Name: Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji mechanicznej frakcji zrębu naczyniowego z tkanki tłuszczowej i jej połączenia z hydrożelem fibrynowym w celu przyspieszenia gojenia ran przewlekłych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bong-Sung Kim jest wspierany przez Niemiecką Fundację Badawczą (KI 1973/2-1) oraz Fundację Novartis na rzecz Badań Medyczno-Biologicznych (#22A046).

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszyscy dorośli dawcy wyrazili pisemną świadomą zgodę na dalsze wykorzystanie pobranych próbek tkanek. Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach naszej instytucji.
1. Pobieranie tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Zbierz tkankę tłuszczową, wykonując standardową liposukcję w konwencjonalnej technice zbierania tłuszczu opisanej w poprzednich publikacjach26,27. Upewnij się, że używasz roztworu tumescencyjnego, który składa się ze zwykłego mleczanu Ringera i epinefryny w stosunku 1: 200 000.</li>
	<li>Wykonaj liposukcję za pomocą kaniuli aspiracyjnej 4 mm, pod wpływem podciśnienia i wibracji, do sterylnego worka. Zebrany tłuszcz należy natychmiast przenieść do laboratorium.</li>
</ol>
2. Izolacja mSVF
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności (sekcje 2 i 3) w okapie do hodowli komórkowych, aby zapewnić aseptyczne miejsce pracy. Noś zwykły fartuch laboratoryjny i rękawice, aby zapewnić poziom bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną: Uzupełnij 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy z 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Przenieść lipoaspirat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przenieść lipoaspirat do sterylnej strzykawki Luer-lock o pojemności 20 ml i założyć łącznik 1,4 mm. Upewnić się, że wewnątrz strzykawki nie znajduje się powietrze.</li>
	<li>Podłącz drugą strzykawkę Luer-lock o pojemności 20 ml do przeciwległej strony złącza 1,4 mm.</li>
	<li>Przepchnij tkankę tłuszczową z jednej strzykawki do drugiej, w sumie 30 razy.</li>
	<li>Przenieść zemulgowany tłuszcz do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zemulgowany tłuszcz w stężeniu 500 x g przez 10 min.</li>
	<li>Po odwirowaniu wyrzuć tłustą warstwę wierzchnią. Następnie zbierz centralnie oczyszczoną warstwę mSV. Przenieś go do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odrzuć fazę wodną.</li>
	<li>Napełnić probówkę wirówkową pożywką hodowlaną (od kroku 2.2) do oznaczenia 40 ml.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirówkową w wirówce i ponownie wirować przy 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać powstałą warstwę mSVF i przenieść ją do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
3. Produkcja hydrożelu mSVF-fibryna
<ol>
	<li>Połącz 100 μl mSVF z 10 μl trombiny (100 U/ml), 10 μl CaCl2 (80 mM) i 70 μl kwasu traneksamowego (100 mg/ml) w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Za pomocą świeżej końcówki pipety dodaj 10 μl fibrynogenu (100 mg/ml) jako ostatni składnik, na krótko przed aplikacją. Należy pamiętać, że polimeryzację hydrożelową obserwuje się w ciągu około 10-30 s.</li>
	<li>W przypadku stosowania klinicznego należy wykonać ten ostatni krok na krótko przed podaniem miejscowym, najlepiej przy łóżku pacjenta. Do celów analitycznych przenieść do płytki 12-dołkowej przez pipetowanie.</li>
</ol>
4. Test żywotności i histologia
<ol>
	<li>Odpipetować 200 μl mieszaniny mSVF-hydrożel z kroku 3.3 do jednego dołka na płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl próbki pobranej z kolekcji mSVF (krok 2.12) do jednego dołka jako kontrola pozytywna.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl hydrożelu fibrynowego tylko do jednego dołka jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Umieścić 12-dołkową płytkę w zwykłym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut.</li>
	<li>Po tym czasie dodaj 1 ml rezazuryny (błękit alamarowy o stężeniu 10%, rozcieńczony w pożywce hodowlanej) do każdej studzienki.</li>
	<li>Po dodaniu inkubować 12-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach zmierzyć pierwszą intensywność fluorescencji za pomocą wielomodowego czytnika mikropłytek do obrazowania komórek przy użyciu długości fali wzbudzenia 555 nm i długości fali emisji 596 nm.</li>
	<li>Wykonaj kolejne pomiary intensywności fluorescencji w dniach 3 i 7.</li>
	<li>Jeśli konieczna jest ocena histologiczna, należy przerwać eksperyment w dniach 1, 3 i 7 i utrwalić hydrożel fibrynowy w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Po utrwaleniu dodać 1% soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zanurz hydrożele w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój zamrożone bloki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu. Wybarwić skrawki roztworem hematoksyliny i eozyny (H&E) zgodnie ze standardowymi protokołami28.</li>
</ol>

Mechanical Stromal Vascular Fraction in Fibrin Hydrogel for Regenerative Medicine

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mechaniczna izolacja SVF stanowi elegancką alternatywę dla tradycyjnego podejścia enzymatycznego i oferuje szeroki dostęp do zastosowań klinicznych29. W rzeczywistości mSVF, jak zaproponowano w niniejszym manuskrypcie, jest już w użyciu klinicznym w leczeniu blizn w tkankach miękkich lub jako środek wspomagający zabiegi kosmetyczne30. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia prostą metodę skutecznego miejscowego dostarczania żywotnych komórek mSVF. Podczas gdy kontrola pozytyw...

