Name: Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z moczu przy użyciu funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ta metoda umożliwia analizę proteomiczną i fosfoproteomiczną w celu odkrywania biomarkerów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez granty NIH 3RF1AG064250 i R44CA239845.

Wszystkie próbki moczu zostały pobrane od zdrowych osób po świadomej zgodzie. Eksperymenty były zgodne ze wszystkimi standardami etycznymi dotyczącymi próbek ludzkich i są zgodne z wytycznymi Programu Ochrony Badań Naukowych na Ludziach Uniwersytetu Purdue.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Odwirować 12 ml próbki moczu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 2 500 x g, 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych ciał apoptotycznych.</li>
	<li>Przenieść 10 ml supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml i przystąpić do izolacji EV. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrażać w temperaturze 37 °C po użyciu.</li>
</ol>
2. Izolacja EV przy użyciu podejścia EVtrap
<ol>
	<li>Dodać 0,5 ml bufora ładującego (stosunek 1:10 v/v) i 100 μl zawiesiny kulkowej EVtrap (stosunek 1:50 v/v) do próbki zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez rotację od końca do końca przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Osadzać próbkę, umieszczając stożkową probówkę o pojemności 15 ml na stojaku separatora magnetycznego. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml buforu do przemywania i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić kulki związane z EV.</li>
	<li>Umieścić probówkę na stojaku separatora magnetycznego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odessać supernatant. Użyj pipety P200, aby całkowicie zassać supernatant i uniknąć zasysania kulek.</li>
	<li>Umyj koraliki 1 ml buforu do mycia. Dodać bufor natychmiast po zassaniu supernatantu, aby zapobiec wysychaniu kulek.</li>
	<li>Przemyj kulki 2x 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować kulki ze 100 μl świeżo przygotowanej 100 mM trietyloaminy przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zebrać eluowany roztwór zawierający EV za pomocą 1,5 ml stojaka na separator magnetyczny w probówce do mikrowirówki. 
	UWAGA: Aby przygotować 1 ml 100 mM trietyloaminy, rozcieńczyć 14 μl roztworu trietyloaminy w wodzie.</li>
	<li>Powtórz krok 2.8 i połącz eluowane roztwory. Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Wysuszone próbki EV mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy bez negatywnego wpływu na kolejne etapy lub wyniki.</li>
</ol>
3. Charakterystyka EV za pomocą western blotting
<ol>
	<li>Zawiesić 5% wysuszonej próbki EV (co odpowiada 0,5 ml próbki moczu) w 20 μl 1x buforu próbki dodecylosiarczanu litu (LDS) z 10 mM ditiotreitolem (DTT). 
	UWAGA: EV od 0,5 ml moczu wystarczą do wykrycia sygnału CD9 (marker EV24) w western blotting.</li>
	<li>Gotować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Załadować próbkę do żelu poliakrylamidowego i przeprowadzić elektroforezę oraz immunoblotting zgodnie ze standardowymi protokołami25.</li>
	<li>Po przeniesieniu białek na membranę z polifluorku winylidenu o niskiej fluorescencji (PVDF), zablokuj błonę 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanym trisem soli fizjologicznej tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przygotować 1 l buforu TBST, dodaj 19 mM zasady Tris, 137 mM NaCl i 1 ml Tween-20; dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl.</li>
	<li>Inkubować błonę z króliczym przeciwciałem anty-CD9 w stosunku 1:5 000 w 1% BSA w TBST w temperaturze 4 °C przez noc lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą TBST. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG, sprzężonym z HRP w stosunku 1:5000 w 1% BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą TBST. Dodać uzyskane komercyjnie substraty wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (w stosunku 1:1) do membrany i wykryć sygnały w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej
<ol>
	<li>Przygotować świeży bufor do lizy zawierający 12 mM deoksycholanu sodu (SDC), 12 mM lauroilosarkozynianu sodu (SLS), 100 mM buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB), 10 mM tris-(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), 40 mM chloroacetamidu (CAA) i 1x koktajle inhibitorów fosfatazy. 
