Test mikrojądrowy na kriokonserwowanej krwi pełnej

Nasze badania skupiają się głównie na zbadaniu wpływu promieniowania jonizującego na zdrowe tkanki. Badamy chromosomalną wrażliwość radiową osób z rakiem i osób z zaburzeniami naprawy DNA. Dodatkowo zajmujemy się asymetrią biologiczną, w której oceniamy uszkodzenia DNA wywołane ekspozycją na promieniowanie jonizujące.

Aby posunąć naprzód badania w naszej dziedzinie, używamy zautomatyzowanych systemów mikroskopowych do analizy o wysokiej przepustowości. Progowe próbki krwi są najbardziej preferowanym typem próbki do testu mikrojądrowego, ponieważ są łatwe do uzyskania przy minimalnym dyskomforcie dla pacjenta. Jednak konieczność natychmiastowego przetwarzania może być wyzwaniem logistycznym w przypadku ograniczeń czasowych.

Zamrożenie pełnych próbek krwi pozwala na wielokrotną analizę bez konieczności dodatkowego pobierania próbek. Procedura ta jest łatwym i efektywnym czasowo sposobem przechowywania próbek krwi w badaniach na dużą skalę i wieloośrodkowych. Protokół kriokonserwacji krwi pełnej przyniesie korzyści nie tylko w teście mikrojądrowym, ale także w innych testach cytogenetycznych lub testach funkcjonalnych, które wymagają proliferacji limfocytów.

Aby przygotować studzienki hodowlane, należy oznaczyć pokrywkę płytki 24-dołkowej kodem dawcy A lub B, datą i dawką. Wyjąć fiolki kriogeniczne zawierające ludzką krew z ciekłego azotu i częściowo rozmrozić je w ciepłej łaźni wodnej, aż pojawią się małe kryształki lodu. Następnie w kapturze z przepływem laminarnym ostrożnie otworzyć fiolkę, aby zapobiec rozlaniu się pęcherzyków powietrza do wnętrza probówki.

Ponownie zawiesić i przenieść zawartość fiolki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Delikatnie obracając rurkę kroplami, dodaj jeden mililitr podgrzanego PBS. Użyj pipety P 1000 do wymieszania PBS i krwi.

W celu rozcieńczenia i równomiernego przemycia dodać siedem mililitrów wstępnie podgrzanego PBS do 15-mililitrowej probówki i wymieszać pipetując. Odwirować krew o stężeniu 180 G przez osiem minut. W międzyczasie napełnij nieoznakowane studzienki 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami PBS i podgrzej płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około jednego mililitra w probówce, nie naruszając osadu. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w pozostałym supernatancie. Następnie stopniowo dodawaj osiem mililitrów ciepłego PBS do probówki, jak pokazano wcześniej.

Odwirować ponownie zawieszoną krew. W międzyczasie dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej RPMI do zaznaczonych dołków i podgrzej płytkę, jak pokazano. Po odwirowaniu usunąć supernatant, pozostawiając około 80 mikrolitrów supernatantu.

Następnie dodaj 280 mikrolitrów płodowej surowicy cielęcej i ponownie zawiesić osad. Przenieś 180 mikrolitrów zawiesiny komórek do oznaczonych studzienek. Inkubować płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po wyhodowaniu rozmrożonej, kriokonserwowanej próbki krwi, należy ją napromieniować wymaganymi dawkami promieniowania rentgenowskiego w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 1,62 mililitra ciepłej pożywki hodowlanej RPMI do każdej studzienki. Aby stymulować podział komórek w limfocytach T, dodaj 40 mikrolitrów fitohemaglutyny do każdej studzienki i dokładnie zawiesij.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez 23 godziny. Następnego dnia dodaj osiem mikrolitrów cytochalazyny B na studzienkę, aby zablokować cytokinezę. Po 70 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Przepłucz każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS i dodaj ten PBS do 15-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 180 G przez osiem minut i odrzucić supernatant, pozostawiając 500 mikrolitrów na osadzie. Podczas wirowania granulki dodaj dwa mililitry zimnego chlorku potasu do probówki.

Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. Zwiruj osad, powoli dodając dwa mililitry zimnego utrwalacza, jeden i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować i wyrzucić supernatant.

Podczas wirowania granulatu kroplami, dodaj dwa mililitry zimnego utrwalacza dwa do probówki. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować próbkę i przenieść supernatant do innej probówki w celu zagęszczenia komórek zgodnie z wielkością osadu.

Wyczyść szkiełka izopropanolem i odpowiednio je oznacz. Po zawirowaniu osadu dodać 40 mikrolitrów zawiesiny o stałych komórkach na szkiełko. Po wyschnięciu zanurz szkiełko w plamie pomarańczy akrydynowej na jedną minutę.

Następnie szybko umyj szkiełko wodą destylowaną przed umieszczeniem go w buforze fosforanowym na jedną minutę. Osusz tył szkiełka i umieść go na czystej bibułce. Dodać 20 mikrolitrów buforu fosforanowego na szkiełko podstawowe i przykryć je czystym szkiełkiem nakrywkowym, unikając pęcherzyków powietrza.

Uszczelnij tę szkiełko cementem silikonowym. Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i zbadaj komórki dwujądrowe. Na koniec ręcznie policz mikrojądra.

Obecność zaokrąglonych komórek dwujądrowych wskazywała na pomyślne pobranie zdrowych, żywotnych komórek z kriokonserwowanych próbek krwi pełnej. Przy zwiększonych dawkach promieniowania zaobserwowano liniowy kwadratowy wzrost wydajności mikrojąder. Wydajność mikrojąder tła w pozorowanych napromieniowanych próbkach kontrolnych wynikała głównie z opóźnionych chromosomów.