Name: Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę podsiatkówkowego dostarczania progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10. Protokół umożliwia generowanie komórek w 32 dni i przywracanie wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee i Yingying Chung za udzielenie pomocy technicznej w przygotowaniu 32 dzień po kriokonserwacji fotoreceptorów pochodzących z hESC. Prace te były częściowo wspierane przez granty z National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) oraz National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) dla H.G.T.

Eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth (IACUC) oraz Oświadczenie Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Młode poddano immunosupresji od P17 (przed przeszczepem) do P30 (po przeszczepie) poprzez karmienie ich wodą pitną zawierającą cyklosporynę (260 g/l).
1. Przygotowanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z hESC w dniu 32 po kriokonserwacji
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzane podłoże do różnicowania fotoreceptorów (PRDM) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobierz kriowialny kriowialny zawierający komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzących z dnia 32 hESC z ciekłego azotu. Przechowywać na suchym lodzie.</li>
	<li>Rozmrażać kriowial w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 3-5 minut. Zawiesić 32 komórki w ciągu dnia w 1 ml PRDM i odwirować przy 130 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PRDM.</li>
	<li>Usunąć 10 μl mieszaniny do zliczenia komórek. Wymieszaj komórki za pomocą 0,2% błękitu trypanowego zgodnie z instrukcjami producenta. Odpipetować mieszaninę komórek do szkiełka komory zliczania komórek. Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Przejdź do następnego kroku, gdy żywotność komórki przekroczy 70%. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o sile 130 x g przez 4 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PRDM w stężeniu 3 x 105 komórek/μl do przeszczepu.</li>
	<li>Obserwuj, czy nie ma widocznych grudek komórek. Kilkakrotnie zawieszaj grudki komórek za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl w probówce do mikrofuge, aż nie będzie widać zbrylenia komórek. Załadować do strzykawki iniekcyjnej 33G, aby obserwować, czy roztwór komórkowy jest wytłaczany przez igłę.</li>
</ol>
2. Podsiatkówkowe dostarczanie hESC u myszy rd10
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz (P20, samiec/samica, 3-6 g) za pomocą kombinacji ketaminy (20 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (2 mg/kg masy ciała) w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml przymocowanej do igły 27G przez dostęp dootrzewnowy. Należy podać myszowi podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg) jako zapobiegawczy środek przeciwbólowy.</li>
		<li>Po podaniu znieczulenia należy wkroplić po 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny w celu rozszerzenia źrenicy. Nałóż żel okulistyczny na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu oka i zaćmie związanej ze znieczuleniem.</li>
		<li>Umieść mysz w pustej klatce, aż do całkowitego znieczulenia. Oceń właściwy poziom znieczulenia, ściskając opuszkę łapy i sprawdź, czy zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie.</li>
		<li>Gdy mysz jest w pełni znieczulona, umieść zwierzę na ciepłej podkładce ustawionej na 38 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podsiatkówkowe dostarczanie komórek
	<ol>
		<li>Aby zastosować 1-portowe podejście trans-szkliste pars plana, jak to zrobiono tutaj, wykonaj wstrzyknięcie podsiatkówkowe w sterylnym środowisku. Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć pionowego mikroskopu operacyjnego z bezpośrednią ścieżką światła.</li>
		<li>Przygotować szklaną strzykawkę o pojemności 10 μl, wyjmując piastę igły. Zamontuj igłę 33G na szklanej strzykawce. Wziąć metalową osłonę piasty i ostrożnie przymocować igłę do strzykawki.</li>
		<li>Przepłukać wodą destylowaną, aby sprawdzić, czy nie ma śladów wycieku i drożności igły. Opróżnić strzykawkę i ostrożnie odłożyć ją na bok.</li>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na poduszce, tak aby oko zabiegowe patrzyło prosto w obiektyw mikroskopu. Zastosuj 0,5% chlorowodorek proparakainy i odczekaj 30 sekund. Nałóż 150 μl żelu okulistycznego na oko i nałóż na nie okrągłe szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Wykonaj zgrubne badanie oka, obserwując rogówkę, tęczówkę, źrenicę, soczewkę i spojówkę. Przez źrenicę zwizualizuj dno oka myszy, dostosowując płaszczyznę ogniskowej. Wyreguluj głowę, aż głowica optyczna znajdzie się na środku źrenicy i zminimalizuj ruch głowy poprzez odpowiednie ułożenie na poduszce.</li>