	UWAGA: Roztwory podstawowe są wymienione w opisie w Tabeli materiałów. Bufor do lizy przygotowuje się przez dodanie roztworów podstawowych w celu osiągnięcia pożądanych stężeń w zależności od wymaganej objętości.</li>
	<li>Wysuszoną próbkę EV rozpuścić w 100 μl buforu do lizy i podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C z wytrząsaniem przy 1 100 obr./min.</li>
	<li>Po schłodzeniu próbki do temperatury pokojowej należy ją rozcieńczyć pięciokrotnie, dodając 400 μl 50 mM TEAB.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć buforu do lizy rozcieńczonego pięciokrotnie 50 mM TEAB jako ślepej próby.</li>
	<li>Dodać mieszaninę trypsyny/Lys-C w stosunku 1:50 w/w enzymu do białka i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 1 100 obr./min.</li>
	<li>Dodać 50 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu zakwaszenia próbki.</li>
	<li>Dodać 600 μl octanu etylu do próbek i wirować mieszaninę przez 2 minuty.</li>
	<li>Odwirować próbkę przez 3 minuty przy 20 000 x g i usunąć górną warstwę (warstwę organiczną). Unikaj zakłócania interfejsu podczas aspiracji.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7-4.8. Wysuszyć fazę wodną za pomocą koncentratora wirówki próżniowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszoną próbkę w 200 μl 0,1% TFA w celu zakwaszenia peptydów i odsolić próbkę za pomocą końcówki odsalającej C18 zgodnie z instrukcjami producenta. Kondycjonuj końcówkę 200 μl 0,1% TFA w 80% acetonitrylu, a następnie 2x 200 μl 0,1% TFA. Załaduj zakwaszoną próbkę peptydu do końcówki, a następnie umyj końcówkę 3x 200 μl 0,1% TFA. Eluować peptydy za pomocą 200 μl 0,1% TFA w 80% acetonitrylu.</li>
	<li>Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Wysuszyć oddzielnie 2% próbki peptydu (co odpowiada 0,2 ml próbki moczu) do analizy proteomicznej. Resztę (98%) próbki należy wykorzystać do analizy fosfoproteomicznej.</li>
	<li>Wzbogać fosfopeptydy z próbki za pomocą zestawu do wzbogacania fosfopeptydów zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj czynności opisane poniżej w celu wzbogacenia.
	<ol>
		<li>Zawiesić wysuszoną próbkę w 200 μl buforu ładującego. Dodać 50 μl kulek do próbki i energicznie wstrząsać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Załadować próbkę z kulkami do spiekanej końcówki i wirować przez 1 minutę przy 100 x g.</li>
		<li>Przepłukać końcówkę 200 μl buforu ładującego, następnie przepłukać buforem 1, a następnie buforem płuczącym 2. Wykonaj wszystkie trzy etapy mycia, odwirowując raz przez 2 minuty przy 20 x g i raz przez 1 minutę przy 100 x g.</li>
		<li>Umieść końcówkę z koralikami w nowej tubie, aby zebrać wymyte fosfopeptydy. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do końcówki i odwirować raz przez 2 minuty przy 20 x g. Dodać kolejne 50 μl buforu elucyjnego do końcówki i odwirować raz przez 2 minuty przy 20 x g. Odwirować po raz ostatni przez 1 minutę przy 100 x g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysuszyć eluowane fosfopeptydy za pomocą koncentratora wirówki próżniowej.</li>
</ol>
5. Analiza LC-MS/MS
UWAGA: Można używać różnych systemów/ustawień LC-MS/MS i metod pozyskiwania danych, takich jak akwizycja zależna od danych (DDA).
