Name: Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj wizualizację transportu monokarboksylanów, glukozy i ATP w komórkach glejowych i neuronach mózgu larw Drosophila przy użyciu czujników FRET. Ta metoda pozwala badać dynamikę metaboliczną w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Sierralta. Prace te były wspierane przez FONDECYT-Iniciación 11200477 (do AGG) i FONDECYT Regular 1210586 (do JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (czujnik glukozy) został podarowany przez Pierre-Yves Plaçais i Thomasa Preata, CNRS-Paryż.

1. Utrzymanie szczepu much i synchronizacja larw
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić te eksperymenty, użyj kultur much hodowanych w temperaturze 25 °C na standardowym pokarmie Drosophila składającym się z 10% drożdży, 8% glukozy, 5% mąki pszennej, 1,1% agaru, 0,6% kwasu propionowego i 1,5% metyloparabenu.</li>
	<li>Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj następujących linii: w1118 (tło kontroli eksperymentalnej), OK6-GAL4 (sterownik neuronów ruchowych), repo-GAL4 (sterownik dla wszystkich komórek glejowych), CG-GAL4 (sterownik dla ciał tłuszczowych), UAS-Pyronic (czujnik pirogronianu), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (czujnik glukozy), UAS-Laconic (czujnik mleczanu), UAS-GCaMP6f (czujnik wapnia), UAS-AT1.03NL (czujnik ATP) i UAS-Chk RNAi GD1829. Wszystkie linie wyrażające czujniki lub RNAi znajdują się w tle genetycznym w1118.</li>
	<li>Aby uzyskać zsynchronizowane larwy wędrujące w trzecim stadium rozwojowym, umieść 300 much (w wieku 3-5 dni, 100 samców, 200 dziewiczych samic) pożądanej krzyżówki genetycznej w komorze składania jaj, która zawiera 60-milimetrową szalkę Petriego pokrytą 1% agarozą w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS). Umieść kroplę płynnych/kremowych drożdży (o średnicy 1,5 cm) na środku płytki, aby zachęcić muchy do składania jaj (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C przez 3 dni, zastępując agarozową szalkę Petriego świeżą i świeżo rozpuszczonymi drożdżami dwa razy dziennie.</li>
	<li>Pozwól muchom złożyć jaja przez 4 godziny czwartego dnia przed zmianą szalki Petriego. Usuń tę tabliczkę. Następnie przez 3 godziny pozwól muchom złożyć jaja w nowej blaszce agarozowej ze świeżo rozpuszczonymi drożdżami. Użyj tych larw w eksperymentach.</li>
	<li>Po 3 godzinach usunąć płytkę zawierającą jaja i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Zbierz od 50 do 100 nowo wyklutych larw z tej płytki (0 godzin po wykluciu się larw) i umieść je w plastikowej fiolce zawierającej standardowy pokarm. Aby larwy mogły się prawidłowo odżywiać, upewnij się, że pokarm jest zmielony i miękki. Użyć larw 96 godzin po przeniesieniu.</li>
</ol>
2. Zrób szkiełka nakrywkowe z poli-L-lizyny
<ol>
	<li>Wykonaj ten krok 1 godzinę przed rozwarstwieniem larw. Na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm (średnica pokryw, które mają być użyte, zależy od komory zapisu dostępnej w mikroskopie).</li>
	<li>Umieść kroplę (300 μl) poli-L-lizyny na środku każdego szkiełka nakrywkowego na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Każde szkiełko nakrywkowe przemyć 3x wodą destylowaną, a następnie 2x roztworem soli fizjologicznej pozbawionym Ca2+ (ten sam roztwór, którego używa się do preparowania larw, patrz krok 3.2). Zamontuj pokrywy w komorze nagraniowej i napełnij ją roztworem soli fizjologicznej bez Ca2+. 