		<li>Delikatnie postukaj kilkakrotnie w podstawę rurki za pomocą hESC, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek. Używając szklanej strzykawki mikrolitrowej o pojemności 10 μl z igłą 33G, należy pobrać 2 μl komórek/pożywki. Należy pobrać komórki tuż przed wstrzyknięciem, aby uniknąć osiadania/zbrylania się komórek w strzykawce.</li>
		<li>Za pomocą jednorazowej igły 30G wykonaj ranę sklerektomiczną 2 mm za rąbkiem. Utrzymuj kąt igły na poziomie ~45°, aby uniknąć dotykania soczewki. Po uwidocznieniu końcówki igły w oku, delikatnie wyjąć igłę. Po użyciu wyrzuć igłę do ostrego pojemnika, aby uniknąć ukłucia igłą.</li>
		<li>Weź szklaną strzykawkę i włóż igłę do rany po skleferektomii. Nie dotykając soczewki, przesuwaj igłę, aż dotrze do przeciwległej siatkówki rany wlotowej. Upewnij się, że obszar wstrzyknięcia jest wolny od głównych naczyń krwionośnych siatkówki, aby uniknąć krwawienia.</li>
		<li>Delikatnie penetruj siatkówkę, aż zobaczysz gałąź uciskową na twardówce. Trzymaj koniec igły równolegle do twardówki, aby uniknąć przeciekania komórek do przestrzeni ciała szklistego.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórkowej lub pożywki PRDM (kontrola) do przestrzeni podsiatkówkowej, utrzymując delikatny nacisk na strzykawkę. Po udanym wstrzyknięciu w miejscu wstrzyknięcia powinien powstać widoczny pęcherzyk (tj. uniesiona siatkówka z zawiesiną komórkową/pożywką) w miejscu wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Podczas wstrzykiwania należy stosować wyłącznie delikatny ucisk, aby uniknąć rozerwania siatkówki i zablokowania komórek na końcu igły.</li>
		<li>Po potwierdzeniu pęcherzyka odczekaj 10 sekund, aby komórki się uspokoiły. Delikatnie wycofać igłę z oka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śródoperacyjna optyczna koherentna tomografia (OCT) skanowania pęcherzyka (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Ustaw oko myszy tak, aby uwidocznić pęcherzyk pod mikroskopem, powoli przesuwając głowę. Zabezpiecz pozycję, delikatnie przytrzymując głowę. Nie jest konieczne dodatkowe rozszerzanie źrenic. Nie należy zdejmować szkiełka nakrywkowego i żelu z oka. Daje wyraźny nośnik optyczny do wizualizacji pęcherzyka.</li>
		<li>Wykonaj śródoperacyjne OCT za pomocą wbudowanej funkcji iOCT mikroskopu operacyjnego.</li>
		<li>Naciśnij opcję Cube na ekranie OCT i ustaw obszar skanowania na blebie, naciskając przyciski strzałek. Dostosuj OCT, przesuwając centrowanie i ostrość, aby uzyskać najlepszą jakość OCT. Naciśnij Capture/Scan, aby uzyskać skan OCT obszaru pęcherzyka. Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić jakość skanów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwania
	<ol>
		<li>Usuń szkiełko nakrywkowe i oczyść żel z oka gazą. Nałóż maść z antybiotykiem jeden raz po wstrzyknięciu, aby zapobiec infekcji.</li>
		<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w ciepłym świetle, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i powrócić do klatki domowej. Monitorować zwierzę przez co najmniej 3 dni po wstrzyknięciu pod kątem objawów stanu zapalnego, infekcji i niepokoju. 
		UWAGA: Ciepłe światło o mocy 150 W powinno znajdować się w odległości co najmniej 30 cm od klatki dla zwierząt i należy zachować ostrożność, aby uniknąć oparzeń.</li>
		<li>Podawać podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg) co 8 godzin przez 1 dzień lub zgodnie z zaleceniem lekarza weterynarii. W przypadku zaobserwowania zapalenia lub infekcji oka skonsultuj się z lekarzem weterynarii w celu uzyskania odpowiedniego leczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie i sterylizacja narzędzi
	<ol>
		<li>Przepłukać szklaną strzykawkę mikrolitrową o pojemności 10 μl i igłę 33G 100% etanolem 10x. Zmyć etanol, przemywając strzykawkę wodą destylowaną.</li>
		<li>Zdemontować szklaną strzykawkę i igłę. Osuszyć strzykawkę do przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Revitalizing Sight: Stem Cell Therapy for Retinal Degeneration

Hwee Goon Tay jest współzałożycielem Alder Therapeutics AB. Inni autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe było stosowane do przeszczepu zawiesiny komórkowej w leczeniu RPE i chorób siatkówki 23,25,26,27,28,31,40. Podejście to jest bardzo istotne w badaniach na gryzoniach, nie tylko w celu przeszczepu komórek i terapii genowej, ale także w celu oceny nowych związków t...