<ol>
	<li>Wysuszone próbki proteomu/fosfoproteomu zawiesić ponownie w 0,1% kwasie mrówkowym (rozpuszczalnik A) i załadować próbki zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wstrzyknąć próbki do uwięzionego MS czasu przelotu z ruchliwością jonów za pomocą systemu chromatografii cieczowej (LC) i użyć wstępnie ustawionej znormalizowanej metody Whisper 40 próbek dziennie. Peptydy rozdziela się na 15 cm kolumnie C18 (średnica wewnętrzna 75 μm, wielkość cząstek 1,9 μm), jak podano w tabeli materiałów.</li>
	<li>Do analizy proteomicznej należy pozyskiwać dane za pomocą równoległej akumulacji szeregowej w połączeniu z metodą akwizycji niezależnej od danych (dia-PASEF) z zakresem masy na rampę obejmującą od 300-1200 m/z i od 0,6-1,50 1/K0 z czasem cyklu 1,38 s.</li>
	<li>W przypadku analizy fosfoproteomicznej należy pozyskać dane za pomocą metody akwizycji dia-PASEF o zakresie mas na rampę w zakresie 400-1550 m/z i 0,6-1,50 1/K0 z czasem cyklu 1,38 s.</li>
	<li>Załaduj surowe pliki do oprogramowania proteomicznego i przeprowadź ekstrakcję, identyfikację i kwantyfikację sygnałów, korzystając z niezależnego od biblioteki przepływu pracy akwizycji danych.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać ustawienia wyszukiwania, użyj bazy danych Homo sapiens, określonych typów trawienia z enzymami trypsyny / P, 7 minimalnej długości peptydu, 52 maksymalnej długości peptydu, dwóch pominiętych rozszczepienia, karbamidometylu w cysteinie jako ustalonej modyfikacji, białka acetylowego N-term, utleniania w metioninie i fosforylacji w serynie, treoninie i tyrozynie (do analizy fosfoproteomicznej) jako modyfikacje zmiennych i 5 jako maksymalne modyfikacje zmiennych. Ustaw FDR na PSM, peptyd i grupę białkową na 0,01, 
		UWAGA: W tym protokole użyto oprogramowania Spectronaut. Powszechnie stosowane są również inne programy do wyszukiwania danych DIA, takie jak DIA-NN i PEAKS. Jeśli dane zostały pozyskane w trybie DDA, zastosowanie ma oprogramowanie takie jak MaxQuant i Proteome Discoverer.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhancing EV Isolation for Precise Biofluid Analysis

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Maacha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles-mediated+intercellular+communication%3A+roles+in+the+tumor+microenvironment+and+anti-cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance.</a> Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).</li>
<li>van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Becker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((extracellular+vesicles+in+cancer%3A+cell-to-cell+mediators+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis.</a> Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).</li>
<li>Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+extracellular+vesicles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer.</a> Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).</li>
<li>Urabe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).</li>
<li>Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+and+Their+Roles+in+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression.</a> Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).</li>
<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li>
<li>Harsha, H. C., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics in cancer.</a> Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).</li>
<li>Singh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation%3A+Implications+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation: Implications in Cancer.</a> Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).</li>
<li>Delom, F., Chevet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+analysis%3A+from+proteins+to+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes.</a> Proteome Sci. 4, 15(2006).</li>
<li>Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+strategies+for+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analytical strategies for phosphoproteomics.</a> Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Zeringer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+extraction+and+RNA+profiling+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Methodol%22%5BJournal%5D)">Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes.</a> World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+A33+immunoaffinity-purified+exosomes+released+from+the+human+colon+tumor+cell+line+LIM1215+reveals+a+tissue-specific+protein+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).</li>
<li>Enderle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+from+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+isolated+by+a+novel+spin+column-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).</li>
<li>Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Phosphoproteome+Capture+and+Analysis+from+Urinary+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles.</a> J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).</li>
<li>Iliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-derived+extracellular+vesicle+phosphoproteomics+through+chemical+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification.</a> J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).</li>
<li>Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analyses+of+kinase-dependent+tyrosine+phosphoproteomes+based+on+metal+ion-functionalized+soluble+nanopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).</li>
<li>Hadisurya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+extracellular+vesicles+define+diagnostic+and+prognostic+biosignatures+for+Parkinson%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease.</a> Commun Med. 3 (1), 64(2023).</li>
<li>Hadisurya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-independent+acquisition+phosphoproteomics+of+urinary+extracellular+vesicles+enables+renal+cell+carcinoma+grade+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation.</a> Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).</li>
<li>Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+phosphoproteomics+in+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications.</a> Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+web-based+compendium+of+exosomal+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Res Int. 2018, (2018).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+relative+quantitation+of+proteins+using+tandem+mass+tags+%28TMT%29+and+mass+spectrometry+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS).</a> Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).</li>
<li>Charles Jacob, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+early+pancreatic+cancer+biomarkers+KIF5B+and+SFRP2+from+%E2%80%9Cfirst+contact%E2%80%9D+interactions+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clinl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment.</a> J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).</li>
<li>Nunez Lopez, Y. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+proteomics+and+phosphoproteomics+identify+pathways+for+increased+risk+in+patients+hospitalized+with+COVID-19+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).</li>
<li>Hinzman, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-omics+approach+identifies+pancreatic+cancer+cell+extracellular+vesicles+as+mediators+of+the+unfolded+protein+response+in+normal+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Sci Rep. 6, 22519(2016).</li>
<li>Searle, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high+quality+libraries+for+DIA+MS+with+empirically+corrected+peptide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions.</a> Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).</li>
<li>Skowronek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+in-depth+coverage+of+the+%28Phospho-%29proteome+with+deep+libraries+and+optimal+window+design+for+dia-PASEF%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF.</a> Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konkurencyjny interes finansowy. Anton Iliuk i W. Andy Tao są współzałożycielami firmy Tymora Analytical Operations, która opracowała kulki EVtrap i skomercjalizowała zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC.

Skuteczna izolacja EV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do wykrywania białek i fosfoprotein o niskiej obfitości w EV. Pomimo opracowania wielu metod mających na celu zaspokojenie tej potrzeby, większość z nich nadal cierpi z powodu ograniczeń, takich jak słaba regeneracja lub niska odtwarzalność, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach na dużą skalę i rutynowych warunkach klinicznych. DUC jest ogólnie uważana za najpowszechniejszą metodę izolacji EV, a dodatkowe etapy mycia są zwykle stosowane w celu zwiększenia ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to otoczone błoną nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie typy komórek i obecne w płynach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina itp.1,2,3,4. EV przenoszą ładunek różnorodnych bioaktywnych cząsteczek, które odzwierciedlają fizjologiczny i patologiczny stan komórek gospodarza, a zatem działają jako kluczowe czynniki w postępie choroby4,5,6. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że markery choroby oparte na EV można zidentyfikować przed wystąpieniem objawów lub fizjologicznym wykryciem nowotworów5,6,7.
Fosforylacja działa jako kluczowy mechanizm w sygnalizacji i regulacji komórkowej. Dlatego fosfoproteiny stanowią cenne źródło do odkrywania biomarkerów, ponieważ nieprawidłowe zdarzenia fosforylacji są związane z rozregulowanymi szlakami sygnalizacji komórkowej i rozwojem chorób przerzutowych, takich jak rak8,9,10. Chociaż profilowanie dynamiki fosforylacji pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby sygnatur fosfoprotein jako potencjalnych biomarkerów, niska liczebność i dynamiczna natura fosfoprotein stanowią poważne wyzwanie w rozwoju fosfoprotein jako biomarkerów11,12. Warto zauważyć, że nisko występujące fosfoproteiny zamknięte w EV są chronione przed zewnętrznym trawieniem enzymatycznym w środowisku zewnątrzkomórkowym8. W związku z tym EV i fosfoproteiny pochodzące z EV stanowią idealne źródło do odkrywania biomarkerów we wczesnym stadium wykrywania raka i innych chorób.
Chociaż analiza fosforylacji białek w EVs stanowi cenne źródło do zrozumienia sygnalizacji raka i wczesnego stadium diagnozowania choroby, brak skutecznych metod izolacji EV stanowi główną barierę. Izolację EV zwykle osiąga się za pomocą różnicowego ultrawirowania (DUC)13. Jednak ta metoda jest czasochłonna i nie nadaje się do implikacji klinicznych ze względu na niską przepustowość i słabą odtwarzalność13,14. Alternatywne podejścia do izolacji EV, takie jak wytrącanie indukowane polimerami15, są ograniczone niską specyficznością ze względu na współwytrącanie białek innych niż EV. Podejścia oparte na powinowactwie, w tym wychwytywanie powinowactwa oparte na przeciwciałach16 i filtracja powinowactwa17, oferują zwiększoną specyficzność, ale są ograniczone do stosunkowo niskiego współczynnika odzysku ze względu na małą objętość.
Aby rozwiązać problemy związane z badaniem dynamiki fosfoprotein w EVs, nasza grupa opracowała technikę całkowitego odzyskiwania i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVtrap) opartą na chemicznym powinowactwie do wychwytywania EV na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych18. Poprzednie wyniki wykazały, że ta metoda izolacji EV oparta na kulkach magnetycznych jest wysoce skuteczna w izolowaniu EV z szerokiej gamy próbek płynów biologicznych i jest w stanie osiągnąć znacznie wyższą wydajność EV przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia w porównaniu z DUC i innymi istniejącymi metodami izolacji18,19. Z powodzeniem wykorzystaliśmy EVtrap i metodę wzbogacania fosforeptydem na bazie tytanu opracowaną przez naszą grupę20 do profilowania fosfoproteomu EV pochodzących z różnych płynów biologicznych i wykrywania potencjalnych biomarkerów fosfoprotein dla różnych chorób19,21,22.
Tutaj prezentujemy protokół oparty na EVtrap do izolacji krążących EV. Protokół koncentruje się na EV w moczu. Pokazujemy również charakterystykę izolowanych pojazdów elektrycznych za pomocą western blotting. Następnie szczegółowo opisujemy przygotowanie próbki i akwizycję spektrometrii mas (MS) zarówno do analiz proteomicznych, jak i fosfoproteomicznych. Protokół ten zapewnia wydajny i powtarzalny przebieg pracy do profilowania proteomu EV i fosfoproteomu w moczu, co ułatwi dalsze badania nad EV i ich zastosowaniami klinicznymi23.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml Produkty</td><td>z zakresu nauk przyrodniczych</td><td>M-1700C-LB</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL probówka magnetyczna stojak na separator</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Stojak na separator magnetyczny w probówce 15 ml</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórek przeciwciał sprzężona z HRP</td><td></td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubowana na stole</td><td>Bioer</td><td>DIS-87999-3367802</td><td>Bioer Blok mieszania termokomórek MB-101</td></tr><tr><td>CD9 (D3H4P) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>13403S</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamid</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>C0267-100G</td><td>Służy do alkilowania zredukowanych grup siarczkowych. Świeżo przygotować 400 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>Octan etylu&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>E145-4</td><td>Wytrąca detergenty</td></tr><tr><td>Evosep One&nbsp;</td>System <td>chromatografii cieczowej</td> <td>Evosep</td><td></td></tr><tr><td>Evotips</td><td>Evosep</td><td>EV2013</td><td>Ładowanie próbki do systemu Evosep One&nbsp;</td></tr><tr><td>EVtrap</td><td>Tymora Analityczne</td><td></td><td>Funkcjonalizowane kulki magnetyczne, bufor załadowczy i bufor myjący&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-FL PVDF</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>IPFL00010</td><td>Blotting membrana&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>Invitrogen NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 12-dołkowy</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pepsep C18 15 x 75 x 1,9</td><td>Bruker&nbsp;</td><td>1893473</td><td>Kolumna separacyjna&nbsp;</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 2</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P5726-5ML</td><td>100X, inhibitor fosfotazy.