórkami a substratem hodowli jest jednorodny, co oznacza, że obciążenie cytoszkieletu komórek może być w pełni kontrolowane. W porównaniu z obciążeniem dwuosiowym, obciążenie jednoosiowe jest bardziej istotne fizjologicznie, ponieważ tenocyty są głównie poddawane obciążeniu jednoosiowemu z wiązek kolagenu in vivo9. Stwierdzono, że podczas codziennych czynności ścięgna są poddawane jednoosiowemu obciążeniu rozciągającemu do 6% odkształcenia11. W szczególności poprzednie badania wykazały, że obciążenie w fizjologicznych zakresach 4%-5% sprzyja różnicowaniu tenogenicznemu poprzez zachowanie ekspresji markerów związanych ze ścięgnami, takich jak SCX i TNMD, a także zwiększoną produkcję kolagenu9,10. Szczepy powyżej 10% mogą być traumatyczne, ale nie są istotne fizjologicznie12,13.
Tutaj prezentowany jest protokół, który uwzględnia synergiczny efekt mechanicznej i biologicznej stymulacji, która może być niezbędna do generowania tenocytów. W pierwszej kolejności opisano powtarzalną metodę indukcji iPSC do iMSC poprzez krótkotrwałą ekspozycję ciał zarodkowych na czynniki wzrostu, potwierdzone markerami powierzchniowymi MSC za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie szczegółowo opisujemy metodę transdukcji lentiwirusowej w celu zaprojektowania iMSC tak, aby miały stabilną nadekspresję SCX (iMSCSCX+). W celu dalszego dojrzewania komórki, iMSCSCX+ są umieszczane w silikonowych płytkach pokrytych fibronektyną i poddawane zoptymalizowanemu protokołowi jednoosiowego napięcia przy użyciu bioreaktora CellScale MCFX. Potencjał tenogeniczny został potwierdzony poprzez obserwację regulacji w górę wczesnych i późnych markerów ścięgien, a także odkładania kolagenu14. Ta metoda generowania iTenocytów jest dowodem słuszności koncepcji, która może stanowić nieograniczone, gotowe do użycia, allogeniczne źródło do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr>Roztwór<td>antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Thermofisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105</td><td>Ancell</td><td>326-050</td><td></td></tr><tr><td>APC mysz anty-ludzka CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>APC mysz IgG2 K kontrola izotypu</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark płodowa surowica bydlęca</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00959143_m1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3733</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I alfa 1 łańcuch ludzki Podkład Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00164004_m1</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu III alfa 1 łańcuch ludzki Taqman podkład</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka Eagle's (EMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna osocze bydlęce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzka CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty mysie IgG1-PE</td><td>Bio-Rad</td><td>STAR117</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T/17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>iPSC: 83i-cntr-33n1</td><td>Cedry-Synaj iPSC Core Facility</td><td>N/A</td><td>https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/</td></tr> <tr><td>Isotype Control Przeciwciało, mysz IgG2a-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-271</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy</td><td>KnockOut Thermofisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>2503081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>matryca błony podstawnej</td></tr><tr><td>MechanoCulture FX</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td>aparat do rozciągania</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych Thermofisher</td><td></td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mohawk ludzki podkład Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00543190_m1</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Receptor płytkowego czynnika wzrostu Ludzki starter Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00998018_m1</td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hydroksyetylometakrylan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do infekcji/transfekcji Polybrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek&nbsp; Białko TGF-beta 1 ludzki Starter Taqman</td><td>RnD Systems</td><td>240-B</td><td></td></tr><tr><td>Twardówka ludzka Starter Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03054634_g1</td><td></td></tr><tr><td>SCXA (SCX) (NM_00108050514) człowiek oznakowany klon ORF</td><td>OriGene</td><td>RC224305L4</td><td></td></tr><tr><td>Płytki silikonowe</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin C ludzki Podkład Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00370384_m1</td><td></td></tr><tr><td>Tenomodulin ludzki Podkład Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00223332_m1</td><td></td></tr><tr><td>Thrombospondin 4 ludzki Podkład Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00170261_m1</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji, BioT</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>B01-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Thermofisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Polimeryzacja tubuliny promująca białko członek rodziny 3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043892_m1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych itenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2d