W ciągu ostatnich kilku lat, regeneracyjna chirurgia plastyczna pojawiła się jako dodatkowy filar chirurgii plastycznej1. Regeneracyjna chirurgia plastyczna ma na celu odbudowę uszkodzonej tkanki poprzez transfer rozpuszczalnych czynników, komórek i tkanek pobranych od pacjenta w celu wspomagania odbudowy tkanek w minimalnie inwazyjny sposób2. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) zyskały uwagę ze względu na ich zdolność do różnicowania się w wiele linii mezenchymalnych, co czyni je obiecującym kandydatem do badań nad medycyną regeneracyjną3. Ich profil cytokin wykazuje działanie angiogenne, immunosupresyjne i antyoksydacyjne4.
Tradycyjnie, ASC zostały wyizolowane z tkanki tłuszczowej za pomocą podejścia enzymatycznego z kolagenazą, co dało frakcję naczyniową zrębu (SVF), która następnie została wyhodowana w celu uzyskania ASC. Te technologie laboratoryjne są kosztowne, czasochłonne i, co ważne, podlegają ścisłym ograniczeniom regulacyjnym, co komplikuje tłumaczenie kliniczne5,6,7. W przeciwieństwie do tego, protokoły mechanicznie izolowanej frakcji zrębowej (mSVF) oferują korzyści kliniczne nie tylko w postaci ominięcia problemów regulacyjnych, ale także zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia8,9.
Opisano liczne protokoły mechanicznego izolowania SVF10. Spośród nich najwięcej uwagi wśród chirurgów regeneracyjnych zyskał protokół zmiany opublikowany przez Tonnarda i wsp., 11. Tłuszcz zebrany za pomocą standardowych procedur liposukcji, znanych jako lipoaaspiraty, może być przenoszony między dwiema ręcznymi strzykawkami podłączonymi do urządzenia łączącego, w wyniku czego powstaje płynna postać określana jako nanotłuszcz. Oczywiste korzyści płynące z tych protokołów izolacji mSVF obejmują skrócony czas przetwarzania, minimalne ryzyko zanieczyszczenia, ponieważ cała procedura odbywa się w dobrze kontrolowanym środowisku, oraz możliwe natychmiastowe tłumaczenie kliniczne12.
Dowody przedkliniczne i kliniczne wskazują, że właściwości mSVF, w tym żywotność komórek i właściwości gojenia się ran, są porównywalne ze standardowymi metodami izolacji enzymatycznej12. Potencjał mSVF w promowaniu gojenia się ran w modelach szczurzych i mysich został potwierdzony w badaniach in vivo przez Chen et al. i Sun et al.13,14. Brakuje jednak dostępnych danych dotyczących gojenia się ran w warunkach klinicznych. Obiecujące wyniki uzyskano, gdy grupa badawcza przeprowadziła autologiczny przeszczep tłuszczu u 83-letniego pacjenta, który miał ranę z odsłoniętym implantem w otwartym złamaniu kończyny dolnej15. Ponadto Lu i wsp. przeprowadzili porównanie między mSVF a terapią ran podciśnieniowych w kohorcie 20 pacjentów z ranami przewlekłymi16. Ich odkrycia wykazały, że leczenie mSVF skutkowało szybszym tempem gojenia się ran w porównaniu z terapią ran pod ujemnym ciśnieniem16. W obu wymienionych badaniach wstrzykiwano mSVF samodzielnie lub w połączeniu z żelem w docelowy obszar rany15,16.
W rzeczywistym scenariuszu, kliniczne zastosowanie mSVF jest ograniczone ze względu na nieprzewidywalne tempo wchłaniania w miejscach biorczych17,18. Rusztowania obiecują remedium na ten problem, ponieważ pomagają w utrzymaniu komórek, unaczynieniu i integracji z otaczającą tkanką19,20,21. Hydrożele fibrynowe są powszechnie stosowanym, zatwierdzonym przez FDA narzędziem stosowanym w dyscyplinach chirurgicznych i wykazano, że są skutecznym nośnikiem mSVF19. Żel fibrynowy jest materiałem biopolimerowym, który ma kilka zalet w funkcjonowaniu jako nośnik komórek: wykazuje doskonałą biokompatybilność, wspomaga przyłączanie komórek i jest zdolny do kontrolowanej degradacji22,24,25. Dodatkowo wykazuje minimalną reakcję zapalną i reakcję ciała obcego i jest łatwo wchłaniany podczas naturalnego przebiegu gojenia się ran22. Wierzymy, że wspomniane różnorodne zdolności regeneracyjne komórek mSVF oraz korzystne połączenie z hydrożelem fibrynowym może zapewnić innowacyjne podejście do usprawnienia procesów gojenia się ran. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to pozwala na skuteczne miejscowe dostarczanie żywotnych komórek mSVF. Przedstawiamy protokół, który łączy mSVF z hydrożelem fibrynowym przeznaczonym do stosowania w celu gojenia ran.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa</td><td>płytka Sarstedt</td><td>83.3921</td><td></td></tr><tr><td>4&,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Biochemica</td><td>A1001.0010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL-Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki chłonne, dwupak</td><td>Fału</td><td>89701</td><td></td></tr><tr><td>Alamar niebieski 25 ml</td><td>Albumina Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr>, <tr><td>bydlęca (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja Biotek 5&nbsp;</td><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek do obrazowania komórek</td> <td>Agilent</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microtome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM z 4,5 g / L glukozy, z L-glutaminą, z pirogronianem sodu</td><td>VWR</td><td>392-0416</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epinephrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biowest</td><td>S181H-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen Osocze ludzkie 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341576-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Formalina 4%</td><td>Formafix</td><td>1308069</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22-Einbettmedium, blau</td><td>Biosystems</td><td>3801481S</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina & Roztwór eozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136 / HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Dzwonek z mleczanami" s Roztwór 1000 ml</td><td>B Braun</td><td>R5410-01</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula Mercedes 4mm</td><td>MicroAire</td><td>PAL-R404LL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Bbraun</td><td>570160</td><td></td></tr><tr><td>OCT Matryca do zatapiania 125 ml</td><td>CellPath</td><td>KMA-0100-00A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 150mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1803</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488 Odczynnik</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka 20 ml Luer</td><td>HENKE-JECT</td><td>5200-000V0</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka 30 ml Luer-Lock</td><td>BD</td><td>10521</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884-100UN</td><td></td></tr><tr><td>Kwas traneksamowy</td><td>Orpha Swiss</td><td>6837093</td><td></td></tr><tr><td>Tulipfilter 1.2</td><td>Lencion Chirurgiczny</td><td>ATLLLL</td><td></td></tr><tr><td>Tulipanowiec 1.4</td><td>Lencion Chirurgiczny</td><td>ATLLLL</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

