Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek
19 stycznia 2024
Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.
Niska żywotność komórkowa i większe szczątki komórkowe to główne trudności w dysocjacji tkanki naczyniowej. Nasza dwuetapowa metoda trawienia komórkowego jest bardzo odpowiednia do dysocjacji tkanek szyjnych i może być stosowana do przygotowywania zawiesin jednokomórkowych dla innych naczyń z niewielkimi modyfikacjami, co czyni ją bardzo pomocną w badaniach sercowo-naczyniowych. Protokół ten jest odpowiedni do uzyskiwania wielu typów komórek w tętnicy szyjnej i można go łatwo powtórzyć bez specjalnego sprzętu.
W przyszłości zamierzamy wykorzystać subkulturę komórkową odkrytą dzięki sekwencjonowaniu żelaza w pojedynczych komórkach do celowanej terapii chorób sercowo-naczyniowych. Na początek spryskaj uśpioną mysz 75% alkoholem. Następnie użyj wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć skórę i odsłonić jamę klatki piersiowej.
Wytnij membranę. Następnie kontynuuj cięcie w górę w kierunku dolnej szczęki i ostrożnie usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu, odsłaniając tętnicę szyjną. Następnie przetnij żyłę główną dolną, aby krew wypłynęła z zamkniętego krążenia.
Za pomocą strzykawki powoli wstrzyknąć 20 mililitrów wstępnie schłodzonego roztworu perfuzyjnego do lewej komory. Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie za pomocą nożyczek do mikropreparowania oderwij tłuszcz i tkankę łączną wokół tętnicy szyjnej. Odizoluj tętnicę szyjną i przemyj ją PBS, aby wypłukać resztki krwi.
Przenieś tętnicę na sześciodołkową płytkę zawierającą 1,5% FBS na lodzie. Za pomocą nożyczek do mikropreparowania wypreparuj tętnicę szyjną wzdłużnie i umieść ją płasko na nowej sześciodołkowej płytce zawierającej jeden mililitr FBS na lodzie. Ostrożnie przepłucz błonę wewnętrzną tętnicy FBS, aby usunąć resztki krwi.
Przetnij tętnicę na dwa milimetrowe kwadratowe kawałki tkanki i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przy 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zanurzyć tkanki na dnie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić tkanki w 500 mikrolitrach odczynnika dysocjacyjnego A. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę, delikatnie pipetując pipetą o pojemności jednego mililitra co 10 minut.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów 5% FBS do probówki i dobrze wymieszaj. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sterylne sitko do komórek o grubości 40 mikronów do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie odwiruj filtrat i usuń supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 200 mikrolitrach odczynnika dysocjacyjnego B. Umieść probówkę w łaźni wodnej, aby całkowicie zdysocjować komórki w zawiesinę jednokomórkową. Po pięciu minutach dodaj 200 mikrolitrów 5% FBS, aby zakończyć reakcję trawienia.
Odwirować zawiesinę i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 100 mikrolitrach PBS na lodzie. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że połączenie odczynnika dysocjacyjnego B z odczynnikiem A prowadziło do dokładniejszej dysocjacji tkanki tętnicy szyjnej w porównaniu z użyciem samego odczynnika dysocjacyjnego A. W sumie 176 000 pojedynczych komórek pobrano z dziewięciu lewych tętnic szyjnych, przy czym większość naczyń krwionośnych została z powodzeniem zdysocjowana na pojedyncze komórki o wysokiej żywotności.
Po trawieniu, nienadzorowane grupowanie oparte na CIARA ujawniło cztery główne typy komórek w normalnych tętnicach szyjnych myszy.
Przegląd
To badanie zajmuje się wyzwaniami niskiej żywotności komórek i dużych zanieczyszczeń w dysocjacji tkanki naczyniowej, prezentując dwuetapową procedurę trawienia komórek specyficzną dla tętnic szyjnych myszy. Protokół daje wysoko żywotną zawiesinę pojedynczych komórek, która może być przystosowana do innych naczyń, rozwijając techniki w badaniach nad układem krążenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Badania nad układem krążeniem
- Metody dysocjacji komórek
- Analiza pojedynczych komórek
Tło
- Typowymi problemami przy dysocjacji tkanki naczyniowej są niska żywotność komórek i duże zanieczyszczenia.
- Skuteczna metoda dysocjacji jest kluczowa dla badania różnych typów komórek w naczyniach krwionośnych.
- Poprzednie protokoły mogą brakować przystosowania lub wymagać specjalistycznego sprzętu.
Stosowane metody
- Dwuetapowe trawienie enzymatyczne komórek
- Tętnice szyjne myszy
- Techniki filtracji i wirowania
Główne wyniki
- Z tętnic szyjnych myszy udało się uzyskać 176 000 pojedynczych komórek.
- Protokół poprawił efektywność dysocjacji i żywotność komórek.
- Niemonitorowane klasteryzacja zidentyfikowała cztery główne typy komórek w tętnicach szyjnych.
Wnioski
- Badanie zapewnia skuteczny protokół przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z tętnic szyjnych.
- Ta metodologia ma zastosowanie do ukierunkowanych terapii w chorobach układu krążenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-viability single-cell suspensions from mouse carotid arteries enable precise cellular profiling critical for cardiovascular target validation and mechanistic de-risking. This protocol addresses a key bottleneck in vascular single-cell sequencing workflows, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Its reproducibility and adaptability position it as a reusable capability for vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular heterogeneity in vascular tissues for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by providing access to multiple vascular cell types.
- Facilitates predictive confidence in pathway analysis and disease modeling.
Screening & Assay Development
- Prepares high-viability single-cell suspensions suitable for downstream single-cell sequencing assays.
- Standardizes dissociation and viability assessment for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable evaluation of cell-type-specific responses in screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by capturing diverse vascular cell populations.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in cardiovascular research.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in vascular disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis of vascular tissues, supporting both target validation and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and cellular pathway clarification in vascular systems.
- Screening: Delivers reproducible, high-viability suspensions for quantitative single-cell assays.
- Analytics: Provides cell viability and concentration metrics to compare dissociation conditions.
- Translational Research: Enables detection of multiple vascular cell types for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other vascular tissues with minor modifications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in vascular cell profiling.
- Operational Value: Standardizes dissociation and viability assessment for scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust cellular characterization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization in cardiovascular research pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and enzymatic dissociation techniques.
- Needs standard laboratory instrumentation for perfusion, centrifugation, and cell counting.
- Demands cross-team standardization of viability and concentration assessment protocols.
- Adaptable to other vascular tissues with protocol optimization for tissue-specific properties.
- Cell viability and debris management are critical for downstream single-cell sequencing success.
