Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania
17 listopada 2023
Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.
Przewlekłe rany i wielkopowierzchniowe ubytki skóry stanowią poważne obciążenie kliniczne o ograniczonych możliwościach terapeutycznych. Naszym celem jest zbadanie możliwości wykorzystania łatwo dostępnego źródła komórek autologicznych, jakim jest tkanka tłuszczowa, jako możliwej możliwości leczenia. Frakcja naczyniowa zrębu jest izolowana z tkanki tłuszczowej uzyskanej przez wycięcie lub liposukcję.
Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu jest stosowana jako alternatywa dla przetwarzanego enzymatycznie SVF w celu ominięcia problemów, z którymi boryka się pozaustrojowa obróbka laboratoryjna. Typowe problemy to długi czas przetwarzania, ryzyko zanieczyszczenia i poniesione koszty. Wierzymy, że zróżnicowane zdolności regeneracyjne komórek MSVF oraz korzystne połączenie z hydrożelem fibrynowym może zapewnić innowacyjne podejście do usprawnienia procesów gojenia się ran.
Ogólnie rzecz biorąc, podejście to pozwala na skuteczne miejscowe dostarczanie żywych komórek MSVF. W przyszłości zajmiemy się tym, jak przełożyć zdobytą wiedzę na warunki kliniczne, a w szczególności na wpływ każdego typu komórek reprezentowanych w SVF w stanie patologicznym in vitro. Aby rozpocząć w okapie do hodowli komórkowych, dodaj zebrany lipoaspirat do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Przenieś lipoaspirat do sterylnej 20-mililitrowej strzykawki z blokadą przynęty. Następnie podłącz łącznik 1,4 milimetra do strzykawki. Teraz przymocuj drugą 20-mililitrową strzykawkę blokującą przynętę do przeciwległej strony złącza.
Przepchnąć tkankę tłuszczową z jednej strzykawki do drugiej około 30 razy. Następnie przenieś zemulgowany tłuszcz do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj tłuszcz w temperaturze 500 x g przez 10 minut.
Następnie wyrzuć tłustą warstwę wierzchnią. Zbierz centralną oczyszczoną warstwę zawierającą oddzieloną warstwę naczyniową zrębu i przenieś ją do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Teraz napełnij probówkę wirówkową uzupełnionym DMEM do znaku 40 mililitrów.
Ponownie odwiruj probówkę o mocy 500 x g przez pięć minut. Zbierz powstałą warstwę MSVF i przenieś ją do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra odpipetuj 100 mikrolitrów izolowanej frakcji naczyniowej zrębu.
Do tego dodaj 10 mikrolitrów trombiny, a następnie odpipetuj 10 mikrolitrów chlorku wapnia. Na koniec dodaj 70 mikrolitrów kwasu traneksamowego do mieszanki za pomocą świeżej końcówki pipety. Dodaj 10 mikrolitrów fibrynogenu do probówki na krótko przed aplikacją.
Po polimeryzacji mieszaniny hydrożelu MSVF należy odpipetować 200 mikrolitrów hydrożelu do płytki 12-dołkowej do celów analitycznych. Teraz dodaj 100 mikrolitrów hydrożelu fibryny do jednego dołka jako kontrolę ujemną. Inkubować 12-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.
Następnie dodaj 1 mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki, umieść 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze na cztery godziny. Dodaj 1 mililitr rezazuryny do każdej studzienki przed ponowną inkubacją przez 24 godziny. Pobrać pipetować próbki rezazyny do płytki 96-dołkowej.
Następnego dnia użyj wielomodowego czytnika mikropłytek do obrazowania komórek, aby zmierzyć pierwszą intensywność fluorescencji. Do analizy histologicznej w pierwszym, trzecim i siódmym dniu inkubuj hydrożel fibrynowy w 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu. Teraz dodaj 1% PBS do talerza i przechowuj go w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Test rezazuryny przeprowadzono w celu ilościowego określenia zmienności komórek in vitro frakcji naczyniowej i hydrożelu. Frakcja naczyniowa wykazała zmniejszoną żywotność w trzecim dniu, podczas gdy kombinacja hydrożelu fibryny MSVF pozostała zbliżona do wartości wyjściowej. Do siódmego dnia żywotność MSVF spadła, podczas gdy kombinacja hydrożelu fibrynowego MSVF wzrosła.
Analiza histologiczna nie wykazała zmniejszenia liczby jąder komórkowych w trzecim i siódmym dniu. Hydrożel fibrynowy wykazywał minimalną degradację z równomiernie rozmieszczonymi widocznymi skupiskami komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje zastosowanie mechanicznie izolowanej frakcji naczyniowo-stromalnej (mSVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym jako nośnikiem dla żywych komórek stromalnych pochodzenia tłuszczowego. To innowacyjne podejście ma na celu usprawnienie procesów gojenia ran oraz leczenie ran przewlekłych i rozległych defektów skóry.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Gojenie ran
Wstęp
- Przewlekłe rany oraz rozległe ubytki skóry stanowią istotne wyzwanie kliniczne.