</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 3</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P0044-1ML</td><td>100X,&nbsp; Inhibitor fosfotazy.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>HRP&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC</td><td>Tymora Analytical</td><td></td><td>Wychwytywanie powinowactwa do jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC) do wzbogacania fosfopeptydów</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu&nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td>Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>Sarkosynian lauroilu sodu&nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>L9150-50G</td><td>Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.</td></tr><tr><td>timsTOF HT</td><td>Bruker</td><td></td><td>Spektrometria mas czasu przelotu uwięzionej ruchliwości jonów</td></tr><tr><td>TopTip C-18 (10-200 &mu; L) napiwki&nbsp;</td><td>Glygen</td><td>TT2C18.96</td><td>Metoda odsalania</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>471283-100ML</td><td>Do elucji EV.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor bikabonianu trietyloamonu</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>T7408-100ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfiny</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>C4706</td><td>Służy do reducynacji wiązań dwusiarczkowych. Przygotować 200 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. Podwielokrotnić roztwór podstawowy na małą objętość i przechowywać go w temperaturze 20& stopni; C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).</td></tr><tr><td>Trypsyna/Lys-C MIX</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA41007</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z płynów biologicznych zyskały ostatnio znaczną uwagę w dziedzinie płynnej biopsji. Uwalniane przez prawie każdy typ komórek, zapewniają migawkę komórek gospodarza w czasie rzeczywistym i zawierają bogactwo informacji molekularnych, w tym białek, w szczególności tych z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM), takimi jak fosforylacja, jako główny gracz funkcji komórkowych oraz początku i progresji choroby. Jednak izolacja pojazdów elektrycznych z biopłynów pozostaje wyzwaniem ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia wynikające z obecnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, co utrudnia dalszą analizę ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak fosfoproteiny pojazdów elektrycznych. W tym miejscu opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji EV opartą na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych do izolacji EV z płynów biologicznych, takich jak ludzki mocz oraz dalsza analiza proteomiczna i fosfoproteomiczna po izolacji EV. Protokół umożliwił wysoką wydajność odzyskiwania EV w moczu oraz czułe profile proteomu EV i fosfoproteomu. Ponadto poruszono tu również kwestię wszechstronności tego protokołu i odpowiednich względów technicznych.

Niniejszy protokół przedstawia kompleksowy schemat postępowania, od izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) po analizy proteomiczne i fosfoproteomiczne (Rysunek 1). Próbki moczu pobrane w trzech powtórzeniach poddano izolacji EV. Wyizolowane EV scharakteryzowano za pomocą techniki western blotting, a następnie poddano przygotowaniu próbek do proteomiki opartej na spektrometrii mas, obejmującemu ekstrakcję białek, trawienie enzymatyczne oraz oczyszczanie peptydów. W celu przeprowadzenia...

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Extracellular vesicles (EVs) from biofluids have recently gained significant attention in the field of liquid biopsy. Released by almost every type of ...