Dziedziczne choroby siatkówki i związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej prowadzą do utraty komórek fotoreceptorów i ostatecznej ślepoty. Fotoreceptor siatkówki to zewnętrzna warstwa segmentu siatkówki składająca się z wyspecjalizowanych komórek odpowiedzialnych za fototransdukcję (tj. konwersję światła na sygnały neuronalne). Komórki fotoreceptorów pręcików i czopków przylegają do warstwy barwnikowej siatkówki (RPE)1. Terapia fotoreceptorowa polegająca na zastępowaniu komórek w celu kompensacji utraty komórek jest wyłaniającym się i rozwijającym się podejściem terapeutycznym. Embrionalne komórki macierzyste (ESC)2,3,4, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek RPE i komórki progenitorowe siatkówki (RPC)4,5,6,7,8 zostały wykorzystane do odbudowy uszkodzonych komórek fotoreceptorowych. Przestrzeń podsiatkówkowa, zamknięta przestrzeń między siatkówką a RPE, jest atrakcyjnym miejscem do osadzania tych komórek w celu zastąpienia uszkodzonych komórek fotoreceptorowych, RPE i komórek Muellera ze względu na swoje sąsiedztwo9,10,11.
Terapie genowe i komórkowe wykorzystywały przestrzeń podsiatkówkową w medycynie regeneracyjnej dla różnych chorób siatkówki w badaniach przedklinicznych. Obejmuje to dostarczenie funkcjonalnych kopii genu lub narzędzi do edycji genów w postaci terapii oligonukleotydowej przeciwsensownej12,13 lub CRISPR/Cas9 lub edycji zasady za pomocą strategii opartej na wirusach związanych z adenowirusem (AAV)14,15,16, implantacja materiałów (np. arkusz RPE, protetyka siatkówki17,18,19) i zróżnicowane organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych20,21,22 do leczenia chorób siatkówki i chorób związanych z RPE. Badania kliniczne z użyciem hESC-RPE31 w przestrzeni podsiatkówkowej w leczeniu wrodzonej ślepoty Lebera (LCA) związanej z RPE6523,24, achromatopsja sprzężona z CNGA325, barwnikowe zapalenie siatkówki związane z MERTK26, choroideremia27,28,29,30 udowodniono, że jest to skuteczne podejście. Bezpośrednie wstrzyknięcie komórek w pobliże uszkodzonego obszaru znacznie zwiększa szansę na osiadanie komórek w odpowiednim regionie, integrację synaptyczną i ostateczną poprawę widzenia.
Mimo że wstrzyknięcie podsiatkówkowe u ludzi i modeli o dużych oczach (np. świnia32,33,34,35, królik36,37,38,39,40 i naczelny niebędący człowiekiem41,42,43) zostało ustalone, takie wstrzyknięcie w modelu mysim jest nadal trudne ze względu na ograniczenie rozmiaru gałki ocznej i ogromną soczewkę zajmującą oko myszy44,45,46. Jednak modele modyfikowane genetycznie są łatwo dostępne tylko u małych zwierząt, a nie u dużych zwierząt (tj. królików i naczelnych innych niż ludzie), dlatego wstrzyknięcie podsiatkówkowe u myszy zwraca uwagę na zbadanie nowych podejść terapeutycznych w genetycznych zaburzeniach siatkówki. Do dostarczania komórek lub AAV do przestrzeni podsiatkówkowej stosuje się trzy główne podejścia, a mianowicie drogę przezrogówkową, drogę przeztwardówkową i drogę pars plana (patrz ryc. 2). Drogi przezrogówkowe i przeztwardówkowe są związane z powstawaniem zaćmy, synechiami, krwawieniem naczyniówkowym i refluksem z miejsca wstrzyknięcia11,44,45,47,48,49. Przyjęliśmy podejście pars plana jako bezpośrednią wizualizację procesu wstrzykiwania, a miejsce wstrzyknięcia można uzyskać w czasie rzeczywistym pod mikroskopem.
