Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Pracujemy nad przyspieszeniem odkrywania biomarkerów na podstawie tych badań. Jednym z ważnych kroków jest ich skuteczna i selektywna izolacja. Pułapka EV, która jest oparta na separacji opartej na Mag-Net EV, może nam naprawdę pomóc, zapewniając wysoką przepustowość, łatwość użycia, w szczególności łatwą do zastosowań klinicznych.

Używamy tego protokołu do odkrywania białek i biomarkerów fosfoprotein dla różnych chorób, takich jak rak rozprzestrzeniający się, rak nerki i choroba Parkinsona. Te biomarkery pochodzą z biopłynu. EV mogą być potencjalnie stosowane do płynnych biopsji, co może jeszcze bardziej poprawić diagnostykę kliniczną i leczenie.

Obecnie najczęściej stosowanym podejściem do zewnątrzkomórkowej izolacji wiskoizolacji są ultracyntyfikacja i strącanie. Jednak metody te ograniczają się do współizolacji zanieczyszczeń, a także niskiej wydajności. Tak więc nasza metoda trendów EV zapewni bardziej efektywny sposób izolowania EV, co pozwoli na bardziej powtarzalną i czułą metodę, a także przyniesie korzyści dalszej analizie.

Pracujemy nad dwiema rzeczami. Po pierwsze, kontynuujemy opracowywanie metod i protokołów izolacji pojazdów elektrycznych oraz dalszej analizy, w szczególności analizy opartej na specyfikacji masy. Po drugie, badamy różne zastosowania w dziedzinie klinicznej ze względu na przewagę zastrzyku EV.

Na początek zbierz próbki moczu od zdrowych osób. Odwiruj 12 mililitrów próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, aby wyeliminować resztki komórek w dużych ciałach apoptotycznych. Następnie przenieś 10 mililitrów supernatantu do świeżej 15-mililitrowej probówki.

Dodaj jeden mililitr bufora ładującego i 200 mikrolitrów zawiesiny z pułapki EV do próbki. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się od końca do końca. Aby nabrać próbkę na granulat, umieść 15-mililitrową stożkową rurkę na stojaku separatora magnetycznego.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu do mycia. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i delikatnie pipetuj w celu ponownego zawieszenia pęcherzyka zewnątrzkomórkowego lub kulek związanych z EV. Umieść probówkę mikrowirówki na stojaku separatora magnetycznego na probówki o pojemności 1.5 mililitra.

Za pomocą pipety P200 ostrożnie odessać supernatant. Teraz umyj kulki jednym mililitrem buforu do mycia, a następnie dwa razy przemyj jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Inkubuj kulki ze 100 mikrolitrami świeżo przygotowanej 100-milimolowej trietyloaminy przez pięć minut.

Używając 1,5-mililitrowego stojaka na separator magnetyczny z mikrorurką wirówkową, zbierz wyciekły roztwór zawierający EV. Po połączeniu roztworów, w których powstały wycieki, wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek weź wysuszoną do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych próbkę uzyskaną z ludzkiego moczu przy użyciu metody pułapki EV.

Przygotuj świeży bufor do lizy z pokazanymi składnikami. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy, aby rozpuścić wysuszoną próbkę EV. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1,100 obr./min.

Po schłodzeniu próbki do temperatury pokojowej rozcieńczyć ją pięciokrotnie, dodając 400 mikrolitrów 50-milimolowego TEAB. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać mieszaninę trypsyny i lizyny C do próbki.

I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wytrząsając przy 1,100 obr./min. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 10% kwasu trichlorooctowego lub TFA w celu zakwaszenia próbki. Następnie dodaj 600 mikrolitrów octanu etylu do próbek i wiruj mieszaninę przez dwie minuty.

Odwirować próbkę przez trzy minuty w temperaturze 20 000 G i ostrożnie usunąć górną warstwę, nie naruszając granic fazy. Wysuszyć fazę wodną za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Teraz ponownie zawieś wysuszoną próbkę w 200 mikrolitrach 0,1% TFA w celu zakwaszenia peptydów.