	UWAGA: Chociaż mózg larwy może przylegać bezpośrednio do szklanych szkiełek nakrywkowych, adhezja jest słaba, a mózg czasami porusza się lub przemieszcza podczas eksperymentu z powodu ciągłego przepływu roztworu soli fizjologicznej. Dodatek etapu poli-L-lizyny zmniejsza ryzyko ruchów, a nawet utraty mózgu w wyniku prania.</li>
</ol>
3. Rozkrój brzusznego rdzenia nerwowego (VNC) i ciał tłuszczowych (FBs)
<ol>
	<li>Zbierz wędrujące larwy trzeciego stadium z pożądanej krzyżówki genetycznej (z kroku 1.7) i dokładnie umyj je 3x wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieścić larwy w szklanym naczyniu preparacyjnym zawierającym 750 μl nominalnie zerowego Ca2+ lodowatego roztworu soli złożonego ze 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalozy, 5 mM HEPES i 35 mM sacharozy (pH = 6,7, mierzone pH-metrem i regulowane 1 M NaOH i HCl 37% v/v). 
	UWAGA: Ustawienie pH na 6,7 ma kluczowe znaczenie, ponieważ, jak wcześniej zaobserwowano, transport monokarboksylanu jest w dużym stopniu zależny od pH roztworu. Ponadto 6,7 odpowiada pH w hemolimfie larwy trzeciej w stadium rozwojowym17,18.</li>
	<li>Umieść larwę pod mikroskopem stereoskopowym i wykonaj poprzeczne cięcie w poprzek tylnej części brzucha za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Popchnij szczękę kleszczami, jednocześnie obracając larwy na lewą stronę.</li>
	<li>Obserwuj brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) obok szczęki. Ostrożnie usuń wyimaginowane krążki międzykręgowe i pozostałe tkanki mózgowo-ogonowe.</li>
	<li>Oddziel VNC z centralnym mózgiem i płatami wzrokowymi od reszty tkanki, przecinając nerwy. Przenieś VNC, podnosząc go kleszczami z pozostałych nerwów i umieszczając w komorze zapisu zawierającej roztwór do nagrywania wolny od Ca2+ (ten sam roztwór z kroku 3.2). VNC natychmiast przykleją się do szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Aby uniknąć zakłóceń ze strony pozostałych nerwów, przymocuj je na dole szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy (nerwy będą również fluorescencyjne w zależności od użytej linii sterującej) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Aby przeprowadzić eksperymenty na ciałach tłuszczowych (FB) mierzących transport glukozy lub monokarboksylanu w innym zestawie eksperymentów, należy przystąpić do izolacji tkanek zgodnie z krokami 3.1-3.4. Gdy larwy zostaną wywrócone na lewą stronę, obserwuj, że FB jest białą, obustronną, płaską tkanką.</li>
	<li>Umieścić izolowane FB wyrażające czujniki FRET (uzyskane z krzyżówki genetycznej przy użyciu odpowiednich sterowników) w komorze zapisu zawierającej roztwór rejestrujący bez Ca2 +, 
	UWAGA: FB jest wysoce hydrofobowy (ma tendencję do unoszenia się na powierzchni roztworu) i niezwykle podatny na manipulację kleszczami, należy obchodzić się z nim ostrożnie. Każde nieostrożne obchodzenie się z tą tkanką spowoduje późniejsze martwe komórki (ze zmniejszoną fluorescencją czujników).</li>
	<li>Umieść komorę zapisu zawierającą VNC/FB na stoliku mikroskopu.</li>
</ol>
4. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Aby uzyskać obrazy czujników ekspresji tkankowej, należy użyć pionowego mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z systemem rozdzielania emisji i kamerą CCD. Włącz system oświetlenia mikroskopu na 30 minut przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu. 
	UWAGA: Tutaj używamy mikroskopu fluorescencyjnego Spinning Disk wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy 20x/0,5 do obserwacji zarówno VNC, jak i FBs. Rysunek 2 pokazuje również użycie obiektywu do zanurzenia w wodzie 40x/0,8.</li>
	<li>Aby zobrazować fluorescencję GCaMP6f, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 488 nm i 540 nm. W przypadku czujników lakonicznych/pironowych/ATP/glukozy należy ustawić długość fali wzbudzenia na 440 nm, a długości fal emisji na 488 nm (mTFP, CFP) i 540 nm (Wenus, YFP).</li>
	<li>Uzyskuj obrazy o rozmiarze 512 x 512 pikseli co 2 s dla GCaMP6f i co 10-30 s dla czujników Laconic/Pyronic/ATP/glukozy. Określ optymalną ekspozycję na źródło światła, obserwując jakość uzyskanego obrazu. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, upewnij się, że obrazy są naświetlone 300 ms dla czujników lakonicznych i pironowych oraz 100-150 ms dla czujników glukozy i ATP. 