The Combination of Mechanically Isolated Stromal Vascular Fraction and Fibrin Hydrogel: A Processing Protocol

Potencjał regeneracyjny komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) zyskał znaczną uwagę w badaniach regeneracyjnych i translacyjnych. W przeszłości ekstrakcja tych komórek z tkanki tłuszczowej wymagała wieloetapowego procesu opartego na enzymach, w wyniku którego powstała heterogeniczna mieszanka komórek składająca się z ACS i innych komórek, które są wspólnie nazywane frakcją naczyniową zrębu (SVF). Niedawno wprowadzone protokoły izolacji mechanicznej SVF (mSVF) są mniej czasochłonne i omijają problemy regulacyjne. Niedawno zaproponowaliśmy protokół, który generuje mSVF bogaty w komórki zrębu w oparciu o połączenie emulgacji i wirowania. Jednym z aktualnych problemów w zastosowaniu mSVF do leczenia ran jest brak rusztowania zapewniającego ochronę przed mechaniczną manipulacją i wysuszeniem. W przeszłości wykazano, że hydrożele fibrynowe są użytecznym dodatkiem w przenoszeniu komórek do celów gojenia się ran. W niniejszej pracy nakreślamy etapy przygotowania konstruktu hydrożelu mSVF-fibryna jako nowatorskie podejście do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Test rezazurynowy 
W pierwszej kolejności zbadano żywotność komórek mSVF in vitro. W tym celu przeprowadzono test żywotności komórek z użyciem rezazuryny w dniach 0, 3 i 7. Żywotność komórek w dniach 0, 3 i 7 dla łącznie czterech próbek przedstawiono na Rysunku 1. Wartości z dnia 0 posłużyły jako punkt odniesienia i zostały przyjęte jako 100%. W dniu 3 w kontroli pozytywnej (mSVF) odnotowano niewielki spadek do 78,92% (± 5,33%), podczas gdy kombinacja mSVF-hydroż...

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

The regenerative potential of adipose-derived stromal cells (ASCs) has gained significant attention in regenerative and translational research. In the ...