Niedawno opisaliśmy metodę, która może różnicować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) w progenitory fotoreceptorów w warunkach wolnych od ksenowolności, chemicznie zdefiniowanych przy użyciu rekombinowanej izoformy lamininy LN523 specyficznej dla ludzkiej siatkówki. Ponieważ stwierdzono, że LN523 jest obecny w siatkówce, postawiliśmy hipotezę, że nisza macierzy zewnątrzkomórkowej ludzkiej siatkówki może zostać ponownie podsumowana in vitro, a tym samym wspierać różnicowanie fotoreceptorów od hESCs36. Analiza transkryptomiczna pojedynczej komórki wykazała, że komórki progenitorowe fotoreceptorów koeksprymujące homeobox stożkowy-pręcik i rekupynę zostały wygenerowane po 32 dniach. Mysi model zmutowanego zwyrodnienia siatkówki 10 (rd10), który naśladuje autosomalne barwnikowe zwyrodnienie siatkówki u ludzi, wykorzystano do oceny skuteczności komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC dnia 32 in vivo. Komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzące z hESC zostały wstrzyknięte do przestrzeni podsiatkówkowej myszy rd10 w P20, gdzie trwa dysfunkcja i degeneracja fotoceptora36. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania postkriokonserwowanych komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC i dostarczania do przestrzeni podsiatkówkowej myszy rd10. Metoda ta może być również stosowana do podawania AAV, zawiesin komórkowych, peptydów lub substancji chemicznych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy.

<table><tbody><tr><td>0,3% Tobramycyna</td><td>Novartis</td><td>NDC &nbsp; 0078-0813-01</td><td>Tobrex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,3% Tobramycyna i 0,1% deksametazon</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,5% chlorowodorek proparakainy</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0,5% Alkaina (15 ml)</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka tuberkulinowa</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl (15 ml)</td></tr><tr><td>2,5% chlorowodorek fenylefryny</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2,5% Mydfrin (5 mL)</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Igła jednorazowa</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, długość 20 mm igły</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>NanoEnTek</td><td>Model: Eve</td><td></td></tr><tr><td>B27 bez witaminy A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%36</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic weterynarz (0,3 mg/ml)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &mikro; M36</td></tr><tr><td>Cyklosporyna</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L w wodzie pitnej</td></tr><tr><td>Dzień 32 Komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzące z hESC</td> Szkoła <td></td><td>Medyczna DUKE-NUS Ludzkie</td><td>embrionalne komórki macierzyste różnicują się przez 32 dni. Patrz protokół w odnośniku 36.</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Winner Industries Co., Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash; 035</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa hESC H1</td><td>Instytut Badawczy WiCell</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego mózgu (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Ludzki rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 &mikro; g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka mikrolitrowa (10 ml)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorofenacetylo-L-alanyl)]-S-fenyloglicyny ester t-butylowy (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &micro; M36</td></tr><tr><td>N-2 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%36</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop operacyjny</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>z wbudowaną funkcją iOCT</td></tr><tr><td>PRDM (pożywka do różnicowania fotoreceptorów, 50ml)</td><td>Szkoła</td><td></td> Medyczna DUKE-NUS <td>Zobacz skład podłoża36. Podłoże podstawowe, 10 i mikro; M DAPT, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml CNTF, 0,5 i mikro; M Kwas retinowy, 2% B27 i 1% N2. Podłoże podstawowe: 1x GMEM, 1 mM pirogronian sodu, 0,1 mM B-merkaptoetanol, 1x Aminokwasy endogenne (NEAA).</td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>B6. Myszy CXB1-PDE6BRD10/J</td><td>Płeć: mężczyzna/kobieta, Wiek: P20 (wstrzyknięcie), Waga: 3-6 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0,5 &mikro; M36</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0,5 &mikro; M36</td></tr><tr><td>Vidisic Gel (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash; 023</td><td>0,1 mM36</td></tr></tbody></table>

podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneracja komórek fotoreceptorowych za pomocą ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest obiecującą terapią w leczeniu zarówno dziedzicznych, jak i starzejących się chorób siatkówki w zaawansowanych stadiach. Wykazaliśmy, że ludzka rekombinowana matryca izoformy lamininy specyficzna dla siatkówki jest w stanie wspierać różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do progenitorów fotoreceptorów. Ponadto wstrzyknięcie tych komórek pod siatkówkę wykazało również częściową odbudowę w modelach gryzoni i królików rd10. Wiadomo, że wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest uznaną metodą, która była stosowana do dostarczania związków farmaceutycznych do komórek fotoreceptorów i warstwy pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) oka ze względu na jego bliskość do przestrzeni docelowej. Jest również stosowany do dostarczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem do przestrzeni podsiatkówkowej w celu leczenia chorób siatkówki. Podsiatkówkowe dostarczanie związków farmaceutycznych i komórek w modelu mysim jest trudne ze względu na ograniczenie wielkości mysiej gałki ocznej. Protokół ten opisuje szczegółową procedurę przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC do wstrzyknięcia oraz technikę dostarczania tych komórek do siatkówki w genetycznym zwyrodnieniu siatkówki z mutacją rd10. Takie podejście pozwala na terapię komórkową docelowego obszaru, w szczególności zewnętrznej warstwy jądrowej siatkówki, gdzie występują choroby prowadzące do zwyrodnienia fotoreceptorów.