	UWAGA: Ekspozycja może się różnić w zależności od użycia mikroskopu konfokalnego lub zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Po zainstalowaniu komory rejestracyjnej w stoliku mikroskopu, ostrożnie umieść obiektyw zanurzony w wodzie i upewnij się, że obiektyw pozostaje zanurzony przez cały czas trwania eksperymentu. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu na poziomie 25 °C.</li>
	<li>Podłączyć komorę rejestracyjną do systemu perfuzyjnego i utrzymywać tkanki skąpane w roztworze rejestrującym zawierającym 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalozy, 5 mM HEPES i 35 mM sacharozy, pH 6,7 (mierzone za pomocą pH-metru i regulowane za pomocą NaOH i HCl).</li>
	<li>Utrzymuj stały przepływ 3 ml / min roztworu rejestrującego przez tkankę za pomocą grawitacji, sprzężony z pompą perystaltyczną o niskim strumieniu w celu ekstrakcji cieczy z komory przy jednoczesnym utrzymaniu stałej objętości. Aby osiągnąć wymagany przepływ, umieść probówki zawierające roztwór (probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml) 25 cm nad stolikiem mikroskopu. 
	UWAGA: Ten przepływ napędzany grawitacją służy do zapobiegania ruchom tkanek spowodowanym przez pompy perystaltyczne, co pozwala na późniejszą dokładniejszą analizę obrazu.</li>
	<li>Przed jakąkolwiek stymulacją utrzymuj przepływ roztworu rejestrującego przez 5-10 minut, aby uzyskać stabilną linię podstawową fluorescencji z czujników. W razie potrzeby zmień czas trwania, aby uzyskać ten punkt odniesienia.</li>
	<li>Zastąp płynący roztwór roztworem stymulującym przez 5 minut, aby stymulować VNC/FB (glukozą, pirogronianem lub mleczanem w stężeniu opisanym dla każdego eksperymentu rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej; patrz każdy rysunek). 
	UWAGA: Czas trwania stymulacji może być zróżnicowany w zależności od potrzeb eksperymentu (na przykład, impulsy glukozy można zwiększyć do 10 minut, aby osiągnąć plateau w neuronach, jak wcześniej informowano16).</li>
	<li>Aby utrzymać osmolarność w roztworze stymulującym, należy skorygować stężenie sacharozy (węglowodanu niemetabolizowanego przez mózg Drosophila) zgodnie ze stężeniem dodanego monokarboksylanu lub glukozy.</li>
	<li>Zmieniaj rozwiązania za pomocą prostego systemu zaworów. Uważaj, aby nie przesunąć stolika mikroskopu.</li>
	<li>Wystaw VNC na działanie pikrotoksyny 80 μM (PTX, stale płynącej), aby stymulować aktywność neuronalną. Procedura ta zwiększa częstotliwość oscylacjiCa2+, umożliwiając obserwację zmian w metabolicznie istotnych cząsteczkach (np. wewnątrzkomórkowym ATP).</li>
	<li>Na zakończenie każdego doświadczenia należy dokładnie umyć cały system przepływowy, łącznie z probówkami i komorą rejestracyjną, przez co najmniej 10 minut roztworem soli fizjologicznej i przez kolejne 10 minut wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady użytych roztworów.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
<ol>
	<li>Aby przetworzyć uzyskane obrazy, wykonaj czynności pokazane w Rysunek 3.</li>
	<li>Zaimportuj obraz (Laconic) do oprogramowania ImageJ. Na zdjęciu znajdują się dwa widoki próbki: lewy to sygnał mTFP, a ten po prawej to sygnał Wenus. Wybierz region zawierający komórki, które mają być analizowane, i oddziel te obrazy (mTFP i Wenus) w nowym oknie. Upewnij się, że te obrazy zawierają dokładnie ten sam obszar.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę rejestracji i skoryguj mały dryf tkanki, który jest normalnie obserwowany w eksperymencie z funkcją sztywnego ciała. Wykonaj to na obu obrazach (mTFP i Wenus).</li>
	<li>Wybierz co najmniej 10 obszarów zainteresowania (ROI) w cytozolu odpowiadających im 10 komórek w sygnale mTFP (488 nm) i przenieś wybrane obszary na obraz Wenus (540 nm).</li>
	<li>Wybierz dwa lub trzy ROI w pobliżu analizowanych komórek, ale bez dostrzegalnego sygnału (zawsze w obrębie VNC lub analizowanej tkanki, patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). To są podstawowe zwroty z inwestycji.</li>
	<li>Po wybraniu ROI na obu obrazach uzyskaj średnią wartość szarości każdego sygnału za pomocą miary funkcji. Przenieś dane do arkusza danych i odejmij średnią wartość tła dla każdego sygnału.</li>
	<li>Określ współczynnik fluorescencji mTFP nad Wenus (dla lakonicznego i pironowego). Wartość ta jest obliczana inaczej niż w przypadku innych opisanych tutaj czujników FRET (gdzie stosunek wynosi zwykle YFP/CFP), ponieważ po związaniu z odpowiednimi podłożami zarówno lakoniczny, jak i pironowy zmniejszają swoją wydajność FRET.</li>
	<li>Znormalizuj dane, dzieląc każdą zarejestrowaną wartość przez linię bazową. W osobnym arkuszu danych oblicz linię bazową, przyjmując średnią wartość stosunku mTFP/Venus w ciągu 2 minut poprzedzających bodziec.</li>
