Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników
27 października 2023
Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji transportu monokarboksylanów, glukozy i ATP w komórkach glejowych i neuronach za pomocą genetycznie kodowanych czujników rezonansu Förstera opartych na transferze energii w preparacie mózgu larwalnego ex-vivo Drosophila.
Mózg jest tkanką o wysokim zużyciu energii, która głównie wykorzystuje glukozę jako paliwo. Z drugiej strony dane eksperymentalne sugerują, że inne metabolity, takie jak ciała ketonowe i monokarboksylany, mogą być przydatne jako źródła energii. Jednak nadal toczy się debata na temat tego, które komórki mózgowe są producentami i głównymi konsumentami.
Wykazano, że mleczan jest istotnym metabolitem u kręgowców napędzającym aktywność mózgu in vivo. Nasze grupy i inne wykazały w Drosophila znaczenie cząsteczek monokarboksylanu w zaspokajaniu wysokiego zapotrzebowania na energię w neuronach, a także zapotrzebowanie na mleczan i ciała ketonowe pochodzenia glejowego w tworzeniu pamięci. Opisaliśmy transportery monokarboksylanu w mózgu drosophila i ustaliliśmy, że transfer mleczanu z komórek glejowych do neuronów jest niezbędny do utrzymania aktywności neuronalnej w okresach dużego zapotrzebowania.
Główną zaletą jest możliwość określenia wewnątrzkomórkowej dynamiki glukozy i jej metabolitów, takich jak mleczan, pirogronian i ATP. W komórkach glejowych i neuronach podczas podstawowej i wysokiej aktywności neuronalnej. Dodatkowo, aby zmierzyć transfer tych cząsteczek w innych żywych tkankach, takich jak ciała tłuszczowe.
Wykorzystanie Drosophila jako modelu in vivo do badania metabolizmu energetycznego mózgu przy użyciu prostej konfiguracji. Pozwoli to na modelowanie chorób metabolicznych lub lepsze zrozumienie zarządzania energią w normalnym mózgu lub podczas rozwoju chorób neurodegeneracyjnych. Na początek umieść 60-milimetrową szalkę Petriego pokrytą 1% agarem i PBS w komorze do składania jaj.
Umieść kroplę płynnych drożdży na środku talerza, aby zachęcić do składania jaj. Następnie wprowadź do komory 300 much Drosophila. Trzymaj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.
Dwa razy dziennie należy umieścić szalkę Petriego w świeżo rozpuszczonych drożdżach. Czwartego dnia pozwól muchom złożyć jaja przez cztery godziny. Po włożeniu naczynia pozwól muchom składać jaja jeszcze przez trzy godziny na świeżym talerzu.
Po trzech godzinach umieść płytkę z jajkami w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 24 godziny. Z tej płytki zbierz od 50 do 100 nowo wyklutych larw i umieść je w plastikowej fiolce zawierającej standardową paszę. Na początek umieść 25-milimetrową szklaną pokrywę w dołkach sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej.
Umieść kroplę poli-L-lizyny na środku każdego szkiełka nakrywkowego. Po zakończeniu inkubacji umyć każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie wodą destylowaną. Następnie dwukrotnie przemyj szkiełka nakrywkowe roztworem soli fizjologicznej bez wapnia.
Następnie zainstaluj pokrywy w komorze nagrywającej i napełnij ją solą fizjologiczną bez wapnia. Zbierz wędrujące larwy trzeciego stadium z pożądanej krzyżówki genetycznej Drosophila. Przenieś larwy do naczynia dobrze.
Następnie umyj larwy trzykrotnie wodą destylowaną. Umieść larwy w innym szklanym naczyniu preparacyjnym zawierającym 750 mikrolitrów lodowatego, bezwapniowego roztworu soli. Teraz umieść larwę pod mikroskopem stereoskopowym.
Za pomocą kleszczy wykonaj poprzeczne cięcie z tyłu brzucha. Popchnij szczękę kleszczami, aby odwrócić larwy na lewą stronę. Obserwuj brzuszny rdzeń nerwowy obok szczęki.
Ostrożnie usuń wyimaginowane dyski i pozostałe tkanki rozpieszczane mózgiem. Następnie oddziel brzuszny rdzeń nerwowy z centralnym mózgiem i płatami wzrokowymi od reszty tkanki. Przenieść brzuszny rdzeń nerwowy do komory rejestracyjnej zawierającej roztwór soli fizjologicznej bez wapnia.