The 10 µL strzykawkę szklaną złożono zgodnie z instrukcją producenta (Rycina 1), a tępą igłę służącą do podawania zawiesiny komórkowej/pożywki przedstawiono w Rycina 1BRóżne podejścia do wstrzykiwania podsiatkówkowego zostały przedstawione w Rysunek 2W niniejszym protokole opisujemy podejście przez pars plana (Rysunek 2C). Tępa igła osadzona na szklanej strzykawce została wprowadzona przez ranę skleroto...

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Moje badania koncentrują się na rozwoju terapii opartej na komórkach macierzystych w zaawansowanych stadiach chorób siatkówki, które powodują zwyrodnienie fotoreceptorów. Celem naszych badań jest zastąpienie ubytku fotoreceptorów u pacjentów klinicznie bezpiecznymi i funkcjonalnymi progenitorami fotoreceptorów w celu poprawy ostrości wzroku lub nawet przywrócenia wzroku. Głównym modelem przedklinicznym są myszy.Jednak ich mały rozmiar gałki ocznej sprawia, że wstrzykiwanie materiałów, zwłaszcza pod siatkówkę, jest trudne. Rozwijanie umiejętności wykonywania udanych iniekcji podsiatkówkowych wymaga cierpliwości i wytrwałości. Udało nam się opracować bazę lamininową do metody różnicowania receptorów, która jest w stanie wygenerować komórki progenitorowe fotoreceptorów w ciągu 32 dni.Podsiatkówkowe przeszczepy zawiesin komórek progenitorowych tego fotoreceptora u gryzonia spowodowały połączenie synaptyczne między otworami i przeszczepem w oczach. Doprowadziło to do częściowej odbudowy wzroku. Nasze podejście jest proste.Bezpośrednia wizualizacja pomaga chirurgowi manewrować igłą w obszarze zainteresowania. Zacznij od umieszczenia PRDM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń kriowialny kriowialny komórkowy fotoreceptorów pochodzących z HEST dnia 32 z ciekłego azotu i trzymaj go na suchym lodzie.Następnie rozmrażaj kriowial w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Zawieś komórki w jednym mililitrze PRDM. Odwiruj je w 130 g przez cztery minuty.Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PRDM. Aby policzyć komórki, weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszaj z 0,2% błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Odpipetować mieszaninę komórek do szkiełka komory zliczania komórek.Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Jeśli żywotność komórek przekracza 70%, odwirować pozostałą zawiesinę komórek o masie 130 g przez cztery minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PRDM do przeszczepu.Używając końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, ponownie zawiesić grudki komórek w probówce do mikrofuge, aż nie będą widoczne żadne grudki. Załadować zawiesinę do strzykawki iniekcyjnej o rozmiarze 33 i potwierdzić wytłaczanie roztworu komórkowego przez igłę. Na początek weź znieczuloną mysz i nałóż jedną kroplę 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny do oka, aby rozszerzyć źrenicę.Następnie nałóż żel okulistyczny na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu i zaćmie wywołanej znieczuleniem. Następnie ustaw pionowy mikroskop operacyjny z bezpośrednią ścieżką światła w sterylnym środowisku, aby wykonać wstrzyknięcie podsiatkówkowe. Aby przygotować szklaną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów, odłącz piastę igły i przymocuj igłę o rozmiarze 33.Wziąć metalową osłonę piasty i bezpiecznie przymocować igłę do strzykawki. Przepłukać igłę wodą destylowaną, aby sprawdzić szczelność i drożność igły. Następnie opróżnij strzykawkę i ostrożnie odłóż ją na bok.Następnie umieść znieczuloną mysz na poduszce i skieruj oko zabiegowe w stronę obiektywu mikroskopu. Zastosuj 0,5% chlorowodorek proparakainy i odczekaj 30 sekund. Następnie nałóż 150 mikrolitrów żelu okulistycznego na oko i przyklej okrągłe szkiełko nakrywkowe.Wykonaj wstępne badanie wzroku, obserwując rogówkę, tęczówkę, źrenicę, soczewkę i spojówkę. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby uwidocznić dno oka myszy przez źrenicę. Następnie ustaw głowę tak, aby głowica optyczna wyrównała się ze środkiem źrenicy.Następnie dotknij podstawy rurki zawierającej progenitory fotoreceptorów pochodzących z HESC, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórkową. Za pomocą szklanej strzykawki mikrolitrowej o pojemności 10 mikrolitrów z igłą o rozmiarze 33 narysuj dwa mikrolitry mieszanki komórek. Użyj jednorazowej igły o rozmiarze 30, aby utworzyć ranę po sklerectomii umieszczoną dwa milimetry za rąbkiem.Utrzymuj kąt igły na poziomie około 45 stopni, aby zapobiec kontaktowi z soczewką. Gdy końcówka igły stanie się widoczna w oku, ostrożnie wycofaj igłę. Wyrzuć zużytą igłę do ostrego pojemnika, aby zapobiec zranieniu igłą.Teraz weź szklaną strzykawkę i włóż igłę do rany po skleferektomii. Przesuwaj igłę bez dotykania soczewki, aż dotrze do przeciwległej siatkówki rany wlotowej. Delikatnie penetruj siatkówkę, aż zobaczysz gałąź uciskową na twardówce.Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórkowej lub pożywki PRDM do przestrzeni podsiatkówkowej, utrzymując delikatny nacisk na strzykawkę. Powstanie widocznego pęcherzyka wskazuje na udane wstrzyknięcie. Odczekaj 10 sekund, aby komórki się uspokoiły.Delikatnie wycofać igłę z oka. Aby uwidocznić pęcherzyk, przesuń głowę myszy, aby ustawić oko pod mikroskopem i zabezpiecz pozycję, delikatnie przytrzymując głowę. W przypadku śródoperacyjnego OCT użyj funkcji iOCT w mikroskopie operacyjnym i wybierz kostkę na ekranie OCT.Ustaw obszar skanowania na blebie, naciskając przyciski strzałek. Aby dostosować OCT, przesuń środek i ostrość, aby uzyskać najlepszą jakość OCT. Naciśnij przycisk przechwytywania lub skanowania, aby uzyskać skan OCT obszaru pęcherzyka.Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić jakość skanów. Na koniec zdejmij szkiełko nakrywkowe i delikatnie oczyść żel z oka za pomocą gazy. Maść z antybiotykiem należy podawać raz po wstrzyknięciu, aby zapobiec infekcji.Skan OCT ujawnił wyraźne jednostki HESC zawieszone w oku leczonym komórką. W przeciwieństwie do tego, oko leczone pożywką wykazywało niemętny płyn, pozbawiony komórek w przestrzeni podsiatkówkowej.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Przeszczep komórek stanowi strategię leczenia zwyrodnienia siatkówki charakteryzującego się utratą fotoreceptorów. W tym miejscu opisujemy metodę wzbogacania fotoreceptorów do przeszczepiania i ich przeszczepiania podsiatkówkowego dorosłym myszom.

Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Przedstawiamy sposób przygotowania modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro oraz metodę oceny wpływu terapii komórkami macierzystymi na komórki serca po niedokrwieniu.

Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Poznaj metodę podsiatkówkowego dostarczania progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10. Protokół umożliwia generowanie komórek w 32 dni i przywracanie wzroku.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10 (Wideo) | JoVE Journal

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Przeglądaj więcej filmów