	<li>W przypadku pomiarów stężenia glukozy i ATP przy użyciu czujników opartych na FRET oblicz stosunek YFP/CFP i znormalizuj dane zgodnie z opisem w kroku 5.8.</li>
</ol>

Monitoring Brain Metabolite Transport in Drosophila Using FRET Sensors

<ol><li>Vergara, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energy+homeostasis+principle%3A+neuronal+energy+regulation+drives+local+network+dynamics+generating+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).</li>
<li>Pulido, C., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+are+a+major+hidden+resting+metabolic+burden+of+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals.</a> Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).</li>
<li>Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+supply+of+glucose+to+the+brain+and+cognitive+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosocial+Science%22%5BJournal%5D)">The supply of glucose to the brain and cognitive functioning.</a> Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).</li>
<li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+for+the+brain%3A+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li>
<li>Boumezbeur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+blood+lactate+to+brain+energy+metabolism+in+humans+measured+by+dynamic+13C+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).</li>
<li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+lactate+serve+as+an+energy+substrate+for+axons+in+good+times+and+in+bad%2C+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Brain+Disease%22%5BJournal%5D)">Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health.</a> Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).</li>
<li>Barros, L. F., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrossTalk+proposal%3A+an+important+astrocyte-to-neuron+lactate+shuttle+couples+neuronal+activity+to+glucose+utilization+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain.</a> The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).</li>
<li>Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+thought%3A+Management+of+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+in+neuronal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).</li>
<li>Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biosensors+for+neuronal+metabolism+and+the+challenges+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation.</a> Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).</li>
<li>Imamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ATP+levels+inside+single+living+cells+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mitochondrial+flux+in+single+cells+with+a+FRET+sensor+for+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate.</a> PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Placais, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulated+energy+metabolism+in+the+Drosophila+mushroom+body+is+the+trigger+for+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+activity%2C+metabolism+and+behaviour+across+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain.</a> Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).</li>
<li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).</li>
<li>Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lactate+levels+depend+on+glia-derived+lactate+during+high+brain+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila.</a> Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).</li>
<li>Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocarboxylate+transporters+accept+and+relay+protons+via+the+bound+substrate+for+selectivity+and+activity+at+physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH.</a> PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).</li>
<li>Pasco, M. Y., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sugar-induced+insulin+resistance+in+Drosophila+relies+on+the+lipocalin+Neural+Lazarillo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo.</a> PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).</li>
<li>McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+carbohydrate+transport+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).</li>
<li>Delgado, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaski%2C+a+novel+Drosophila+lactate%2Fpyruvate+transporter+required+in+glia+cells+for+survival+under+nutritional+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+seizure+model+for+in+vivo+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening.</a> European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).</li>
<li>Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+changes+in+astrocytic+and+neuronal+adenosine+triphosphate+using+two+different+variants+of+Ateam%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).</li>