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

Dzisiejsze wyzwania związane z naprawą ścięgien i więzadeł wymagają zidentyfikowania odpowiedniego i skutecznego kandydata do terapii opartej na komórkach w celu wspomagania regeneracji ścięgien. Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zostały zbadane jako potencjalna strategia inżynierii tkankowej do naprawy ścięgien. Chociaż są multipotencjalne i mają potencjał regeneracyjny in vivo, mają ograniczoną zdolność do samoodnawiania się i wykazują niejednorodność fenotypową. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą obejść te ograniczenia ze względu na ich wysoką zdolność do samoodnawiania się i niezrównaną plastyczność rozwojową. W rozwoju tenocytów twardówka (Scx) jest kluczowym bezpośrednim molekularnym regulatorem różnicowania ścięgien. Ponadto wykazano, że mechanoregulacja jest centralnym elementem kierującym rozwojem i gojeniem ścięgien embrionalnych. W związku z tym opracowaliśmy protokół opisujący synergiczny efekt biologicznej i mechanicznej stymulacji, który może być niezbędny do generowania tenocytów. Indukowano iPSC tak, aby stały się mezenchymalnymi komórkami zrębu (iMSC) i scharakteryzowano je klasycznymi mezenchymalnymi markerami komórek zrębu za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie, za pomocą wektora lentiwirusowego, iMSC zostały transdukowane do stabilnej nadekspresji SCX (iMSCSCX+). Te komórkiiMSC SCX+ mogą być dalej dojrzewane do iTenocytów poprzez jednoosiowe obciążenie rozciągające przy użyciu bioreaktora 2D. Powstałe komórki scharakteryzowano poprzez obserwację regulacji w górę wczesnych i późnych markerów ścięgien, a także odkładania kolagenu. Ta metoda generowania iTenocytów może być wykorzystana do pomocy naukowcom w opracowaniu potencjalnie nieograniczonego, gotowego do użycia allogenicznego źródła komórek do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.

Różnicowanie ludzkich iPSC w iMSC 
Zgodnie z wcześniejszym opisem, obecny protokół różnicowania iPSC w iMSC obejmuje tworzenie ciałek zarodkowych2. Proces ten trwa około dziesięciu dni w celu indukcji iMSC z iPSC (Rysunek 1A). Zdecydowanie zaleca się jednak co najmniej dwukrotne pasażowanie nowo uzyskanych iMSC. Pomaga to nie tylko wyeliminować konieczność stosowania płytek powlekanych żelatyną, ale także zapewnia stabilną ekspresję markerów MSC. Ilościowe oznaczenie metodą cytometrii przepływowej, przeprowadzone po sześciu pasażach od różnicowania, wykazuje niemal czystą populację komórek z wysoką ekspresją klasycznych markerów powierzchniowych MSC, w tym CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) i CD105 (99,2%)17,18 (Rysunek 1B). Pod względem morfologii iMSC powinny ściśle przypominać MSC z szpiku kostnego, wykazując wydłużony, fibroblastopodobny kształt (Rysunek 1C).
Inżynieria genetyczna iMSC w celu nadekspresji SCX przy użyciu transdukcji lentiwirusowej 
Lentiwirusy otrzymano poprzez transfekcję komórek HEK293T/17 wektorem pLenti-C-mGFP, do którego wstawiono SCXB w celu ekspresji SCX-GFP+, wraz z dwoma plazmidami pakującymi. Transfekcje przeprowadzono metodą BioT15,16, stosując stosunek BioT (µl) do DNA (µg) wynoszący 1,5:1.
Komórki HEK293T/17 wysiano z gęstością 5.3 x 104 komórek/cm2 na 18-24 h przed transfekcją. W momencie transfekcji komórki powinny osiągnąć 80%-95% konfluencji, aby uniknąć niskiej wydajności miana (Rysunek 2B1, lewo). W ciągu 24 h od dodania koktajlu plazmidowego zaobserwowano pewną toksyczność, która osiągnęła szczyt po 48 h (Rysunek 2B2). Ponieważ wektor lentiwirusowy SCX jest sprzężony z GFP, ekspresja GFP powinna być widoczna po 48 h (Rysunek 2B3). Obecność wysokiej toksyczności w połączeniu z ekspresją GFP jest wiarygodnym wskaźnikiem udanej transfekcji. Lentiwirusy pobrano po 48 h i 72 h, a wydajność transdukcji oceniono za pomocą cytometrii przepływowej i analizy ekspresji genów. Bezwzględna intensywność sygnału w komórkach GFP-dodatnich służyła jako wskaźnik integracji SCX i była znacznie wyższa przy wyższych mianach (Rysunek 3A). Wydajność transdukcji, mierzona jako procent komórek SCX-GFP+, wykazała efekt zależny od dawki w oparciu o ładunek lentiwirusowy (Rysunek 3B). Cytometria przepływowa iMSCSCX+ na różnych pasażach wykazała również wysoką stabilność, bez zmian w poziomach ekspresji transgenu lub proporcji komórek transdukowanych (Rysunek 3C). Ponadto po 4 tygodniach regularnej hodowli bez sortowania iMSCSCX+ utrzymywały stabilną nadekspresję SCX (Rysunek 3D). Transdukcja na szeroką skalę została przeprowadzona na podstawie miana, przy użyciu 75% lentiwirusa (Rysunek 2C).
