Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10
6 października 2023
Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.
Moje badania koncentrują się na rozwoju terapii opartej na komórkach macierzystych w zaawansowanych stadiach chorób siatkówki, które powodują zwyrodnienie fotoreceptorów. Celem naszych badań jest zastąpienie ubytku fotoreceptorów u pacjentów klinicznie bezpiecznymi i funkcjonalnymi progenitorami fotoreceptorów w celu poprawy ostrości wzroku lub nawet przywrócenia wzroku. Głównym modelem przedklinicznym są myszy.
Jednak ich mały rozmiar gałki ocznej sprawia, że wstrzykiwanie materiałów, zwłaszcza pod siatkówkę, jest trudne. Rozwijanie umiejętności wykonywania udanych iniekcji podsiatkówkowych wymaga cierpliwości i wytrwałości. Udało nam się opracować bazę lamininową do metody różnicowania receptorów, która jest w stanie wygenerować komórki progenitorowe fotoreceptorów w ciągu 32 dni.
Podsiatkówkowe przeszczepy zawiesin komórek progenitorowych tego fotoreceptora u gryzonia spowodowały połączenie synaptyczne między otworami i przeszczepem w oczach. Doprowadziło to do częściowej odbudowy wzroku. Nasze podejście jest proste.
Bezpośrednia wizualizacja pomaga chirurgowi manewrować igłą w obszarze zainteresowania. Zacznij od umieszczenia PRDM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń kriowialny kriowialny komórkowy fotoreceptorów pochodzących z HEST dnia 32 z ciekłego azotu i trzymaj go na suchym lodzie.
Następnie rozmrażaj kriowial w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Zawieś komórki w jednym mililitrze PRDM. Odwiruj je w 130 g przez cztery minuty.
Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PRDM. Aby policzyć komórki, weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszaj z 0,2% błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Odpipetować mieszaninę komórek do szkiełka komory zliczania komórek.
Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Jeśli żywotność komórek przekracza 70%, odwirować pozostałą zawiesinę komórek o masie 130 g przez cztery minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PRDM do przeszczepu.
Używając końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, ponownie zawiesić grudki komórek w probówce do mikrofuge, aż nie będą widoczne żadne grudki. Załadować zawiesinę do strzykawki iniekcyjnej o rozmiarze 33 i potwierdzić wytłaczanie roztworu komórkowego przez igłę. Na początek weź znieczuloną mysz i nałóż jedną kroplę 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny do oka, aby rozszerzyć źrenicę.
Następnie nałóż żel okulistyczny na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu i zaćmie wywołanej znieczuleniem. Następnie ustaw pionowy mikroskop operacyjny z bezpośrednią ścieżką światła w sterylnym środowisku, aby wykonać wstrzyknięcie podsiatkówkowe. Aby przygotować szklaną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów, odłącz piastę igły i przymocuj igłę o rozmiarze 33.
Wziąć metalową osłonę piasty i bezpiecznie przymocować igłę do strzykawki. Przepłukać igłę wodą destylowaną, aby sprawdzić szczelność i drożność igły. Następnie opróżnij strzykawkę i ostrożnie odłóż ją na bok.
Następnie umieść znieczuloną mysz na poduszce i skieruj oko zabiegowe w stronę obiektywu mikroskopu. Zastosuj 0,5% chlorowodorek proparakainy i odczekaj 30 sekund. Następnie nałóż 150 mikrolitrów żelu okulistycznego na oko i przyklej okrągłe szkiełko nakrywkowe.
Wykonaj wstępne badanie wzroku, obserwując rogówkę, tęczówkę, źrenicę, soczewkę i spojówkę. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby uwidocznić dno oka myszy przez źrenicę. Następnie ustaw głowę tak, aby głowica optyczna wyrównała się ze środkiem źrenicy.
Następnie dotknij podstawy rurki zawierającej progenitory fotoreceptorów pochodzących z HESC, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórkową. Za pomocą szklanej strzykawki mikrolitrowej o pojemności 10 mikrolitrów z igłą o rozmiarze 33 narysuj dwa mikrolitry mieszanki komórek. Użyj jednorazowej igły o rozmiarze 30, aby utworzyć ranę po sklerectomii umieszczoną dwa milimetry za rąbkiem.
Utrzymuj kąt igły na poziomie około 45 stopni, aby zapobiec kontaktowi z soczewką. Gdy końcówka igły stanie się widoczna w oku, ostrożnie wycofaj igłę. Wyrzuć zużytą igłę do ostrego pojemnika, aby zapobiec zranieniu igłą.
Teraz weź szklaną strzykawkę i włóż igłę do rany po skleferektomii. Przesuwaj igłę bez dotykania soczewki, aż dotrze do przeciwległej siatkówki rany wlotowej. Delikatnie penetruj siatkówkę, aż zobaczysz gałąź uciskową na twardówce.
Następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórkowej lub pożywki PRDM do przestrzeni podsiatkówkowej, utrzymując delikatny nacisk na strzykawkę. Powstanie widocznego pęcherzyka wskazuje na udane wstrzyknięcie. Odczekaj 10 sekund, aby komórki się uspokoiły.
Delikatnie wycofać igłę z oka. Aby uwidocznić pęcherzyk, przesuń głowę myszy, aby ustawić oko pod mikroskopem i zabezpiecz pozycję, delikatnie przytrzymując głowę. W przypadku śródoperacyjnego OCT użyj funkcji iOCT w mikroskopie operacyjnym i wybierz kostkę na ekranie OCT.