<li>Baeza-Lehnert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+control+of+neuronal+Energy+Status+by+the+Na%28%2B%29+Pump%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).</li>
<li>Mattila, J., Hietakangas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+carbohydrate+energy+metabolism+in+Drosophilamelanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster.</a> Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).</li>
<li>De Backer, J., Grunwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+glia+in+cellular+and+systemic+metabolism%3A+insights+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly.</a> Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).</li>
<li>Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glucose+uptake+in+Drosophila+models+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).</li>
<li>Dienel, G., Rothman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calibration+of+genetically+encoded+metabolite+biosensors+must+account+for+metabolite+metabolism+during+calibration+and+cellular+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume.</a> Journal of Neurochemistry. , (2023).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+toolkit+for+the+analysis+of+metabolic+changes+in+Drosophila+provides+new+insights+into+metabolic+responses+to+stress+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation.</a> Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+FRET+sensors+in+intact+organs%3A+Applying+spectral+unmixing+to+acquire+reliable+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Zastosowanie modelu Drosophila do badania metabolizmu mózgu jest stosunkowo nowei wykazano, że ma on więcej cech wspólnych z metabolizmem ssaków niż oczekiwano, co badano przede wszystkim in vitro w pierwotnych kulturach neuronów lub wycinkach mózgu. Drosophila przoduje w eksperymentach in vivo dzięki baterii narzędzi genetycznych i genetycznie kodowanych czujników, które pozwalają naukowcom wizualizować w czasie rzeczywistym zmiany metaboliczne spowodowane indu...

Mózg ma wysokie zapotrzebowanie na energię ze względu na wysokie koszty przywracania gradientów jonów w neuronach, spowodowanych generowaniem i przekazywaniem sygnałów elektrycznych przez neurony, a także transmisją synaptyczną1,2. Od dawna uważa się, że to wysokie zapotrzebowanie na energię jest zaspokajane przez ciągłe utlenianie glukozy w celu wytworzenia ATP3. Specyficzne transportery na barierze krew-mózg przenoszą glukozę z krwi do mózgu. Stały poziom glikemii zapewnia, że mózg otrzymuje stały dopływ glukozy4. Co ciekawe, coraz więcej dowodów eksperymentalnych sugeruje, że cząsteczki pochodzące z metabolizmu glukozy, takie jak mleczan i pirogronian, odgrywają ważną rolę w produkcji energii w komórkach mózgowych5,6. Jednak nadal toczy się dyskusja na temat tego, jak ważne są te cząsteczki dla produkcji energii i które komórki w mózgu je produkują lub wykorzystują7,8. Brak odpowiednich narzędzi molekularnych o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej wymaganej do tego zadania jest istotnym problemem, który uniemożliwił całkowite rozwiązanie tego sporu.
Rozwój i zastosowanie kilku zaprojektowanych fluorescencyjnych czujników metabolicznych zaowocowało niezwykłym wzrostem naszego zrozumienia gdzie i jak metabolity są produkowane i używane, a także jak zachodzą strumienie metaboliczne podczas podstawowej i wysokiej aktywności neuronalnej9. Genetycznie kodowane czujniki metaboliczne oparte na mikroskopii rezonansowego transferu energii Förstera (FRET), takie jak ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glukoza), Laconic (mleczan) i Pyronic (pirogronian), przyczyniły się do naszego zrozumienia metabolizmu energii mózgu10,11,12,13. Jednak ze względu na wysokie koszty i zaawansowany sprzęt wymagany do przeprowadzania eksperymentów na żywych zwierzętach lub tkankach, wyniki w modelach kręgowców są nadal ograniczone przede wszystkim do kultur komórkowych (komórek glejowych i neuronów).
Pojawiające się zastosowanie modelu Drosophila do wyrażania tych czujników ujawniło, że kluczowe cechy metaboliczne są zachowane u różnych gatunków, a ich funkcję można łatwo rozwiązać za pomocą tego narzędzia. Co ważniejsze, model Drosophila rzucił światło na to, w jaki sposób glukoza i mleczan/pirogronian są transportowane i metabolizowane w mózgu muchy, związek między spożyciem monokarboksylanu a tworzeniem pamięci oraz niezwykłą demonstrację nakładania się wzrostu aktywności neuronalnej i strumienia metabolicznego14,15,16,17. Przedstawiona tutaj metoda pomiaru poziomu monokarboksylanu, glukozy i ATP za pomocą genetycznie kodowanych czujników FRET ulegających ekspresji w mózgu larwy pozwala naukowcom dowiedzieć się więcej o tym, w jaki sposób mózg Drosophila wykorzystuje energię, którą można zastosować do mózgów innych zwierząt.