Aby odsolić próbkę, użyj końcówki odsalającej C18 i kondycjonuj ją 200 mikrolitrami 0,1% TFA i 80% acetonitrylu, a następnie dwukrotnie przepłucz 200 mikrolitrami 0,1% TFA. Załaduj zakwaszoną próbkę peptydu do końcówki i umyj ją trzykrotnie 200 mikrolitrami 0,1% TFA. Eluować peptydy za pomocą 200 mikrolitrów 0,1% TFA i 80% acetonitrylu.

Po pobraniu eluatu, jak pokazano, ponownie zawiesić wysuszoną próbkę fosfoproteomiczną w 200 mikrolitrach buforu ładującego w celu wzbogacenia fosfopeptydów. Dodaj 50 mikrolitrów kulek do próbki i energicznie wstrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Załadować próbkę z kulkami do spiekanej końcówki i wirować przez jedną minutę przy sile 100 G. Przemyć końcówkę kolejno 200 mikrolitrami buforu ładującego, przemywając jeden i dwa.

Umieść końcówkę z koralikami w nowej tubie, aby zebrać usunięte fosfopeptydy. Dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do końcówki. I wirować przez dwie minuty w temperaturze 20G.

Następnie wysuszyć usunięte fosfopeptydy za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Na początek przygotuj próbki proteomu i fosfoproteomu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z próbek moczu przy użyciu metody pułapki EV. Wstrzyknąć próbki do spektrometru masowego czasu ruchliwości uwięzionych jonów przelotu przez system chromatografii cieczowej.

Oddziel peptydy do 15-centymetrowej kolumny C18. Do analizy proteomicznej należy pozyskać dane za pomocą metody dia-PASEF z zakresem mas na rampę do rozpiętości od 300 do 1200, stosunkiem masy do ładunku i stałą ruchliwością jonów od 0,6 do 1,501 na K. W przypadku analizy fosfoproteomicznej należy pozyskać dane przy użyciu metody akwizycji dia-PASEF.

Ustaw zakres masy na rampę tak, aby wynosił od 400 do 1550, stosunek masy do ładunku i stałą ruchliwość jonów od 0,6 do 1,501 na węzeł. Załaduj surowe pliki do oprogramowania proteomicznego. Ustaw parametry wyszukiwania w bazie danych homosapiens.

Jako typ trawienia wybierz specyficzne i w sekcji Enzymy wybierz trypsynę P. Określ długość peptydu na minimum siedem i maksimum 52 i pozwól na dwa pominięte rozszczepienia. Następnie ustaw maksymalną liczbę modyfikacji zmiennych na pięć. Ustaloną modyfikacją powinien być karbamidometyl w cysteinie.

Podczas gdy zmienne modyfikacje powinny obejmować: białko acetylowe i końcowe, utlenianie metioniny i fosforylację seryny, treoniny i tyrozyny. Na koniec ustaw współczynnik fałszywych odkryć dla dopasowania widma peptydów, peptydów i grup białkowych na 0,01. W profilowaniu proteomicznym LCMS i MS.

2% każdej próbki ujawniło ponad 11 000 unikalnych peptydów z około 2 200 białek. Warto zauważyć, że 72% unikalnych białek zostało konsekwentnie znalezionych we wszystkich trzech powtórzeniach i zidentyfikowano 90 głównych markerów i białek EV w porównaniu z bazą danych ExoCarta. Precyzja ilościowa została potwierdzona niskim średnim współczynnikiem zmienności wynoszącym 5,7%, co oznacza wysoką odtwarzalność i niezawodność.

W przypadku fosfoproteomiki 98% każdej próbki peptydu dało 800 unikalnych fosfopeptydów i 350 fosfoprotein. W wyniku wzbogacenia uzyskano 72% peptydów fosfotryiny, 22% fosfotreoniny i 6% fosfotyrozyny. We wszystkich kontrpróbach zidentyfikowano 42% fosfopeptydów, a średni współczynnik zmienności wynosił 21,8%, co wskazuje na akceptowalną odtwarzalność ilościową.