- Obecne opcje terapeutyczne są ograniczone, co sprawia, że konieczne jest poszukiwanie alternatywnych podejść.
- Frakcję naczyniowo-stromalną (SVF) można wyizolować z tkanki tłuszczowej poprzez wycięcie lub liposukcję.
- Mechanicznie izolowana SVF oferuje szereg zalet w porównaniu z SVF przetwarzaną enzymatycznie.
Cel badania
- Zbadanie potencjału mSVF jako łatwo dostępnego autologicznego źródła komórek.
- Ocena połączenia mSVF z hydrożelem fibrynowym w celu wzmocnienia efektów terapeutycznych.
- Zaproponowanie innowacyjnego rozwiązania w celu usprawnienia procesów gojenia ran.
Zastosowane metody
- Izolacja frakcji naczyniowo-stromoalnej z tkanki tłuszczowej.
- Przygotowanie konstruktów hydrożelowych mSVF-fibryna.
- Ocena zdolności regeneracyjnych komórek mSVF.
- Ocena skuteczności w zastosowaniach w leczeniu ran.
Główne wyniki
- mSVF wykazuje zróżnicowane właściwości regeneracyjne.
- Połączenie z hydrożelem fibrynowym usprawnia proces gojenia.
- Mechaniczna izolacja SVF skraca czas przetwarzania i zmniejsza ryzyko kontaminacji.
- Podejście to stanowi kosztowo efektywne rozwiązanie w zastosowaniach klinicznych.
Wnioski
- mSVF w połączeniu z hydrożelem fibrynowym stanowi obiecującą strategię inżynierii tkankowej.
- Metoda ta może znacząco poprawić wyniki leczenia pacjentów z ranami przewlekłymi.
- Wskazane są dalsze badania w celu pełnego poznania potencjału tej metody w warunkach klinicznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowo-stromo (mSVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje usprawnione i zgodne z wymogami regulacyjnymi podejście do dostarczania żywych komórek stromy pochodzących z tkanki tłuszczowej w badaniach nad regeneracją. Niniejszy protokół odnosi się do kluczowych problemów w zakresie pozyskiwania komórek, zachowania ich żywotności oraz integracji z rusztowaniem w translacyjnych modelach gojenia ran. Metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnych etapach inżynierii tkankowej i minimalizuje ryzyko w procesach rozwoju terapii opartych na komórkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju (B&R) biofarmaceutyków
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie populacji komórek regeneracyjnych w kontrolowanym środowisku rusztowania.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez utrzymanie żywotności i rozmieszczenia komórek wewnątrz hydrożeli.
- Ułatwia walidację funkcjonalną udziału komórek zrębowych w naprawie tkanek.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zestandaryzowane konstrukty mSVF-fibryny do powtarzalnych testów żywotności in vitro.
- Umożliwia ilościową ocenę przeżywalności komórek z wykorzystaniem odczytów opartych na rezazurynie.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy do przesiewania związków lub biomateriałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami gojenia ran istotnymi dla danej choroby, co umożliwia translacyjne badania nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość procesu, od izolacji komórek, poprzez integrację z rusztowaniem, aż po walidację przedkliniczną.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju projektu poprzez wykazanie przeżywalności komórek w rusztowaniu w czasie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obejmuje etapy od wczesnego odkrycia po rozwój modeli przedklinicznych, wspierając procesy badawcze w zakresie inżynierii tkankowej, medycyny regeneracyjnej oraz badań nad gojeniem ran.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących potencjału regeneracyjnego komórek stropowych wewnątrz ochronnego rusztowania.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki żywotności do porównań między różnymi warunkami.
- Analityka: Dostarcza pomiary żywotności oparte na fluorescencji oraz dane histologiczne dotyczące rozmieszczenia komórek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z przedklinicznymi modelami gojenia ran poprzez dostarczanie komórek wspieranych przez rusztowanie.
- Zastosowania przemysłowe: Oferuje modułowy, adaptowalny protokół dla różnorodnych komórkowych zastosowań regeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstw
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie żywotności komórek i funkcji regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Skraca czas przetwarzania, zmniejsza ryzyko kontaminacji oraz uproszcza wymogi regulacyjne.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad kandydatami do terapii komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana biegłość w sterylnej izolacji komórek i przygotowaniu rusztowań.
- Wymagany dostęp do wirówki, aparatury do hodowli komórkowych oraz fluorescencyjnego czytnika płytek.
- Wymagana standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników przeżywalności i badań histologicznych.
- Metoda dostosowalna do różnych źródeł tkanki tłuszczowej oraz modeli gojenia ran.
- Ograniczona przez uwarunkowania modelu in vitro oraz kinetykę degradacji rusztowania.