Pokazujemy, że ta metoda jest skuteczna w wykrywaniu mleczanu i glukozy w komórkach glejowych i neuronach, oraz że transporter monokarboksylanu (Chaski) jest zaangażowany w import mleczanu do komórek glejowych. Demonstrujemy również prostą metodę badania zmian metabolitów podczas zwiększonej aktywności neuronalnej, które można łatwo wywołać poprzez zastosowanie w kąpieli antagonisty receptora GABAA. Na koniec pokazujemy, że ta metodologia może być stosowana do pomiaru transportu monokarboksylanu i glukozy w innych istotnych metabolicznie tkankach, takich jak ciała tłuszczowe.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD ORCA-R2</td><td>Hamamatsu-Cell-R</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Software</td> Olympus-CG-GAL4 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7011</td><td>Sterownik do dużych ciał</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>System rozdzielania emisji DV2</td><td>Szkło fotometryczne</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(średnica 25 mm)</td><td>Marienfeld</td><td>111650</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>Wersja oprogramowania 8,0,2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institues of Health</td><td>Wersja 1,53t</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LUMPlanFl 40x/0.8 cel do zanurzenia w wodzie</td><td></td> Olympus-Methylparaben <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>OK6-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td>Sterownik neuronów ruchowych</td></tr><tr><td>Pitrotoksyna</td><td>Sigma</td><td>P1675S</td><td>UWAGA-Śmiertelne w przypadku połknięcia</td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma</td><td>P1386</td><td></td></tr><tr><td>Repo-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7415</td><td>Sterownik komórek glejowych (wszystkie)</td></tr><tr><td>Mleczan sodu</td><td>Sigma</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z wirującym dyskiem BX61WI</td> <td>Olympus-sacharoza</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>US Biological</td><td>T8270</td><td></td></tr><tr><td>UAS-AT1.03NL&nbsp;</td><td>Centrum magazynowe Kyoto Drosophila</td><td>117012</td><td>Czujnik ATP</td></tr><tr><td>UAS-Chk RNAi GD1829</td><td>Wiedeń Centrum zasobów Drosophila</td><td>v37139</td><td>Linia Chk RNAi</td></tr><tr><td>UAS-FLII12Pglu700md6&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>93452</td><td>Czujnik glukozy</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>42747</td><td>Czujnik wapnia</td></tr><tr><td>UAS-Laconic</td><td>Sierralta</td> <td>Lab-Czujnik</td> <td>mleczanu</td></tr><tr><td>UAS-Pironic</td><td>Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paryż</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UMPlanFl 20x/0.5 cel zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

Wysokie zapotrzebowanie energetyczne mózgu na energię wynikającą z aktywności elektrycznej jest jedną z ich najbardziej charakterystycznych cech. Wymagania te są spełnione przez produkcję ATP z glukozy i jej metabolitów, takich jak monokarboksylany mleczan i pirogronian. Nadal nie jest jasne, w jaki sposób proces ten jest regulowany ani kim są kluczowi gracze, szczególnie w przypadku Drosophila.
Korzystając z genetycznie kodowanych czujników transferu energii rezonansu Förster, prezentujemy prostą metodę pomiaru transportu monokarboksylanów i glukozy w komórkach glejowych i neuronach w preparacie mózgu larwalnego ex-vivo Drosophila. Protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić sekcję i przykleić mózg larwy wyrażającej jeden z czujników do szklanego szkiełka nakrywkowego. 
Prezentujemy wyniki całego eksperymentu, w którym mierzono transport mleczanu w mózgach larw poprzez niszczenie wcześniej zidentyfikowanych transporterów monokarboksylanu w komórkach glejowych. Ponadto pokazujemy, jak szybko zwiększyć aktywność neuronalną i śledzić zmiany metabolitów w aktywnym mózgu. Opisana metoda, która dostarcza wszystkich niezbędnych informacji, może być wykorzystana do analizy innych żywych tkanek Drosophila.