Przewlekłe rany i wielkopowierzchniowe ubytki skóry stanowią poważne obciążenie kliniczne o ograniczonych możliwościach terapeutycznych. Naszym celem jest zbadanie możliwości wykorzystania łatwo dostępnego źródła komórek autologicznych, jakim jest tkanka tłuszczowa, jako możliwej możliwości leczenia. Frakcja naczyniowa zrębu jest izolowana z tkanki tłuszczowej uzyskanej przez wycięcie lub liposukcję.Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu jest stosowana jako alternatywa dla przetwarzanego enzymatycznie SVF w celu ominięcia problemów, z którymi boryka się pozaustrojowa obróbka laboratoryjna. Typowe problemy to długi czas przetwarzania, ryzyko zanieczyszczenia i poniesione koszty. Wierzymy, że zróżnicowane zdolności regeneracyjne komórek MSVF oraz korzystne połączenie z hydrożelem fibrynowym może zapewnić innowacyjne podejście do usprawnienia procesów gojenia się ran.Ogólnie rzecz biorąc, podejście to pozwala na skuteczne miejscowe dostarczanie żywych komórek MSVF. W przyszłości zajmiemy się tym, jak przełożyć zdobytą wiedzę na warunki kliniczne, a w szczególności na wpływ każdego typu komórek reprezentowanych w SVF w stanie patologicznym in vitro. Aby rozpocząć w okapie do hodowli komórkowych, dodaj zebrany lipoaspirat do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Przenieś lipoaspirat do sterylnej 20-mililitrowej strzykawki z blokadą przynęty. Następnie podłącz łącznik 1,4 milimetra do strzykawki. Teraz przymocuj drugą 20-mililitrową strzykawkę blokującą przynętę do przeciwległej strony złącza.Przepchnąć tkankę tłuszczową z jednej strzykawki do drugiej około 30 razy. Następnie przenieś zemulgowany tłuszcz do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj tłuszcz w temperaturze 500 x g przez 10 minut.Następnie wyrzuć tłustą warstwę wierzchnią. Zbierz centralną oczyszczoną warstwę zawierającą oddzieloną warstwę naczyniową zrębu i przenieś ją do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Teraz napełnij probówkę wirówkową uzupełnionym DMEM do znaku 40 mililitrów.Ponownie odwiruj probówkę o mocy 500 x g przez pięć minut. Zbierz powstałą warstwę MSVF i przenieś ją do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra odpipetuj 100 mikrolitrów izolowanej frakcji naczyniowej zrębu.Do tego dodaj 10 mikrolitrów trombiny, a następnie odpipetuj 10 mikrolitrów chlorku wapnia. Na koniec dodaj 70 mikrolitrów kwasu traneksamowego do mieszanki za pomocą świeżej końcówki pipety. Dodaj 10 mikrolitrów fibrynogenu do probówki na krótko przed aplikacją.Po polimeryzacji mieszaniny hydrożelu MSVF należy odpipetować 200 mikrolitrów hydrożelu do płytki 12-dołkowej do celów analitycznych. Teraz dodaj 100 mikrolitrów hydrożelu fibryny do jednego dołka jako kontrolę ujemną. Inkubować 12-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.Następnie dodaj 1 mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki, umieść 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze na cztery godziny. Dodaj 1 mililitr rezazuryny do każdej studzienki przed ponowną inkubacją przez 24 godziny. Pobrać pipetować próbki rezazyny do płytki 96-dołkowej.Następnego dnia użyj wielomodowego czytnika mikropłytek do obrazowania komórek, aby zmierzyć pierwszą intensywność fluorescencji. Do analizy histologicznej w pierwszym, trzecim i siódmym dniu inkubuj hydrożel fibrynowy w 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu. Teraz dodaj 1% PBS do talerza i przechowuj go w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Test rezazuryny przeprowadzono w celu ilościowego określenia zmienności komórek in vitro frakcji naczyniowej i hydrożelu. Frakcja naczyniowa wykazała zmniejszoną żywotność w trzecim dniu, podczas gdy kombinacja hydrożelu fibryny MSVF pozostała zbliżona do wartości wyjściowej. Do siódmego dnia żywotność MSVF spadła, podczas gdy kombinacja hydrożelu fibrynowego MSVF wzrosła.Analiza histologiczna nie wykazała zmniejszenia liczby jąder komórkowych w trzecim i siódmym dniu. Hydrożel fibrynowy wykazywał minimalną degradację z równomiernie rozmieszczonymi widocznymi skupiskami komórek.

the-combination-mechanically-isolated-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Poznaj metodę izolacji mechanicznej frakcji zrębu naczyniowego z tkanki tłuszczowej i jej połączenia z hydrożelem fibrynowym w celu przyspieszenia gojenia ran przewlekłych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Przeglądaj więcej filmów