Name: Mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Poznaj metodę mechaniczną dysocjacji tkanek do analizy pojedynczych komórek przy użyciu niskokosztowego urządzenia z napędem silnikowym. Protokół ten umożliwia izolację komórek z tkanek myszy do cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie otrzymano od Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) i American Lung Association (KM). Autorzy pragną podziękować Michele Kaluzienski za pomoc w redakcji.

Ten protokół został zatwierdzony przez UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Do badań wykorzystano tkanki od 7 do 9 tygodniowych samic myszy C57BL/6J. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Ręczna dysocjacja
UWAGA: Ten krok jest zaadaptowany z Maisel K. et al.7.
<ol>
	<li>Usuń wypreparowaną tkankę i umieść ją w pożywce do hodowli zimnych komórek z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Posiekaj tkankę ostrymi nożyczkami do preparowania, aż fragmenty będą mniejsze niż 1 mm w dowolnym wymiarze.</li>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 5 ml pożywki.</li>
	<li>Dodaj enzymy trawienne w oparciu o izolowane tkanki i typy komórek. Do prezentowanych eksperymentów należy stosować kolagenazę 4 (1 mg/ml), kolagenazę D (1 mg/ml) i DNazę (40 μg/ml).</li>
	<li>Inkubować na wytrząsarce lub kołysce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając przez cały czas inkubacji. Odpipetować próbkę w górę i w dół 100 razy.</li>
	<li>Dodać EDTA, aby uzyskać objętość próbki o stężeniu 5 mM. Odpipetować próbkę w górę i w dół 100 razy, a następnie energicznie pipetować próbkę w górę i w dół 100 razy.</li>
	<li>Przepuścić próbkę przez sitko o pojemności 70 μm i zebrać ją do probówki o pojemności 50 ml lub 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zebrane komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zneutralizuj bufor do lizy, dodając 9 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS).</li>
	<li>Ponownie odwirować zebrane komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w żądanym buforze lub pożywce.</li>
</ol>
2. Półautomatyczna dysocjacja mechaniczna
<ol>
	<li>Wypreparowaną tkankę umieścić w pożywce do hodowli zimnych komórek z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS). 
	UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do izolacji komórek z tkanek stałych.</li>
	<li>Posiekaj tkankę ostrymi nożyczkami do preparowania, aż fragmenty tkanki osiągną około 5 mm w dowolnym wymiarze. Przenieś posiekaną tkankę do rurki C i dodaj 1 ml pożywki.</li>
	<li>Załaduj rurkę C do urządzenia. Zamontuj płytkę mocującą rurkę (rysunek uzupełniający 1A) na dnie rurki w kształcie litery D.</li>
	<li>Przymocuj rurki do płyty silnika, zatrzaskując ramiona napinające w płycie akrylowej (rysunek uzupełniający 3).</li>
	<li>Ustaw program niestandardowy: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 4 razy.
	<ol>
		<li>Wybierz tryb niestandardowy z menu głównego, naciskając niebieski przycisk.</li>
		<li>W pierwszym menu trybu niestandardowego określ czas obrotu do przodu na 30 s, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 30 s. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i przejść do następnego ekranu menu.</li>
		<li>W drugim menu trybu niestandardowego określ czas trwania obrotu wstecznego na 10 s, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 10 s. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i przejść do następnego ekranu menu.</li>
		<li>W trzecim menu trybu niestandardowego określ, ile razy mają być powtarzane wybory ustawione w krokach 2.5.2-2.5.3, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 4X. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i uruchomić program. 
		UWAGA: Programy niestandardowe nie są przechowywane w pamięci urządzenia, ale można je zaprogramować jako jeden z zaprogramowanych programów w celu szybszego działania (instrukcje programowania urządzenia znajdują się w pliku uzupełniającym 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom program niestandardowy przy 200 obr./min, regulując voltage pokrętło sterujące (Rysunek uzupełniający 3), aż obliczona wartość obrotów w prawym dolnym rogu ekranu LCD wskaże 200 (Rysunek uzupełniający 4).</li>
	<li>Dodać enzymy trawiące w pożywce o objętości 4 ml zgodnie z izolowanymi typami tkanek i komórek. 
	UWAGA: Do prezentowanych eksperymentów należy użyć kolagenazy 4 (1 mg/ml), kolagenazy D (1 mg/ml) i DNazy (40 μg/ml).</li>
	<li>Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 200 obr./min: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 4 razy.</li>
	<li>Przenieść urządzenie z nadal załadowanymi probówkami do inkubatora o temperaturze 37 °C na 45 minut.</li>
	<li>Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 50 obr./min: Do przodu, 270 s; Bieg wsteczny, 30 s; Pętla, 9 razy.</li>
	<li>Dodać EDTA, aby osiągnąć stężenie 5 mM w próbce.</li>
	<li>Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 100 obr./min: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 2 razy.</li>
	<li>Przepchnąć próbkę przez sitko o pojemności 70 μm i zebrać ją do probówki o pojemności 50 ml lub 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zebrane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zneutralizować bufor do lizy za pomocą 9 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
	<li>Ponownie odwirować zebrane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w żądanym buforze lub pożywce.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Użyj niesparowanych testów t Welcha, aby porównać pary próbek lub grupy, przy czym wielkość próby n > 4 myszy reprezentują 2 powtórzone eksperymenty. 
	UWAGA: Różnice uznano za statystycznie istotne, gdy (>p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.</li>
</ol>