Przez maksymalnie 1 h procedura ta umożliwia łatwy pomiar wewnątrzkomórkowych zmian fluorescencji sensorów monokarboksylanów i glukozy. Jak pokazano na Rysunku 4, sensory Laconic zarówno w komórkach glejowych, jak i w neuronach ruchowych reagują na 1 mM mleczanu z podobną szybkością na początku impulsu, jednak neurony ruchowe osiągają wyższy wzrost względem linii bazowej podczas 5 min impulsu, co wykazano wcześniej17. Stężenie mleczanu to wybrano, ponieważ jest ono po...

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji transportu monokarboksylanów, glukozy i ATP w komórkach glejowych i neuronach za pomocą genetycznie kodowanych czujników rezonansu Förstera opartych na transferze energii w preparacie mózgu larwalnego ex-vivo Drosophila.

Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the ...

Mózg jest tkanką o wysokim zużyciu energii, która głównie wykorzystuje glukozę jako paliwo. Z drugiej strony dane eksperymentalne sugerują, że inne metabolity, takie jak ciała ketonowe i monokarboksylany, mogą być przydatne jako źródła energii. Jednak nadal toczy się debata na temat tego, które komórki mózgowe są producentami i głównymi konsumentami.Wykazano, że mleczan jest istotnym metabolitem u kręgowców napędzającym aktywność mózgu in vivo. Nasze grupy i inne wykazały w Drosophila znaczenie cząsteczek monokarboksylanu w zaspokajaniu wysokiego zapotrzebowania na energię w neuronach, a także zapotrzebowanie na mleczan i ciała ketonowe pochodzenia glejowego w tworzeniu pamięci. Opisaliśmy transportery monokarboksylanu w mózgu drosophila i ustaliliśmy, że transfer mleczanu z komórek glejowych do neuronów jest niezbędny do utrzymania aktywności neuronalnej w okresach dużego zapotrzebowania.Główną zaletą jest możliwość określenia wewnątrzkomórkowej dynamiki glukozy i jej metabolitów, takich jak mleczan, pirogronian i ATP. W komórkach glejowych i neuronach podczas podstawowej i wysokiej aktywności neuronalnej. Dodatkowo, aby zmierzyć transfer tych cząsteczek w innych żywych tkankach, takich jak ciała tłuszczowe.Wykorzystanie Drosophila jako modelu in vivo do badania metabolizmu energetycznego mózgu przy użyciu prostej konfiguracji. Pozwoli to na modelowanie chorób metabolicznych lub lepsze zrozumienie zarządzania energią w normalnym mózgu lub podczas rozwoju chorób neurodegeneracyjnych. Na początek umieść 60-milimetrową szalkę Petriego pokrytą 1% agarem i PBS w komorze do składania jaj.Umieść kroplę płynnych drożdży na środku talerza, aby zachęcić do składania jaj. Następnie wprowadź do komory 300 much Drosophila. Trzymaj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.Dwa razy dziennie należy umieścić szalkę Petriego w świeżo rozpuszczonych drożdżach. Czwartego dnia pozwól muchom złożyć jaja przez cztery godziny. Po włożeniu naczynia pozwól muchom składać jaja jeszcze przez trzy godziny na świeżym talerzu.Po trzech godzinach umieść płytkę z jajkami w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 24 godziny. Z tej płytki zbierz od 50 do 100 nowo wyklutych larw i umieść je w plastikowej fiolce zawierającej standardową paszę. Na początek umieść 25-milimetrową szklaną pokrywę w dołkach sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej.Umieść kroplę poli-L-lizyny na środku każdego szkiełka nakrywkowego. Po zakończeniu inkubacji umyć każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie wodą destylowaną. Następnie dwukrotnie przemyj szkiełka nakrywkowe roztworem soli fizjologicznej bez wapnia.Następnie zainstaluj pokrywy w komorze nagrywającej i napełnij ją solą fizjologiczną bez wapnia. Zbierz wędrujące larwy trzeciego stadium z pożądanej krzyżówki genetycznej Drosophila. Przenieś larwy do naczynia dobrze.Następnie umyj larwy