Ustaw obszar skanowania na blebie, naciskając przyciski strzałek. Aby dostosować OCT, przesuń środek i ostrość, aby uzyskać najlepszą jakość OCT. Naciśnij przycisk przechwytywania lub skanowania, aby uzyskać skan OCT obszaru pęcherzyka.
Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić jakość skanów. Na koniec zdejmij szkiełko nakrywkowe i delikatnie oczyść żel z oka za pomocą gazy. Maść z antybiotykiem należy podawać raz po wstrzyknięciu, aby zapobiec infekcji.
Skan OCT ujawnił wyraźne jednostki HESC zawieszone w oku leczonym komórką. W przeciwieństwie do tego, oko leczone pożywką wykazywało niemętny płyn, pozbawiony komórek w przestrzeni podsiatkówkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przygotowania post-krioprezerwowanych progenitorowych komórek fotoreceptorów pochodzących z hESC oraz ich podania podsiatkówkowego u myszy rd10. Celem badań jest opracowanie terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu chorób siatkówki prowadzących do degeneracji fotoreceptorów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Choroby siatkówki
Wstęp
- Degeneracja fotoreceptorów prowadzi do utraty wzroku u wielu pacjentów.
- Terapia komórkami macierzystymi oferuje potencjalne rozwiązanie w celu przywrócenia wzroku.
- Iniekcje podsiatkówkowe w modelach małych zwierząt stanowią wyzwanie techniczne.
- Opracowanie skutecznych protokołów jest kluczowe dla pomyślnych wyników leczenia.
Cel badania
- Zastąpienie utraconych fotoreceptorów u pacjentów za pomocą funkcjonalnych komórek progenitorowych.
- Poprawa ostrości widzenia lub przywrócenie wzroku u osób dotkniętych chorobą.
- Udoskonalenie technik podania podsiatkówkowego w modelach przedklinicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z hESC.
- Techniki dostarczania podsiatkówkowego u myszy rd10.
- Opracowanie metody różnicowania receptorów opartej na lamininie.
- Ocena powodzenia iniekcji oraz żywotności komórek.
Główne wyniki
- Pomyślne wytworzenie progenitorów fotoreceptorów w ciągu 32 dni.
- Zademonstrowanie skutecznych technik iniekcji podsiatkówkowej.
- Potencjał poprawy wyników wzrokowych w modelach przedklinicznych.
- Opracowanie niezawodnego protokołu do przyszłych badań.
Wnioski
- Opracowany protokół zwiększa wykonalność terapii komórkami macierzystymi.
- Metody podawania podsiatkówkowego mogą zostać zoptymalizowane w celu uzyskania lepszych wyników.
- Dalsze badania są niezbędne, aby przenieść uzyskane wyniki do warunków klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podretinalne podanie prekursorów fotoreceptorów pochodzących z hESC u myszy rd10 rozwiązuje kluczowy problem w okulistyce regeneracyjnej, umożliwiając celowaną terapię komórkową w zaawansowanym zwyrodnieniu siatkówki. Niniejszy protokół zwiększa pewność w przewidywaniu skuteczności przedklinicznej i dostarcza informacji dla strategii translacyjnych w zakresie interwencji komórkowych w celu przywrócenia wzroku. Podejście to ma bezpośrednie zastosowanie w decyzjach dotyczących wczesnych etapów rozwoju portfolio oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego podczas opracowywania terapii komórkowych w chorobach siatkówki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących zastępowania fotoreceptorów w genetycznym modelu istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez wykazanie integracji synaptycznej przeszczepionych komórek progenitorowych.
- Zapewnia funkcjonalną walidację celu dla terapii komórkowych w degeneracji siatkówki.
Przesiew i opracowanie testu
- Ustanawia powtarzalny schemat przygotowania i podawania żywych progenitorów fotoreceptorów.
- Umożliwia ilościową ocenę żywotności komórek i sukcesu iniekcji przy użyciu obrazowania OCT.
- Umożliwia standaryzację podawania podsiatkowego na potrzeby późniejszych badań nad skutecznością.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z przedklinicznymi modelami chorób w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez dostarczanie dowodów in vivo na integrację i przeżycie komórek.
- Służy do opracowywania biomarkerów dzięki potwierdzeniu lokalizacji komórek za pomocą obrazowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, przygotowanie testów oraz walidację translacyjną w genetycznym modelu degeneracji siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie mechanizmów zastępowania fotoreceptorów i integracji synaptycznej.
- Przesiew: Dostarcza ustandaryzowanych wskaźników żywotności i jakości wstrzyknięcia do oceny kandydatów.
- Analityka: Wykorzystuje obrazowanie OCT do ilościowej oceny dostarczenia i lokalizacji komórek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny i adaptacyjny protokół dla przyszłych kandydatów do terapii komórkowych celujących w choroby siatkówki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie skuteczności terapii komórkowej i zaangażowania celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w zakresie podania podsiatkówkowego.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach rozwoju procesów terapii komórkowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów w dziedzinie regeneracyjnej okulistyki w oparciu o dostosowanie do ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, ocenie żywotności komórek oraz technikach mikrochirurgicznych.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury, w tym obrazowania OCT i systemów mikroiniekcyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania komórek i iniekcji pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody do różnych modeli zwierzęcych lub typów komórek.
- Ograniczenia techniczne obejmują niewielki rozmiar oczu myszy oraz konieczność precyzyjnej kontroli iniekcji.