Semi-Automated Mechanical-Enzymatic Tissue Dissociation for Single-Cell Analysis

<ol><li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).</li>
<li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeiskirchen%2C+S+%22Fibrosis%3A+Methods+and+Protocols%22">Fibrosis: Methods and Protocols</a>. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).</li>
<li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+CIRP%22%5BJournal%5D)">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li>
<li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).</li>
<li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li>
<li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Hematology+and+Blood+Transfusion%22%5BJournal%5D)">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carpal+tunnel+syndrome%3A+a+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Urządzenie to zostało zaprojektowane z myślą o łatwym montażu w warunkach badawczych w celu zapewnienia zawiesin pojedynczych komórek z całych tkanek do późniejszej analizy pojedynczych komórek. Funkcje, choć podstawowe, są wystarczające, aby zaspokoić potrzeby badaczy w środowisku akademickim i poza nim. Kluczową korzyścią płynącą z zastosowania tego urządzenia jest jego potencjał do poprawy przygotowania zawiesin jednokomórkowych poprzez zmniejszenie zmienności. Ponadto możliwość jednoczesnego przetwarzania 12+ próbek ...

Analiza pojedynczych komórek szybko stała się kluczowa dla nowych odkryć biomedycznych, czy to dla zastosowań takich jak cytometria przepływowa, identyfikacja różnych typów komórek, sekwencjonowanie pojedynczych komórek, czy też do identyfikacji genomowych lub transkryptomicznych różnic między komórkami1. Wykonanie takiej izolacji komórek z tkanek będących przedmiotem zainteresowania wymaga zmielenia wypreparowanych tkanek i przepchnięcia ich przez drobne sitko komórkowe w celu odfiltrowania tkanki łącznej z pożądanych komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Izolowanie przylegających typów komórek, takich jak komórki dendrytyczne lub makrofagi, lub komórek ze szczególnie włóknistych tkanek, wymaga dodatkowych mechanicznych lub enzymatycznych etapów separacji2,3,4. Proces ten jest zazwyczaj wykonywany ręcznie, co sprawia, że jest bardzo czasochłonny i podatny na zmienność użytkownika podczas oceny wydajności komórek i żywotności próbki. Dlatego tak ważne jest wprowadzenie konfigurowalnych opcji automatycznej dysocjacji tkanek. Chociaż podjęto pewne próby zaprojektowania takich systemów, istniejące opcje nie zawsze są łatwo dostępne, szczególnie w laboratoriach akademickich i środowiskach o niższych zasobach, głównie ze względu na zbyt kosztowny charakter tych urządzeń5. Co więcej, urządzenia te nie zawsze dają się dostosować do indywidualnych potrzeb grupy badawczej6.
Tutaj zaprojektowano urządzenie do dysocjacji tkanek, aby zautomatyzować trawienie całych tkanek lub fragmentów tkanek do jednokomórkowych zawiesin za pomocą enzymów trawiennych i mechanicznych zakłóceń. Urządzenie to można łatwo zmontować w laboratorium, umieścić w komorach grzewczych lub chłodzących w celu regulacji temperatury, dostosować do wymaganej liczby tkanek do dysocjacji i zaprogramować z pożądanymi protokołami dysocjacji. Szerokie zastosowanie tego urządzenia może znacznie poprawić odtwarzalność protokołów ekstrakcji komórek i zapewnić oszczędzającą czas alternatywę dla ręcznej dysocjacji.