trzykrotnie wodą destylowaną. Umieść larwy w innym szklanym naczyniu preparacyjnym zawierającym 750 mikrolitrów lodowatego, bezwapniowego roztworu soli. Teraz umieść larwę pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą kleszczy wykonaj poprzeczne cięcie z tyłu brzucha. Popchnij szczękę kleszczami, aby odwrócić larwy na lewą stronę. Obserwuj brzuszny rdzeń nerwowy obok szczęki.Ostrożnie usuń wyimaginowane dyski i pozostałe tkanki rozpieszczane mózgiem. Następnie oddziel brzuszny rdzeń nerwowy z centralnym mózgiem i płatami wzrokowymi od reszty tkanki. Przenieść brzuszny rdzeń nerwowy do komory rejestracyjnej zawierającej roztwór soli fizjologicznej bez wapnia.Aby uniknąć zakłóceń, przymocuj pozostałe nerwy do dolnej części szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Aby przeprowadzić eksperymenty na ciałach tłuszczowych, przystąp do izolowania tkanek tłuszczowych od larw. Umieścić izolowane ciała tłuszczowe wyrażające czujniki progowe w komorze zapisu.Aby uzyskać obrazy tkanek wyrażających ekspresję, włącz system oświetlenia mikroskopu. Umieścić komorę zapisu zawierającą brzuszne sznury nerwowe lub ciała tłuszczowe na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Aby wyświetlić fluorescencję GCaMP6f, ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów.W przypadku metabolitów, takich jak czujniki lakoniczne, pironowe, ATP lub glukozy, ustaw wzbudzenie na 440 nanometrów. Teraz ustaw akwizycję obrazu w regularnych odstępach czasu dla GCaMP6f i czujnika metabolitów. Umieść obiektyw do zanurzenia w wodzie, upewniając się, że pozostaje zanurzony.Następnie podłącz komorę nagrywającą do systemu perfuzyjnego. Użyj pompy perystaltycznej o niskim strumieniu, aby wydobyć ciecz z komory i utrzymać stały przepływ trzech mililitrów na minutę. Umieść roztwór zawierający probówki 25 centymetrów nad stolikiem mikroskopu.Przed jakąkolwiek stymulacją należy uzyskać stabilną linię bazową fluorescencji, pozwalając roztworowi rejestrującemu płynąć przez pięć do 10 minut. Teraz zastąp płynny roztwór roztworem stymulacyjnym zawierającym glukozę, pirogronian lub mleczan przez pięć minut. Uchwyć obrazy stymulowanego brzusznego rdzenia nerwowego, który był wystawiony na działanie 80 mikromolowej pikrotoksyny, aby ocenić aktywność neuronalną.Lakoniczne czujniki zarówno w komórkach glejowych, jak i neuronach ruchowych reagują na jeden milimolowy mleczan w podobnym tempie na początku impulsu. Jednak neurony ruchowe osiągają wyższy wzrost w stosunku do linii podstawowej podczas pięciominutowego impulsu. Sygnał czujników glukozy wzrastał w podobnym tempie w komórkach glejowych i neuronach po wystawieniu na działanie pięciomilimolowej glukozy.Jednak podczas impulsu glukozy sygnał w neuronach wzrasta bardziej niż w komórkach glejowych. Wyeliminowanie transportera chaski zredukowanego do transportu mleczanu w komórkach glejowych. Wzrost aktywności neuronalnej wywołany pikrotoksyną spowodował przejściowy spadek poziomu ATP w somie neuronów ruchowych.Zaobserwowano, że lakoniczny czujnik jest dobrze wyrażony w ciałach tłuszczowych. Zwiększoną fluorescencję czujników glukozy zaobserwowano, gdy ciała tłuszczowe były wystawione na działanie rosnącego stężenia glukozy. Zwiększone stężenia mleczanu i pirogronianu powodowały proporcjonalny wzrost fluorescencji lakonicznej i pironicznej.

visualizing-monocarboxylates-other-relevant-metabolites-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj wizualizację transportu monokarboksylanów, glukozy i ATP w komórkach glejowych i neuronach mózgu larw Drosophila przy użyciu czujników FRET. Ta metoda pozwala badać dynamikę metaboliczną w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników

Przeglądaj więcej filmów