Aby uniknąć zakłóceń, przymocuj pozostałe nerwy do dolnej części szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Aby przeprowadzić eksperymenty na ciałach tłuszczowych, przystąp do izolowania tkanek tłuszczowych od larw. Umieścić izolowane ciała tłuszczowe wyrażające czujniki progowe w komorze zapisu.
Aby uzyskać obrazy tkanek wyrażających ekspresję, włącz system oświetlenia mikroskopu. Umieścić komorę zapisu zawierającą brzuszne sznury nerwowe lub ciała tłuszczowe na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Aby wyświetlić fluorescencję GCaMP6f, ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów.
W przypadku metabolitów, takich jak czujniki lakoniczne, pironowe, ATP lub glukozy, ustaw wzbudzenie na 440 nanometrów. Teraz ustaw akwizycję obrazu w regularnych odstępach czasu dla GCaMP6f i czujnika metabolitów. Umieść obiektyw do zanurzenia w wodzie, upewniając się, że pozostaje zanurzony.
Następnie podłącz komorę nagrywającą do systemu perfuzyjnego. Użyj pompy perystaltycznej o niskim strumieniu, aby wydobyć ciecz z komory i utrzymać stały przepływ trzech mililitrów na minutę. Umieść roztwór zawierający probówki 25 centymetrów nad stolikiem mikroskopu.
Przed jakąkolwiek stymulacją należy uzyskać stabilną linię bazową fluorescencji, pozwalając roztworowi rejestrującemu płynąć przez pięć do 10 minut. Teraz zastąp płynny roztwór roztworem stymulacyjnym zawierającym glukozę, pirogronian lub mleczan przez pięć minut. Uchwyć obrazy stymulowanego brzusznego rdzenia nerwowego, który był wystawiony na działanie 80 mikromolowej pikrotoksyny, aby ocenić aktywność neuronalną.
Lakoniczne czujniki zarówno w komórkach glejowych, jak i neuronach ruchowych reagują na jeden milimolowy mleczan w podobnym tempie na początku impulsu. Jednak neurony ruchowe osiągają wyższy wzrost w stosunku do linii podstawowej podczas pięciominutowego impulsu. Sygnał czujników glukozy wzrastał w podobnym tempie w komórkach glejowych i neuronach po wystawieniu na działanie pięciomilimolowej glukozy.
Jednak podczas impulsu glukozy sygnał w neuronach wzrasta bardziej niż w komórkach glejowych. Wyeliminowanie transportera chaski zredukowanego do transportu mleczanu w komórkach glejowych. Wzrost aktywności neuronalnej wywołany pikrotoksyną spowodował przejściowy spadek poziomu ATP w somie neuronów ruchowych.
Zaobserwowano, że lakoniczny czujnik jest dobrze wyrażony w ciałach tłuszczowych. Zwiększoną fluorescencję czujników glukozy zaobserwowano, gdy ciała tłuszczowe były wystawione na działanie rosnącego stężenia glukozy. Zwiększone stężenia mleczanu i pirogronianu powodowały proporcjonalny wzrost fluorescencji lakonicznej i pironicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wizualizacji transportu monokarboksylanów, glukozy oraz ATP w komórkach glejowych i neuronach z wykorzystaniem sensorów opartych na transferze energii rezonansowej Förstera w preparatach mózgów larw Drosophila ex-vivo. Celem badań jest wyjaśnienie roli tych metabolitów w zaspokajaniu wysokiego zapotrzebowania energetycznego podczas aktywności neuronalnej i tworzenia pamięci.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- metabolizm komórkowy
- inżynieria genetyczna
Wstęp
- Mózg ma wysokie zapotrzebowanie energetyczne, które jest zasilane przede wszystkim przez glukozę.
- Alternatywne metabolity, takie jak mleczany i monokarboksylany, mogą również służyć jako źródła energii.
- Rola mleczanów w neuronach jest kluczowa dla utrzymania aktywności neuronalnej.
- Badania na Drosophila wykazują konieczność dostarczania metabolitów pochodzenia glejowego dla prawidłowego funkcjonowania poznawczego.
Cel badania
- Wizualizacja i kwantyfikacja transportu metabolicznego w komórkach mózgu.
- Badanie dynamiki metabolitów podczas różnych stanów aktywności neuronalnej.