Konstrukcja pozwala na jednoczesne trawienie do 12 tkanek w zautomatyzowanym procesie. Urządzenie składa się z 12 pojedynczych silników połączonych równolegle i zasilanych standardową wtyczką ścienną poprzez zasilacz AC/DC z regulowanym pokrętłem napięcia do sterowania obrotami/prędkością silników. Silniki obracają sześciokątną, która ściśle przylega do górnej części rur C. Rurki C są utrzymywane na miejscu przez naprężenie w dół na akrylowej płycie, która zatrzaskuje się po obu stronach do górnej płyty, na której zamocowane są silniki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Ponieważ silniki są połączone równolegle, ich prędkość przy danym napięciu nie powinna się zbytnio różnić, ale obciążenie (liczba rurek C zamontowanych na urządzeniu) będzie miało wpływ na prędkość nawet wtedy, gdy napięcie jest utrzymywane na stałym poziomie. Do pomiaru obrotów na minutę (obr./min) zainstalowano obrotomierz z czujnikiem halla i magnesem stałym na jednym z wałów silnika (rysunek uzupełniający 1). Pliki CAD do budowy układów silnikowych znajdują się w Uzupełniającym pliku kodowania 1. W zestawie znajduje się również programowalny przełącznik do odwracania kierunku obrotów poprzez odwrócenie dodatnich/ujemnych ładunków dostarczanych do silników. Wszystkie te funkcje są zintegrowane za pomocą kodowanego oprogramowania (oprogramowanie Arduino IDE, patrz tabela materiałów) na Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Za pomocą połączonych przycisków i panelu LCD (rysunek uzupełniający 2) można tworzyć i uruchamiać zapisane i niestandardowe protokoły, automatycznie odwracać kierunek obrotów w określonych momentach protokołu, dostosowywać prędkość za pomocą napięcia (rysunek uzupełniający 3) oraz wyświetlać aktualną prędkość silnika i czas pozostały do ukończenia zaprogramowanego protokołu (rysunek uzupełniający 4).
Na potrzeby niniejszego badania, monochromatyczne zawiesiny zostały przygotowane przy użyciu zarówno mechaniczno-enzymatycznej dysocjacji tkanek za pomocą tego urządzenia, jak i manualno-enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu określenia różnic, jeśli takie istnieją, w komórkach odzyskanych do dalszych zastosowań. Preparaty komórkowe oceniano na podstawie całkowitej wydajności komórek na tkankę i procentu żywotności komórek. Cytometria przepływowa została wykorzystana do porównania różnic potencjałów w ekspresji markerów powierzchniowych. Dane analizowano za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej. Niesparowane testy t Welcha użyto do porównania par próbek lub grup, przy czym wielkość próby n > 4 myszy reprezentowała 2 powtórzone eksperymenty. Szczegółową instrukcję wykonania i montażu tego urządzenia można znaleźć w pliku uzupełniającym 1. Materiały potrzebne do tego protokołu są wymienione w Tabeli Materiałów.