Pracujemy nad przyspieszeniem odkrywania biomarkerów na podstawie tych badań. Jednym z ważnych kroków jest ich skuteczna i selektywna izolacja. Pułapka EV, która jest oparta na separacji opartej na Mag-Net EV, może nam naprawdę pomóc, zapewniając wysoką przepustowość, łatwość użycia, w szczególności łatwą do zastosowań klinicznych.Używamy tego protokołu do odkrywania białek i biomarkerów fosfoprotein dla różnych chorób, takich jak rak rozprzestrzeniający się, rak nerki i choroba Parkinsona. Te biomarkery pochodzą z biopłynu. EV mogą być potencjalnie stosowane do płynnych biopsji, co może jeszcze bardziej poprawić diagnostykę kliniczną i leczenie.Obecnie najczęściej stosowanym podejściem do zewnątrzkomórkowej izolacji wiskoizolacji są ultracyntyfikacja i strącanie. Jednak metody te ograniczają się do współizolacji zanieczyszczeń, a także niskiej wydajności. Tak więc nasza metoda trendów EV zapewni bardziej efektywny sposób izolowania EV, co pozwoli na bardziej powtarzalną i czułą metodę, a także przyniesie korzyści dalszej analizie.Pracujemy nad dwiema rzeczami. Po pierwsze, kontynuujemy opracowywanie metod i protokołów izolacji pojazdów elektrycznych oraz dalszej analizy, w szczególności analizy opartej na specyfikacji masy. Po drugie, badamy różne zastosowania w dziedzinie klinicznej ze względu na przewagę zastrzyku EV.Na początek zbierz próbki moczu od zdrowych osób. Odwiruj 12 mililitrów próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, aby wyeliminować resztki komórek w dużych ciałach apoptotycznych. Następnie przenieś 10 mililitrów supernatantu do świeżej 15-mililitrowej probówki.Dodaj jeden mililitr bufora ładującego i 200 mikrolitrów zawiesiny z pułapki EV do próbki. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając się od końca do końca. Aby nabrać próbkę na granulat, umieść 15-mililitrową stożkową rurkę na stojaku separatora magnetycznego.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu do mycia. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i delikatnie pipetuj w celu ponownego zawieszenia pęcherzyka zewnątrzkomórkowego lub kulek związanych z EV. Umieść probówkę mikrowirówki na stojaku separatora magnetycznego na probówki o pojemności 1.5 mililitra.Za pomocą pipety P200 ostrożnie odessać supernatant. Teraz umyj kulki jednym mililitrem buforu do mycia, a następnie dwa razy przemyj jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Inkubuj kulki ze 100 mikrolitrami świeżo przygotowanej 100-milimolowej trietyloaminy przez pięć minut.Używając 1,5-mililitrowego stojaka na separator magnetyczny z mikrorurką wirówkową, zbierz wyciekły roztwór zawierający EV. Po połączeniu roztworów, w których powstały wycieki, wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek weź wysuszoną do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych próbkę uzyskaną z ludzkiego moczu przy użyciu metody pułapki EV.Przygotuj świeży bufor do lizy z pokazanymi składnikami. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy, aby rozpuścić wysuszoną próbkę EV. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 1,100 obr./min.Po schłodzeniu próbki do temperatury pokojowej rozcieńczyć ją pięciokrotnie, dodając 400 mikrolitrów 50-milimolowego TEAB. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać mieszaninę trypsyny i lizyny C do próbki.I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wytrząsając przy 1,100 obr./min. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 10% kwasu trichlorooctowego lub TFA w celu zakwaszenia próbki. Następnie dodaj 600 mikrolitrów octanu etylu do próbek i wiruj mieszaninę przez dwie minuty.Odwirować próbkę przez trzy minuty w temperaturze 20 000 G i ostrożnie usunąć górną warstwę, nie naruszając granic fazy. Wysuszyć fazę wodną za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Teraz ponownie zawieś wysuszoną próbkę w 200 mikrolitrach 0,1% TFA w celu zakwaszenia peptydów.Aby odsolić próbkę, użyj końcówki odsalającej C18 i kondycjonuj ją 200 mikrolitrami 0,1% TFA i 80% acetonitrylu, a następnie dwukrotnie przepłucz 200 mikrolitrami 0,1% TFA. Załaduj zakwaszoną próbkę peptydu do końcówki i umyj ją trzykrotnie 200 mikrolitrami 0,1% TFA. Eluować peptydy za pomocą 200 mikrolitrów 0,1% TFA i 80% acetonitrylu.Po pobraniu eluatu, jak pokazano, ponownie zawiesić wysuszoną próbkę fosfoproteomiczną w 200 mikrolitrach buforu ładującego w celu wzbogacenia fosfopeptydów. Dodaj 50 mikrolitrów kulek do próbki i energicznie wstrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Załadować próbkę z kulkami do spiekanej końcówki i wirować przez jedną minutę przy sile 100 G. Przemyć końcówkę kolejno 200 mikrolitrami buforu ładującego, przemywając jeden i dwa.Umieść końcówkę z koralikami w nowej tubie, aby zebrać usunięte fosfopeptydy. Dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do końcówki. I wirować przez dwie minuty w temperaturze 20G.Następnie wysuszyć usunięte fosfopeptydy za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Na początek przygotuj próbki proteomu i fosfoproteomu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z próbek moczu przy użyciu metody pułapki EV. Wstrzyknąć próbki do spektrometru masowego czasu ruchliwości uwięzionych jonów przelotu przez system chromatografii cieczowej.Oddziel peptydy do 15-centymetrowej kolumny C18. Do analizy proteomicznej należy pozyskać dane za pomocą metody dia-PASEF z zakresem mas na rampę do rozpiętości od 300 do 1200, stosunkiem masy do ładunku i stałą ruchliwością jonów od 0,6 do 1,501 na K. W przypadku analizy fosfoproteomicznej należy pozyskać dane przy użyciu metody akwizycji dia-PASEF.Ustaw zakres masy na rampę tak, aby wynosił od 400 do 1550, stosunek masy do ładunku i stałą ruchliwość jonów od 0,6 do 1,501 na węzeł. Załaduj surowe pliki do oprogramowania proteomicznego. Ustaw parametry wyszukiwania w bazie danych homosapiens.Jako typ trawienia wybierz specyficzne i w sekcji Enzymy wybierz trypsynę P. Określ długość peptydu na minimum siedem i maksimum 52 i pozwól na dwa pominięte rozszczepienia. Następnie ustaw maksymalną liczbę modyfikacji zmiennych na pięć. Ustaloną modyfikacją powinien być karbamidometyl w cysteinie.Podczas gdy zmienne modyfikacje powinny obejmować: białko acetylowe i końcowe, utlenianie metioniny i fosforylację seryny, treoniny i tyrozyny. Na koniec ustaw współczynnik fałszywych odkryć dla dopasowania widma peptydów, peptydów i grup białkowych na 0,01. W profilowaniu proteomicznym LCMS i MS.2% każdej próbki ujawniło ponad 11 000 unikalnych peptydów z około 2 200 białek. Warto zauważyć, że 72% unikalnych białek zostało konsekwentnie znalezionych we wszystkich trzech powtórzeniach i zidentyfikowano 90 głównych markerów i białek EV w porównaniu z bazą danych ExoCarta. Precyzja ilościowa została potwierdzona niskim średnim współczynnikiem zmienności wynoszącym 5,7%, co oznacza wysoką odtwarzalność i niezawodność.W przypadku fosfoproteomiki 98% każdej próbki peptydu dało 800 unikalnych fosfopeptydów i 350 fosfoprotein. W wyniku wzbogacenia uzyskano 72% peptydów fosfotryiny, 22% fosfotreoniny i 6% fosfotyrozyny. We wszystkich kontrpróbach zidentyfikowano 42% fosfopeptydów, a średni współczynnik zmienności wynosił 21,8%, co wskazuje na akceptowalną odtwarzalność ilościową.

chemical-affinity-based-isolation-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z moczu przy użyciu funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ta metoda umożliwia analizę proteomiczną i fosfoproteomiczną w celu odkrywania biomarkerów chorób.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Przeglądaj więcej filmów