- Lepsze zrozumienie gospodarki energetycznej w warunkach prawidłowych oraz w stanach neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Zastosowano genetycznie kodowane sensory transferu energii rezonansowej Förstera (FRET).
- Do badania metabolizmu komórkowego wykorzystano model mózgu larwy Drosophila.
- Protokół obejmuje zbieranie nowo wyklutych larw oraz przygotowanie tkanek mózgowych.
- Opisano konfiguracje eksperymentalne do obrazowania i stymulacji metabolitami.
- Po stymulacji zmierzono sygnały fluorescencji dla poszczególnych metabolitów.
Główne wyniki
- Czujniki glukozy i mleczanu wykazały odmienne wzorce odpowiedzi w komórkach glejowych i neuronach.
- W neuronach ruchowych zaobserwowano przejściowy spadek poziomu ATP przy zwiększonej aktywności neuronalnej.
- Istotne wyniki wskazują, że transport mleczanu z komórek glejowych jest kluczowy dla utrzymania pobudliwości neuronów.
- Odpowiedzi czujników glukozy i mleczanu były odmienne w różnych kontekstach komórkowych, co dostarczyło informacji na temat dynamiki metabolicznej.
Wnioski
- Niniejsze badanie pogłębia zrozumienie dynamiki energetycznej w metabolizmie mózgu.
- Uzyskane informacje potencjalnie umożliwiają modelowanie chorób metabolicznych oraz badanie neurodegeneracji.
- Praca podkreśla współpracującą rolę komórek glejowych we wspieraniu funkcji neuronalnych i procesów poznawczych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa wizualizacja transportu monokarboksylanów i glukozy w preparatach ex vivo mózgów larw Drosophila umożliwia mechanistyczną analizę ryzyka w odniesieniu do szlaków metabolicznych krytycznych dla funkcji neuronalnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów związanych z metabolizmem energetycznym mózgu i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w początkowej fazie budowania portfolio w badaniach nad neurodegeneracją i chorobami metabolicznymi. Zdolność tej metody do analizy dynamiki metabolitów w przedziałach glejowych i neuronalnych pozycjonuje ją jako uniwersalną platformę dla badań i rozwoju (R&D) na etapie odkrywczym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji szlaków metabolicznych w układach neuronalnych istotnych w przebiegu chorób.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie mechanizmów transferu metabolitów między glejem a neuronami.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dla transporterów monokarboksylanów i enzymów metabolicznych.
- Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie rozwoju celów metabolicznych w portfolio leków oddziałujących na OUN.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane systemy mózgu ex vivo do ilościowych analiz transportu metabolitów.
- Zapewnia powtarzalne odczyty w czasie rzeczywistym oparte na metodzie FRET w celu standaryzacji analizy.
- Umożliwia skalowalny screening genetycznych lub farmakologicznych modulatorów przepływu metabolitów.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na metabolizm neuronalny i glejowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej jednostki chorobowej w zakresie translacyjnych badań nad biomarkerami w neurodegeneracji.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji metabolicznych.
- Umożliwia dostosowane do ryzyka wdrażanie celów metabolicznych w oparciu o odczyty funkcjonalne.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach opracowywania leków na OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną dla celów metabolicznych w OUN.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie dynamiki metabolitów w celu wyjaśnienia roli szlaków i walidacji celów w neuronalnym metabolizmie energetycznym.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników z czujników FRET do rozwoju testów i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwienie bezpośredniego pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian metabolitów oraz funkcji transporterów.
- Badania translacyjne: Przenoszenie wyników odkryć do przedklinicznych modeli neurodegeneracji i chorób metabolicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferowanie modularnej platformy możliwej do adaptacji do innych tkanek i szlaków metabolicznych Drosophila.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad metabolizmem OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy transportu metabolitów za pomocą skalowalnych i powtarzalnych protokołów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową we wczesnej fazie rozwoju portfolio CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów metabolicznych do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w genetyce Drosophila oraz w przygotowywaniu preparatów mózgu ex vivo.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do obrazowania FRET.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspresji sensorów i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w innych tkankach, lecz może wymagać optymalizacji sensorów dla nowych kontekstów.
- W projekcie eksperymentalnym należy uwzględnić specyficzność sensorów oraz zmienność zależną od stadium rozwojowego.