<table><tbody><tr><td>&frac14; calowy arkusz akrylowy&nbsp; 12" x 24"</td><td>Akrylowy Mega Store</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&frac12; calowy arkusz akrylowy 12" x 12"</td> <td>SimbaLux</td><td>SL-AS13-12x12</td><td></td></tr><tr><td>12 G drut ze stali nierdzewnej (do ramion napinających)</td><td>Przewód elektryczny Everbilt</td><td>1000847413</td><td></td></tr><tr><td>16 G (linkowany)</td><td>Najlepsze połączenia</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Magnes 2 x 3 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>SU-CRO0587</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-kanałowa płytka przekaźników (do odwrócenia polaryzacji prądu do silników)</td><td>AEDIKO</td><td>AE06233</td><td></td></tr><tr><td>Silniki prądu stałego o średnicy 37 mm (12 V, 200 obr./min) x 12</td><td>Greartisan</td><td>N/A</td><td>Znamionowy moment obrotowy: 2,2 Kg.cm Współczynnik redukcji: 1:22 Prąd znamionowy: 0,1 A D Rozmiar wału wyjściowego: 6 x 14 mm (0,24 "x 0,55") (D x L) Rozmiar skrzyni biegów: 37 x 25 mm (1,46" x 0,98") (gł. x dł.) Rozmiar silnika: 36,2 x 33,3 mm (1,43" x 1,31") (gł. x dł.) Rozmiar otworu montażowego: M3 (brak w zestawie)</td></tr><tr><td>Zasilacz AC/C z regulatorem o zmiennym napięciu&nbsp; &nbsp; (5 Amperów, 3-12 woltów)</td><td>Mo-gu</td><td>J19091-2-MG-US</td><td></td></tr><tr><td>AC-DC 5 V 1 A Precyzyjna przetwornica obniżająca obniżanie napięcia</td><td>Walfront</td><td>1A</td> <td>(zasilacz do zasilania Arduino Nano)</td></tr><tr><td>Arduino Nano&nbsp; &nbsp; (Lafvin)</td><td>Guziki 8541582500</td><td></td><td></td>LAFVIN</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Myszy Awpeye</td><td>Przycisk</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 4</td><td>Worthington</td><td>CLS4 LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D Roche</td><td></td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CVse</td><td></td></tr><tr><td>Roche</td><td></td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma piankowa</td><td>SANKA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna płytka drukowana do prototypowania</td><td>deyue</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna lutownica i lutownica</td><td>LDK</td><td>1002P</td><td></td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna</td><td>3M</td><td>03429NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td> <td>Gibco</td><td>16140089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C</td><td>Rurki Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad, La Jolla, CA</td><td></td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów i analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Czujnik efektu Halla Wymiary: 0,79 x 0,79 x 0,39 cala</td><td>SunFounder</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik sześciokątny 6 mm Silnik z otworem Mosiądz x 2 x 12</td><td>Uxcell</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>z sześciokątnym (śruba z sześciokątnym M4-.70 X 12) x 12</td> przewodów połączeniowych <td>FAS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(dla Arduino Nano)</td><td>ELEGOO</td><td>EL-CP-004</td><td></td></tr><tr><td>Ekran LCD</td><td>JANSANE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>M3 z sześciokątnym x 12</td><td>Shenzhen Baishichuangyou Technology co. Ltd</td><td>310luosditaozhuang</td><td></td></tr><tr><td>M3 Stal nierdzewnaŚruby maszynowe z sześciokątnym z płaskim (30 mm) x 36</td><td>Nadal nie śpią</td><td>a52400001</td><td></td></tr><tr><td>Szybkozłącza zaciskowe</td><td>IEUYO</td><td>22010064</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek (10x)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>46232</td><td></td></tr><tr><td>Osłona adaptera terminala Płytka rozszerzeń do Arduino Nano&nbsp; 12" x 24"</td><td>Shenzhen Weiyapuhua Technology</td><td>60-026-3</td><td></td></tr></tbody></table>

mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Możliwość izolowania i przygotowywania pojedynczych komórek do analizy próbek tkanek szybko stała się kluczowa dla nowych odkryć i badań biomedycznych. Ręczne protokoły izolacji pojedynczych komórek są bardzo czasochłonne i podatne na zmienność użytkownika. Zautomatyzowane protokoły mechaniczne są w stanie skrócić czas przetwarzania i zmienność próbek, ale nie są łatwo dostępne ani opłacalne w środowiskach badawczych o niższych zasobach. Opisywane tutaj urządzenie zostało zaprojektowane do półautomatycznej dysocjacji tkanek przy użyciu dostępnych na rynku materiałów jako tania alternatywa dla laboratoriów akademickich. Dostarczono instrukcje dotyczące wytwarzania, montażu i obsługi konstrukcji urządzenia. Protokół dysocjacji niezawodnie wytwarza zawiesiny jednokomórkowe o porównywalnej wydajności komórek i żywotności próbki do ręcznych preparatów w wielu tkankach myszy. Protokół zapewnia możliwość jednoczesnego przetwarzania do 12 próbek tkanek na urządzenie, dzięki czemu badania wymagające dużych rozmiarów próbek są łatwiejsze do opanowania. Dołączone oprogramowanie pozwala również na dostosowanie protokołu urządzenia do różnych tkanek i ograniczeń eksperymentalnych.

Ten półautomatyczny protokół mechaniczny pozwala na replikację wyników eksperymentów, w których komórki były przetwarzane ręcznie. Zawiesiny komórkowe przygotowane przy użyciu tego urządzenia oraz poprzez dysocjację ręczną wykazują porównywalną wydajność komórkową i żywotność próbek w tkankach płuc, nerek i serca myszy (Rysunek 2A,B). Populacje komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i komórki dendrytyczne, nie zostały istotnie zmienione przez różnicę w protokole izo...

Dostępny jest ogólny protokół połączonej enzymatycznej i półautomatycznej mechanicznej dysocjacji tkanek w celu generowania zawiesin jednokomórkowych do dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa. Dołączone są instrukcje dotyczące wytwarzania, montażu i obsługi taniego urządzenia mechanicznego opracowanego dla tego protokołu.

Mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Nasze laboratorium opracowuje nanocząstki jako narzędzia do badania barier biologicznych i pokonywania tych barier na powierzchni błony śluzowej w celu poprawy dostarczania leków i immunoterapii. Jednym z najbardziej godnych uwagi osiągnięć są szczepionki COVID-19 firm Pfizer, BioNTech i Moderna, które wykorzystują preparaty nanocząsteczek lipidowych do dostarczania mRNA do szczepień. Trwa wiele wysiłków na rzecz ulepszenia immunoterapii, takich jak szczepionki i leczenie raka za pomocą nanocząstek, ponieważ preparaty te mogą poprawić docelowe dostarczanie do komórek odpornościowych i zmniejszyć ogólnoustrojowe skutki uboczne immunoterapii.Analiza pojedynczych komórek jest istotnym elementem immunologii w badaniach biomedycznych, a jedną z najczęstszych technik jest cytometria przepływowa. Wykonanie takich izolacji komórek z tkanek będących przedmiotem zainteresowania wymaga niezawodnej dysocjacji tkanek. Zwiększenie dostępności badań laboratoryjnych bez uszczerbku dla jakości i dokładności może być wyzwaniem.Automatyzacja procesów sprawia, że czynności techniczne i pracochłonne są łatwiejsze do opanowania, a stażyści mogą zdobyć doświadczenie w wykonywaniu bardziej zaawansowanych analiz bez wpływu na wiarygodność wyników. Główną zaletą tego protokołu i towarzyszącej mu konstrukcji urządzenia jest jego możliwość dostosowania i opłacalność. Możliwość jednoczesnego przetwarzania do 12 tkanek skraca czas przetwarzania.Ta tania alternatywa sprawia, że technologia ta jest bardziej dostępna w warunkach badań nad niższymi zasobami. Na początek umieść wypreparowaną tkankę myszy w pożywce do hodowli zimnych komórek zawierającej 5% FBS. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych posiekaj tkankę, aż uzyskasz około pięciu milimetrowych fragmentów.Przenieś posiekane fragmenty do probówki C i dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych. Załaduj rurkę C na urządzenie z napędem silnikowym i zamontuj płytkę mocującą rurkę na dnie rurki w kształcie litery D. Zatrzaśnij ramiona napinające w płycie akrylowej, aby przymocować rurki do płyty silnika.Aby ustawić niestandardowy program na urządzeniu z napędem, z menu głównego naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tryb niestandardowy. W pierwszym menu trybu niestandardowego naciśnij zielony przycisk, aby określić czas obrotu do przodu na 30 sekund. Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie.W drugim menu trybu niestandardowego naciśnij zielony przycisk, aby określić czas trwania odwrotnego obrotu na 10 sekund. Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie. W trzecim menu trybu niestandardowego naciśnij czerwony przycisk, aby określić pętle wyboru na cztery razy.Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie. Ustaw pokrętło sterujące napięciem na 200 obr./min i uruchom program niestandardowy. Następnie dodaj enzym trawiący i cztery mililitry zimnej pożywki hodowlanej zawierającej wypreparowane tkanki.Ponownie załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz program niestandardowy, jak pokazano wcześniej. Po uruchomieniu przenieś urządzenie z załadowanymi rurkami do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut. Następnie załaduj rurkę C na urządzenie i ustaw niestandardowy program na 50 obr./min z obrotem do przodu na 270 sekund, obrotem wstecznym na 30 sekund i dziewięciokrotnym zapętleniem.Dodać EDTA do pięciomilimolowego stężenia końcowego do próbki. Ustaw program niestandardowy na 100 obr./min z obrotem do przodu na 30 sekund, obrotem wstecznym na 10 sekund i dwukrotnym zapętleniem. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów i zbierz filtrat w probówce o pojemności 50 lub 15 mililitrów.Odwirować zebraną zawiesinę komórek o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować przez jedną minutę. Zneutralizować bufor do lizy dziewięcioma mililitrami zimnego PBS.Ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w żądanym buforze lub pożywce. Zawiesina komórek przygotowana za pomocą urządzenia zmotoryzowanego i ręcznej dysocjacji wykazała porównywalną żywotność komórek i wydajność w tkankach płuc, nerek i serca myszy. Populacje komórek odpornościowych, takie jak limfocyty T i komórki dendrytyczne, nie były znacząco dotknięte protokołem izolacji.Ekspresja markerów powierzchniowych wykazała również podobne częstości izolowanych limfocytów T i średnią intensywność fluorescencji dla markera prezentacji antygenu MHC-II w komórkach dendrytycznych między izolacją ręczną a izolacją urządzenia.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Ten film opisuje nieenzymatyczną dysocjację świeżej tkanki ludzkiej w celu uzyskania żywotnych komórek. Technika ta służy do analizy jakościowej i ilościowej komórek CD45 dodatnich (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych prawidłowych i złośliwych tkankach ludzkich.

Dysocjacja mechaniczna: metoda uzyskiwania żywotnych komórek z tkanki

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Poznaj metodę mechaniczną dysocjacji tkanek do analizy pojedynczych komórek przy użyciu niskokosztowego urządzenia z napędem silnikowym. Protokół ten umożliwia izolację komórek z tkanek myszy do cytometrii przepływowej.

Mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym

Przeglądaj więcej filmów