Mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym

Nasze laboratorium opracowuje nanocząstki jako narzędzia do badania barier biologicznych i pokonywania tych barier na powierzchni błony śluzowej w celu poprawy dostarczania leków i immunoterapii. Jednym z najbardziej godnych uwagi osiągnięć są szczepionki COVID-19 firm Pfizer, BioNTech i Moderna, które wykorzystują preparaty nanocząsteczek lipidowych do dostarczania mRNA do szczepień. Trwa wiele wysiłków na rzecz ulepszenia immunoterapii, takich jak szczepionki i leczenie raka za pomocą nanocząstek, ponieważ preparaty te mogą poprawić docelowe dostarczanie do komórek odpornościowych i zmniejszyć ogólnoustrojowe skutki uboczne immunoterapii.

Analiza pojedynczych komórek jest istotnym elementem immunologii w badaniach biomedycznych, a jedną z najczęstszych technik jest cytometria przepływowa. Wykonanie takich izolacji komórek z tkanek będących przedmiotem zainteresowania wymaga niezawodnej dysocjacji tkanek. Zwiększenie dostępności badań laboratoryjnych bez uszczerbku dla jakości i dokładności może być wyzwaniem.

Automatyzacja procesów sprawia, że czynności techniczne i pracochłonne są łatwiejsze do opanowania, a stażyści mogą zdobyć doświadczenie w wykonywaniu bardziej zaawansowanych analiz bez wpływu na wiarygodność wyników. Główną zaletą tego protokołu i towarzyszącej mu konstrukcji urządzenia jest jego możliwość dostosowania i opłacalność. Możliwość jednoczesnego przetwarzania do 12 tkanek skraca czas przetwarzania.

Ta tania alternatywa sprawia, że technologia ta jest bardziej dostępna w warunkach badań nad niższymi zasobami. Na początek umieść wypreparowaną tkankę myszy w pożywce do hodowli zimnych komórek zawierającej 5% FBS. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych posiekaj tkankę, aż uzyskasz około pięciu milimetrowych fragmentów.

Przenieś posiekane fragmenty do probówki C i dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych. Załaduj rurkę C na urządzenie z napędem silnikowym i zamontuj płytkę mocującą rurkę na dnie rurki w kształcie litery D. Zatrzaśnij ramiona napinające w płycie akrylowej, aby przymocować rurki do płyty silnika.

Aby ustawić niestandardowy program na urządzeniu z napędem, z menu głównego naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tryb niestandardowy. W pierwszym menu trybu niestandardowego naciśnij zielony przycisk, aby określić czas obrotu do przodu na 30 sekund. Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie.

W drugim menu trybu niestandardowego naciśnij zielony przycisk, aby określić czas trwania odwrotnego obrotu na 10 sekund. Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie. W trzecim menu trybu niestandardowego naciśnij czerwony przycisk, aby określić pętle wyboru na cztery razy.

Następnie naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać wartość wyświetlaną na ekranie. Ustaw pokrętło sterujące napięciem na 200 obr./min i uruchom program niestandardowy. Następnie dodaj enzym trawiący i cztery mililitry zimnej pożywki hodowlanej zawierającej wypreparowane tkanki.

Ponownie załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz program niestandardowy, jak pokazano wcześniej. Po uruchomieniu przenieś urządzenie z załadowanymi rurkami do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut. Następnie załaduj rurkę C na urządzenie i ustaw niestandardowy program na 50 obr./min z obrotem do przodu na 270 sekund, obrotem wstecznym na 30 sekund i dziewięciokrotnym zapętleniem.

Dodać EDTA do pięciomilimolowego stężenia końcowego do próbki. Ustaw program niestandardowy na 100 obr./min z obrotem do przodu na 30 sekund, obrotem wstecznym na 10 sekund i dwukrotnym zapętleniem. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów i zbierz filtrat w probówce o pojemności 50 lub 15 mililitrów.

Odwirować zebraną zawiesinę komórek o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować przez jedną minutę. Zneutralizować bufor do lizy dziewięcioma mililitrami zimnego PBS.

Ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w żądanym buforze lub pożywce. Zawiesina komórek przygotowana za pomocą urządzenia zmotoryzowanego i ręcznej dysocjacji wykazała porównywalną żywotność komórek i wydajność w tkankach płuc, nerek i serca myszy. Populacje komórek odpornościowych, takie jak limfocyty T i komórki dendrytyczne, nie były znacząco dotknięte protokołem izolacji.

Ekspresja markerów powierzchniowych wykazała również podobne częstości izolowanych limfocytów T i średnią intensywność fluorescencji dla markera prezentacji antygenu MHC-II w komórkach dendrytycznych między izolacją ręczną a izolacją urządzenia.