Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie
21 listopada 2023
Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.
Nasze badania koncentrowały się na optymalizacji protokołu mIHC na wycinku parafiny uzyskanym ze źródeł klinicznych. Naszym celem było skuteczne rozwiązanie problemów z autofluorescencją i przesłuchami kanałów autofluorescencyjnych w tkance płucnej. Obecne wyzwania eksperymentalne, przed którymi stoimy, obejmują rozwiązanie problemów ultrafluorescencji i przesłuchów kanałowych w tkance płucnej, osiągając w ten sposób udaną lokalizację fluorescencji koloru, której potrzebują dla znakowanych komórek docelowych i białek.
Nasza wysoce wydajna metoda niwelacji wieloczynnikowego antygenu, która wymaga mniej niż trzech godzin na przeciwciało, bezproblemowo integruje system wielospektrometryczny i specjalistyczne oprogramowanie patologiczne. Ten zoptymalizowany protokół mIHC można łatwo dostosować do użytku w innych laboratoriach badawczych. Na początek należy zaopatrzyć się w wcześniej przygotowaną formułę oraz utrwalone i zatopione w parafinie szkiełko z próbką tkanki raka płuc.
Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przeprowadzić odwodnienie, zanurzając szkiełko w ksylenie, a następnie w roztworach etanolu o malejących stężeniach. Następnie zanurz szkiełka w wysterylizowanej wodzie trzy razy na minutę każda.
W celu pobrania antygenu umieść szkiełko w pudełku do barwienia i naprawy. Napełnij go immunohistochemicznym roztworem roboczym buforu naprawczego antygenu o pH sześć lub dziewięć. Przykryj pudełko pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez osiem minut przy 100% mocy.
Następnie schłodzić szkiełko do temperatury pokojowej. Przykryj tkankę roztworem blokującym, a następnie inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po usunięciu roztworu blokującego przykryj szkiełko pierwotnym roztworem roboczym przeciwciała i umieść je w wilgotnej komorze.
Następnie inkubuj tę komorę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełko roztworem roboczym buforu myjącego przez dwie minuty. Dodaj polimerową peroksydazę chrzaku bezpośrednio kroplami na szkiełko i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu szkiełka należy dodać roztwór roboczy fluoroforu bezpośrednio kroplami na szkiełko i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu szkiełka należy poddać je działaniu mikrofal, jak pokazano wcześniej. Gdy szkiełko zostanie schłodzone do temperatury pokojowej, umyj je trzy razy wodą podwójnie destylowaną przez jedną minutę każdy.
Następnie zanurzyć szkiełko w roztworze roboczym buforu płuczącego na dwie minuty i przeprowadzić inkubację przeciwciał, peroksydazę chrzanowa i dodanie fluoroforu, jak pokazano. W przypadku barwienia jądra komórkowego przykryj szkiełko roztworem roboczym DAPI i inkubuj je w wilgotnej komorze przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka podwójnie destylowaną wodą trzy razy po jednej minucie.
Usuń kropelki wody ze zjeżdżalni. Dodać od 10 do 20 mikrolitrów środka antyfluorescencyjnego do szkiełka i uszczelnić je szkłem nakrywkowym mikroskopu. Na początek należy zaopatrzyć się w przygotowane wcześniej barwione preparaty z próbkami tkanki raka płuc.
Aby automatycznie skanować zabarwione szkiełka, należy ręcznie ustawić czas naświetlania i program skanowania dla każdego kanału fluorescencji. Przeciągnij plik wielokolorowego obrazu fluorescencji uzyskany z oryginalnego skanu do oprogramowania i ustaw typ obrazu na Fluorescencja. Kliknij przycisk Kontrast jasności i sprawdź kanały na panelu.
Kliknij na zewnątrz, a następnie na kanale, aby wybrać interesujący Cię kanał fluorescencyjny. Przeciągnij minimalne i maksymalne wyświetlanie, aby dostosować jasność i kontrast każdego kanału. Po określeniu widoku do zapisania kliknij Pokaż przegląd slajdu i Pokaż położenie kursora, aby usunąć te dwie treści i zachować pasek skali.