Obciążenie mechaniczne iMSCSCX+ 
Komórki iMSCSCX+ wysiano na odkształcalne płytki silikonowe z gęstością 1,25 x 104 komórek/cm2 (Rycyna 4A,B), aby umożliwić adhezję komórek przed rozpoczęciem protokołu rozciągania. Końcowa gęstość wysiewu została zoptymalizowana w celu zapobiegania nadmiernemu rozrostowi monowarstwy. Warto zauważyć, że zbyt wysoka gęstość wysiewu prowadziła do przedwczesnego skurczu komórek i ich wczesnej śmierci (Rycina 4D). W grupie kontrolnej statycznej komórki wysiano na identyczne płytki, lecz bez poddawania ich rozciąganiu. Komórki iMSCSCX+ poddano rozciąganiu w bioreaktorze 2D przez minimum trzy dni, maksymalnie do siedmiu dni, przy odkształceniu jednowymiarowym 4% i częstotliwości 0,5 Hz przez 2 h dziennie. Ten reżim rozciągania jest zgodny z opisami istotności fizjologicznej9. Po kilku dniach rozciągania można zaobserwować pewien stopień organizacji komórek w porównaniu z grupą statyczną, w której organizacji komórek była przypadkowa (Rycina 4C). Barwienie filamentów aktynowych faloidyną dodatkowo podkreśla, że komórki zdają się rosnąć prostopadle do kierunku rozciągania, w przeciwieństwie do przypadkowej organizacji komórek zaobserwowanej na płytkach statycznych (Rycina 4E). Aby scharakteryzować nowo wygenerowane iTenocyty, komórki pobrano po trzech i siedmiu dniach do analizy ekspresji genów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami14. Analiza ekspresji genów wykazuje, że komórki iMSCSCX+ są mechanoreaktywne, ponieważ stwierdzono znaczną nadekspresję genów tenogennych (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX i TPPP3)5,7,19,20 zarówno w trzecim, jak i siódmym dniu, w porównaniu do samych iMSC w dniu 0 (Rycina 5A). Dodatkowo depozycja kolagenu w medium po 7 dniach rozciągania była znacznie wyższa w grupie rozciąganej iMSCSCX+ w porównaniu ze wszystkimi pozostałymi grupami (Rycina 5B).
<img alt="Proces różnicowania iPSC, obejmujący analizę CD44/CD105/CD90; bioreaktor 2D i ekspansja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat różnicowania iMSC i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Ogólny schemat generowania iTenocytów oraz harmonogram indukcji iMSC. Powielono za zgodą Papalamprou A. et al.14. (B) Ilościowa analiza cytometrii przepływowej wykazuje wysoki odsetek komórek wykazujących klasyczne markery powierzchniowe MSC dla MSC pochodzących z iPSC po 6 pasażach po różnicowaniu. Adaptowano za zgodą Sheyn D. et al.2. (C) Obrazy w kontraście fazowym komórek po różnicowaniu wykazują morfologię przypominającą fibroblasty. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu transfekcji lentiwirusowej z różnicowaniem iPSC w iTenocyty; obraz fluorescencji GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2iMSCSCX+ schemat produkcji. (A) Ogólny schemat transfekcji z użyciem 2nd generowanie wektora lentiwirusowego SCX i transdukcja iMSC. Powielone za zgodą Papalamprou A. i wsp.14. (B1) komórki HEK293T/17 przed dodaniem koktajlu plazmidowego. (B2Komórki HEK293T/17 po 48 h wykazują ekspresję GFP oraz objawy toksyczności.B3Ekspresja GFP, którą można zaobserwować w komórkach HEK293T/17, świadczy o pomyślnej transfekcji.C) wygenerowane iMSCSCX+ komórki (z mianem 75%) wykazują ekspresję SCX-GFP+ w jądrach komórkowych. Paski skali = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza skuteczności edycji genów; wykresy słupkowe, skrzypcowe, cytometria przepływowa; miareczkowanie wektora; fluorescencja GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Określanie wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji genów. Absolutna intensywność komórek GFP-dodatnich została wykorzystana jako wskaźnik integracji SCX przy użyciu cytometrii przepływowej. Miana wektorów zostały zweryfikowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej dla wszystkich komórek w celu oceny MOI lentiwirusa. (A) Absolutna fluorescencja w zależności od miana wirusa. (B) Wydajność transdukcji oceniona jako procent komórek SCX-GFP+. Zaobserwowano efekt zależności dawka-odpowiedź obciążenia lentiwirusowego w wydajności transdukcji, gdy wyniki przepływowe przedstawiono jako procent komórek GFP+. MOI, wielokrotność infekcji (multiplicity of infection), n = 3 niezależne transdukcje. Do porównania mian zastosowano jednoczynnikową analizę ANOVA; dane przedstawiono jako średnia ± SD; *p &lt; 0,05. (C) Cytometria przepływowa iMSCSCX+ po kilku rundach pasażowania wskazuje na brak zmian w poziomie stabilnej ekspresji transgenu oraz brak zmian w proporcji transdukowanych komórek. Należy zauważyć, że iMSC transdukowane mianami 100% przestały się dzielić w P3. (D) iMSC transdukowane wektorem lentiwirusowym SCX-GFP+ (75%, MOI = 2,9 e5 TU/mL) z oceną ekspresji genu SCX po 4 tygodniach regularnej hodowli bez sortowania. Ekspresja SCX była znacząco podwyższona w iMSCSCX+, co wskazuje na stabilną nadekspresję SCX po 4 tygodniach. TU, jednostki transdukcji (transduction units); dane przedstawiono jako średnia ± SD, **p &gt; 0,01. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="iMSC na iTenocyty poprzez bioreaktor 2D. Mikroskopia pokazuje efekty hodowli statycznej/rozciąganej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: iMSCSCX+ zasiane w bioreaktorze 2D poddawane cyklicznemu rozciąganiu. (A) Schemat bioreaktora 2D. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.12. (B) Komórki są najpierw zasiewane na elastycznych płytkach silikonowych i inkubowane w 37 °C, aby umożliwić ich przytwierdzenie przed cyklicznym rozciąganiem w bioreaktorze 2D. (C) iMSCSCX+ były rozciągane w bioreaktorze 2D przez maksymalnie 7 dni. W przypadku kontroli statycznej komórki wysiano na identyczne płytki, ale bez rozciągania. (C1) Płytka kontrolna statyczna po 7 dniach wykazuje stochastyczny układ komórek. (C2) Płytka rozciągana po 7 dniach wykazuje względnie większą organizację komórkową. (D) Trzy przykłady zjawisk, których nie powinno się obserwować. Gdy gęstość zasiewu komórek jest zbyt wysoka lub komórki były rozciągane przez zbyt wiele dni, zaczynają się one odrywać. (D1) Komórki są tylko lekko przerośnięte. Żółte strzałki wskazują początek przedwczesnego skurczu komórek. (D2) Umiarkowany stopień przerostu. Komórki zaczynają odrywać się od płytki. (D3) Silny stopień przerostu. Komórki nie rosną już w monowarstwie i utworzyły struktury 3D. Czarne paski skali = 400 µm. Białe paski skali = 1000 µm. (E) Po 7 dniach rozciągania (lub hodowli w przypadku płytki statycznej) komórki utrwalono przy użyciu faloidyny dla filamentów aktynowych (czerwony) i barwiono kontrastowo DAPI dla jąder (niebieski). Białe paski skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza słupkowa ekspresji genów w komórkach iMSC; SCX, THBS4, BGN, poziomy białek, wykres eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Stymulacja ekspresji genów markerów tenogennych poprzez nadekspresję Scx i jednowymiarowe rozciąganie w bioreaktorze 2D. (A) Komórki iMSCSCX+ poddano rozciąganiu w bioreaktorze 2D przez 7 dni. W grupach kontrolnych (statycznych) komórki wysiano na identyczne płytki, ale bez rozciągania. Analizy ekspresji genów wykazują, że iMSCSCX+ są mechanoodpowiedzialne. ND = brak detekcji. Do porównania ekspresji genów w każdym punkcie czasowym vs. d0 zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA. N = 8/grupa. (B) Depozycja kolagenu po 7 dniach rozciągania w bioreaktorze 2D. Dane przedstawiono jako średnia ± SD; n = 8/grupa; *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to ...

Uraz ścięgna jest jednym z najczęstszych problemów mięśniowo-szkieletowych w USA, dotykającym około 33 milionów ludzi rocznie. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu podejścia inżynierii komórkowej i tkankowej do naprawy ścięgien, które może drastycznie poprawić wyniki leczenia pacjentów. Obecne technologie wykorzystywane do rozwoju badań nad ścięgnami obejmują wykorzystanie komórek macierzystych z różnych źródeł, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, w połączeniu z wykorzystaniem bioreaktorów, biomateriałów inżynierii genetycznej i innych technik inżynierii tkankowej w celu naśladowania sygnałów środowiskowych potrzebnych dla ścięgien.Nasza wiedza na temat tego, jak rozwijają się ścięgna od ich początków, jest ograniczona. Istnieje kilka dobrze znanych genów, które ulegają bardzo wysokiej ekspresji podczas dojrzewania ścięgien. Jednak niestety nie są one unikalne dla tkanki ścięgna.Utrudnia to naukowcom standardową ocenę skutecznego różnicowania ścięgien. Nasz protokół wykorzystuje niezwykły potencjał zmian IPC i to, co wiemy do tej pory na temat rozwoju ścięgien. Naszym celem jest opracowanie allogenicznego źródła komórek do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.Nasze laboratorium koncentruje się na wyjaśnieniu szlaków związanych z losem komórek ścięgien, aby lepiej zrozumieć rozwój ścięgien. Chcemy wykorzystać tę wiedzę w połączeniu z technologiami inżynierii tkankowej i biomateriałami, aby opracować skuteczniejsze alternatywy dla tradycyjnej naprawy ścięgien. Po autoklawowaniu dwóch płytek silikonowych, w sterylnych warunkach wyjmij płytki z worka autoklawu i umieść je w płytkach o średnicy 150 milimetrów.Dodaj 400 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej studzienki z silikonowych płytek. Następnie ponownie zawiesić indukowane twardówką mezenchymalne komórki zrębu w pożywce MSC i policzyć żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Obliczyć objętość zawiesiny komórek wymaganą do uzyskania 1,25 razy 10 czwartych komórek na centymetr kwadratowy.Usuń tę objętość pożywki rozciągliwej MSC z 15-mililitrowej stożkowej rurki i dodaj wymaganą objętość zawiesiny indukowanych mezenchymalnych komórek zrębu z dodatnim wynikiem twardziny. Odwróć probówkę, aby uzyskać jednorodność zawiesiny nowej komórki. Dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki obu płytek silikonowych.Przykryj z powrotem pokrywką 150-milimetrowe płytki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. W celu uzyskania naprężenia jednoosiowego należy przepłukać aparat rozciągający wodą podwójnie destylowaną, a następnie 70% etanolem. Wytrzyj aparat, umieść go w kapturze do hodowli komórkowych i wystaw na działanie światła ultrafioletowego przez 15 minut.Następnie umieść jedną płytkę w inkubatorze jako kontrolę statyczną. Umieść drugą osadzoną płytkę silikonową w aparacie do rozciągania, wyrównując z otworami w płytce silikonowej. Następnie umieść pokrywkę na urządzeniu.Przymocuj aparat z osadzoną silikonową płytką do źródła elektronicznego i umieść go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw program cyklicznego rozciągania na 4% sinusoidalne napięcie w 0,5 herca przez dwie godziny dziennie. Rozpocznij rozciąganie, naciskając przycisk start.Podczas mechanicznego obciążania mezenchymalnych komórek zrębu wywołanych twardówką, zbyt duża gęstość osadzenia prowadziła do przedwczesnego skurczu komórek i wczesnej śmierci komórek. Po kilku dniach rozciągania zaobserwowano pewien stopień organizacji komórek w grupie rozciągniętych mezenchymalnych komórek zrębu indukowanych twardówką, w porównaniu z losową organizacją komórek w grupie statycznej. Barwienie faloidyną włókien aktonu wykazało, że komórki rosły prostopadle do kierunku rozciągania, w przeciwieństwie do losowej organizacji komórek obserwowanej na płytkach statycznych.Analiza ekspresji genów wykazała znaczną regulację w górę genów tenogennych zarówno po trzech, jak i siedmiu dniach, w porównaniu z samymi iMSC w dniu zero. Odkładanie się kolagenu w pożywce po siedmiu dniach rozciągania było znacznie wyższe w grupie rozciągniętych mezenchymalnych komórek zrębu indukowanych twardówką w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami.

generation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-itenocytes-via

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Poznaj metodę generowania iTenocytów z komórek iPSC poprzez nadekspresję Scleraxis i jednoosiowe rozciąganie w bioreaktorze 2D. Technika ta poprawia różnicowanie komórek i może wspierać skuteczniejszą terapię uszkodzeń ścięgien.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Przeglądaj więcej filmów