Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10
October 6th, 2023
Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.
Moje badania koncentrują się na rozwoju terapii opartej na komórkach macierzystych w zaawansowanych stadiach chorób siatkówki, które powodują zwyrodnienie fotoreceptorów. Celem naszych badań jest zastąpienie ubytku fotoreceptorów u pacjentów klinicznie bezpiecznymi i funkcjonalnymi progenitorami fotoreceptorów w celu poprawy ostrości wzroku lub nawet przywrócenia wzroku. Głównym modelem przedklinicznym są myszy.
Jednak ich mały rozmiar gałki ocznej sprawia, że wstrzykiwanie materiałów, zwłaszcza pod siatkówkę, jest trudne. Rozwijanie umiejętności wykonywania udanych iniekcji podsiatkówkowych wymaga cierpliwości i wytrwałości. Udało nam się opracować bazę lamininową do metody różnicowania receptorów, która jest w stanie wygenerować komórki progenitorowe fotoreceptorów w ciągu 32 dni.
Podsiatkówkowe przeszczepy zawiesin komórek progenitorowych tego fotoreceptora u gryzonia spowodowały połączenie synaptyczne między otworami i przeszczepem w oczach. Doprowadziło to do częściowej odbudowy wzroku. Nasze podejście jest proste.
Bezpośrednia wizualizacja pomaga chirurgowi manewrować igłą w obszarze zainteresowania. Zacznij od umieszczenia PRDM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń kriowialny kriowialny komórkowy fotoreceptorów pochodzących z HEST dnia 32 z ciekłego azotu i trzymaj go na suchym lodzie.
Następnie rozmrażaj kriowial w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Zawieś komórki w jednym mililitrze PRDM. Odwiruj je w 130 g przez cztery minuty.
Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PRDM. Aby policzyć komórki, weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszaj z 0,2% błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Odpipetować mieszaninę komórek do szkiełka komory zliczania komórek.
Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Jeśli żywotność komórek przekracza 70%, odwirować pozostałą zawiesinę komórek o masie 130 g przez cztery minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PRDM do przeszczepu.
Używając końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, ponownie zawiesić grudki komórek w probówce do mikrofuge, aż nie będą widoczne żadne grudki. Załadować zawiesinę do strzykawki iniekcyjnej o rozmiarze 33 i potwierdzić wytłaczanie roztworu komórkowego przez igłę. Na początek weź znieczuloną mysz i nałóż jedną kroplę 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny do oka, aby rozszerzyć źrenicę.
Następnie nałóż żel okulistyczny na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu i zaćmie wywołanej znieczuleniem. Następnie ustaw pionowy mikroskop operacyjny z bezpośrednią ścieżką światła w sterylnym środowisku, aby wykonać wstrzyknięcie podsiatkówkowe. Aby przygotować szklaną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów, odłącz piastę igły i przymocuj igłę o rozmiarze 33.
Wziąć metalową osłonę piasty i bezpiecznie przymocować igłę do strzykawki. Przepłukać igłę wodą destylowaną, aby sprawdzić szczelność i drożność igły. Następnie opróżnij strzykawkę i ostrożnie odłóż ją na bok.
Następnie umieść znieczuloną mysz na poduszce i skieruj oko zabiegowe w stronę obiektywu mikroskopu. Zastosuj 0,5% chlorowodorek proparakainy i odczekaj 30 sekund. Następnie nałóż 150 mikrolitrów żelu okulistycznego na oko i przyklej okrągłe szkiełko nakrywkowe.
Wykonaj wstępne badanie wzroku, obserwując rogówkę, tęczówkę, źrenicę, soczewkę i spojówkę. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby uwidocznić dno oka myszy przez źrenicę. Następnie ustaw głowę tak, aby głowica optyczna wyrównała się ze środkiem źrenicy.
Następnie dotknij podstawy rurki zawierającej progenitory fotoreceptorów pochodzących z HESC, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórkową. Za pomocą szklanej strzykawki mikrolitrowej o pojemności 10 mikrolitrów z igłą o rozmiarze 33 narysuj dwa mikrolitry mieszanki komórek. Użyj jednorazowej igły o rozmiarze 30, aby utworzyć ranę po sklerectomii umieszczoną dwa milimetry za rąbkiem.
Utrzymuj kąt igły na poziomie około 45 stopni, aby zapobiec kontaktowi z soczewką. Gdy końcówka igły stanie się widoczna w oku, ostrożnie wycofaj igłę. Wyrzuć zużytą igłę do ostrego pojemnika, aby zapobiec zranieniu igłą.
Teraz weź szklaną strzykawkę i włóż igłę do rany po skleferektomii. Przesuwaj igłę bez dotykania soczewki, aż dotrze do przeciwległej siatkówki rany wlotowej. Delikatnie penetruj siatkówkę, aż zobaczysz gałąź uciskową na twardówce.
Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórkowej lub pożywki PRDM do przestrzeni podsiatkówkowej, utrzymując delikatny nacisk na strzykawkę. Powstanie widocznego pęcherzyka wskazuje na udane wstrzyknięcie. Odczekaj 10 sekund, aby komórki się uspokoiły.
Delikatnie wycofać igłę z oka. Aby uwidocznić pęcherzyk, przesuń głowę myszy, aby ustawić oko pod mikroskopem i zabezpiecz pozycję, delikatnie przytrzymując głowę. W przypadku śródoperacyjnego OCT użyj funkcji iOCT w mikroskopie operacyjnym i wybierz kostkę na ekranie OCT.
Ustaw obszar skanowania na blebie, naciskając przyciski strzałek. Aby dostosować OCT, przesuń środek i ostrość, aby uzyskać najlepszą jakość OCT. Naciśnij przycisk przechwytywania lub skanowania, aby uzyskać skan OCT obszaru pęcherzyka.
Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić jakość skanów. Na koniec zdejmij szkiełko nakrywkowe i delikatnie oczyść żel z oka za pomocą gazy. Maść z antybiotykiem należy podawać raz po wstrzyknięciu, aby zapobiec infekcji.
Skan OCT ujawnił wyraźne jednostki HESC zawieszone w oku leczonym komórką. W przeciwieństwie do tego, oko leczone pożywką wykazywało niemętny płyn, pozbawiony komórek w przestrzeni podsiatkówkowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół przygotowania pochodzących z zamrożonych hESC fotoreceptorowych komórek progenitorowych i ich subretinalnego wprowadzenia u myszy rd10. Badania mają na celu opracowanie terapii opartych na komórkach macierzystych dla chorób siatkówki powodujących zwyrodnienie fotoreceptorów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Choroby siatkówki
Tło
- Zwyrodnienie fotoreceptorów prowadzi do utraty wzroku u wielu pacjentów.
- Terapia komórkami macierzystymi oferuje potencjalne rozwiązanie dla przywrócenia wzroku.
- Iniekcje subretinalne w małych modelach zwierzęcych stanowią wyzwanie techniczne.
- Opracowanie skutecznych protokołów jest kluczowe dla udanych wyników leczenia.
Cel badania
- Zastępowanie utraconych fotoreceptorów u pacjentów komórkami progenitorowymi o funkcji wtórnej.
- Poprawa ostrości wzroku lub przywrócenie wzroku u osób dotkniętych chorobą.
- Udoskonalanie technik wprowadzania subretinalnego w modelach przedklinicznych.
Stosowane metody
- Przygotowanie fotoreceptorowych komórek progenitorowych pochodzących z hESC.
- Techniki wprowadzania subretinalnego u myszy rd10.
- Opracowanie metody opartej na laminach dla różnicowania receptorów.
- Ocena powodzenia iniekcji i żywotności komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna generacja progenitorów fotoreceptorów w ciągu 32 dni.
- Zdemonstrowane skuteczne techniki iniekcji subretinalnych.
- Możliwość poprawy wyników wzroku w modelach przedklinicznych.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Opracowana metoda poprawia wykonalność terapii opartych na komórkach macierzystych.
- Metody wprowadzania subretinalnego mogą być zoptymalizowane dla lepszych wyników.
- Wymagane są dalsze badania w celu przełożenia wyników na ustawienia kliniczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Sub-retinal delivery of hESC-derived photoreceptor progenitors in rd10 mice addresses a critical challenge in regenerative ophthalmology by enabling targeted cell therapy for advanced retinal degeneration. This protocol supports predictive confidence in preclinical efficacy and informs translational strategies for cell-based interventions in vision restoration. The approach is directly relevant to early-stage portfolio decisions and mechanistic de-risking in cell therapy development for retinal diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of photoreceptor replacement hypotheses in a disease-relevant genetic model.
- Supports biological de-risking by demonstrating synaptic integration of transplanted progenitors.
- Provides functional target validation for cell-based therapies in retinal degeneration.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible workflow for preparing and delivering viable photoreceptor progenitors.
- Facilitates quantitative assessment of cell viability and injection success using OCT imaging.
- Enables standardization of sub-retinal delivery for downstream efficacy studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant preclinical models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing in vivo evidence of cell integration and survival.
- Informs biomarker development through imaging-based confirmation of cell localization.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, assay readiness, and translational validation in a genetic model of retinal degeneration.
- Discovery Biology: Supports mechanistic testing of photoreceptor replacement and synaptic integration.
- Screening: Provides standardized viability and injection quality metrics for candidate evaluation.
- Analytics: Utilizes OCT imaging for quantitative assessment of cell delivery and localization.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable and adaptable protocol for future cell therapy candidates targeting retinal diseases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell therapy efficacy and target engagement.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sub-retinal delivery workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, cell viability assessment, and microsurgical techniques.
- Demands access to specialized instrumentation, including OCT imaging and microinjection systems.
- Necessitates cross-team standardization for cell preparation and injection protocols.
- Adaptation may be needed for different animal models or cell types.
- Technical limitations include the small size of murine eyes and the need for precise injection control.