Kliknij filet, a następnie Eksportuj migawkę i bieżącą zawartość przeglądarki, aby wyeksportować plik PNG. Niedrobnokomórkowe tkanki płaskonabłonkowe raka płuca wykazały, że makrofagi i limfocyty T CD8-dodatnie znacząco infiltrowały wokół i wewnątrz ognisk raka. Białko HMGCS1 wykazywało szeroką ekspresję w osoczu komórek raka płaskonabłonkowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten eksperymentalny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę barwienia immunohistochemicznego (IHC) wielokanałowego dla tkanek nowotworów płuca. Koncentracja jest skierowana na rozwiązywanie problemów z autofluorescencją i zakłóceniami między kanałami, aby poprawić wizualizacje komórek docelowych i białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Patologia
- Imunohistochemika
Tło
- Wielokanałowa immunohistochemia (mIHC) jest niezbędna do badania złożonych próbek tkankowych.
- Autofluorescencja może zasłonić wyniki w obrazowaniu fluorescencyjnym.
- Zakłócenia między kanałami komplikują interpretację wielokanałowych obrazów.
- Optymalizacja protokołów barwienia może poprawić czytelność wyników.
Cel badania
- Optymalizacja protokołu mIHC dla tkanek nowotworów płuca.
- Skuteczna likwidacja autofluorescencji i zakłóceń między kanałami.
- Opracowanie metody, która jest przystosowana do innych laboratoriów badawczych.
Stosowane metody
- Wykorzystanie próbek tkanek nowotworów płuca zawartych w parafinie.
- Optymalizacja warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych.
- Integracja wielospektralnego systemu emergentnego.
- Zastosowanie specjalistycznego oprogramowania patologicznego do analizy.
Główne wyniki
- Udane zmniejszenie autofluorescencji i zakłóceń między kanałami.
- Efektywny proces barwienia wymagający mniej niż trzech godzin na jedno przeciwciało.
- Zlepiona lokalizacja oznaczonych komórek docelowych i białek.
- Protokół wykazał się przystosowaniem do różnych ustawień laboratoryjnych.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół mIHC znacznie poprawia czytelność obrazów.
- Rozwiązywanie problemów z autofluorescencją i zakłóceniami jest kluczowe dla dokładnych wyników.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad patologią nowotworów płuca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multiplex immunohistochemistry (mIHC) enables high-content spatial profiling of protein expression in paraffin-embedded lung cancer tissues, addressing the complexity of the tumor microenvironment. By resolving autofluorescence and channel crosstalk, this protocol enhances the reliability of cell-type and pathway mapping critical for early discovery and translational research. The method supports robust target validation and biomarker assessment, informing portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved analysis of protein co-expression in tumor microenvironments.
- Supports functional validation of candidate targets through multiplexed detection.
- Improves mechanistic de-risking by clarifying cell-to-cell interactions in situ.
- Facilitates predictive confidence in pathway and target selection for oncology programs.
Screening & Assay Development
- Provides validated tissue-based systems for downstream multiplexed assay development.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for protein localization and abundance.
- Enables standardization of multiplex staining workflows across research teams.
- Supports screening readiness for high-throughput tissue analysis platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by validating protein expression in clinical samples.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation through spatial pathology insights.
- Reduces translational risk by confirming disease-relevant protein signatures in situ.
- Supports integration with high-throughput sequencing and proteomics data for comprehensive validation.
Pipeline & Workflow Integration
This mIHC protocol fits from early discovery through translational research, bridging target validation, assay development, and preclinical biomarker alignment in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via multiplexed protein detection in tumor tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-content spatial data for comparative analysis of cell populations and protein expression.
- Translational Research: Validates disease-relevant biomarkers and supports integration with omics datasets.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for diverse tissue types and research settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable multiplex staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biology insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and fluorescence imaging analysis.
- Needs access to multi-spectral imaging systems and specialized pathology software.
- Demands cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various paraffin-embedded tissue types with protocol optimization.
- Must address autofluorescence and channel crosstalk for accurate multiplex detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues
3:38
Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique
