Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk
26 stycznia 2024
Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.
Nasze badania koncentrują się na komunikacji łożyskowo-mózgowej. Badamy, czy małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą zakłócić barierę krew-mózg i czy jest to potencjalny mechanizm leżący u podstaw powikłań naczyniowych komórkowych obserwowanych u kobiet ze stanem przedrzucawkowym. Wcześniej wykazano, że osocze kobiet ze stanem przedrzucawkowym może upośledzać barierę krew-mózg.
Jednak charakter tego potencjalnego szkodliwego czynnika obecnego w osoczu jest nieznany. Badania z naszego laboratorium wykazały, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z osocza kobiet ze stanem przedrzucawkowym lub łożyskami hodowanymi w niedotlenieniu upośledzają barierę krew-mózg. Podstawowy mechanizm tego, w jaki sposób pęcherzyki zewnątrzkomórkowe łożyska upośledzają barierę krew-mózg, wymaga dalszych badań, które obejmują analizę pojemnika pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, takich jak specyficzne mikroRNA, które kontrolują ekspresję białek trawiennych w komórkach śródbłonka mózgu.
Aby rozpocząć ekstrakcję eksplantatów z próbki ludzkiego łożyska za pomocą wysterylizowanych kleszczy, ostrożnie usuń skrzepy z płytki podstawy łożyska. Ekstrahuj małe eksplantaty, aż do uzyskania końcowej ekstrakcji tkanek o wadze około 10 gramów. Po umyciu i ponownym wymieszaniu eksplantatów w pożywkach hodowlanych, podziel zawieszone eksplantaty na dwie 100-milimetrowe naczynia hodowlane.
Umieść jedną z naczyń w standardowych warunkach normoksycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Umieść drugie naczynie w komorze hipoksyjnej z 1% tlenem. Po wyhodowaniu eksplantatów w dwóch różnych warunkach przez 18 godzin, przystąp do zbioru kondycjonowanych pożywek z eksplantów w 15-mililitrowej probówce.
Zebrać pożywki hodowlane z normoksyjnych i niedotlenionych kultur eksplantatów w oddzielnych probówkach. Przeprowadzić sekwencyjne odwirowanie zebranego kondycjonowanego podłoża w temperaturze pokojowej. Po każdym odwirowaniu za pomocą pipety o pojemności od 20 do 100 mikrolitrów ostrożnie zebrać supernatant, wyrzucając osad.
Wykonać jedno dodatkowe odwirowanie na ostatnim zebranym supernatantze. Otrzymany osad zawierający łożyskowe małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub SEV zawiesić w 500 mikrolitrach PBS i przepuścić zawiesinę przez filtr 0,22 mikrona. SEV pochodzące z łożyska są teraz gotowe do wstrzyknięcia myszy.
Aby wykonać małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub wstrzyknięcia SEV do myszy, należy użyć SEV wyizolowanych z ludzkich eksplantatów łożyskowych, hodowanych w warunkach hipoksyjnych i normoksyjnych. Rozcieńczyć 200 mikrogramów łożyskowych SEV w buforze fosforanowym o pH 7,4 do końcowej objętości 70 mikrolitrów. Przed wstrzyknięciem należy ocenić samopoczucie zwierzęcia za pomocą skali RMCBS.
Następnie za pomocą strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 30 wstrzyknij roztwór do żyły szyjnej zewnętrznej odpowiednio znieczulonej myszy. Po wstrzyknięciu należy lekko uciskać wstrzyknięty obszar suchym bawełnianym wacikiem przez 15 sekund. Oceń samopoczucie myszy za pomocą skali RMCBS po trzech, sześciu, 12 i 24 godzinach po wstrzyknięciu.
Do analizy wynaczynienia niebieskiego Evansa należy przygotować 2% roztwór niebieskiego barwnika Evansa w PBS. 24 godziny po wstrzyknięciu SEV z wykorzystaniem dostępu zaoczodołowego wstrzyknąć niebieski roztwór Evansa do odpowiednio znieczulonej myszy. Gdy błękit Evansa zacznie krążyć w ciele zwierzęcia, wykonaj perfuzję wewnątrzsercową na znieczulonej myszy z około trzema mililitrami roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć barwnik z krążenia.
Po utrwaleniu myszy za pomocą dosercowego wlewu 4% paraformaldehydu w PBS i ostrożnym ekstrakcji mózgu, zważ go i sfotografuj. Postępując zgodnie z zademonstrowaną procedurą, wyekstrahuj mózgi zwierząt w każdej grupie za pomocą mikroskopu stereoskopowego z zoomem, wizualizuj przechwycone obrazy wypreparowanych wycinków mózgu. Wykorzystaj przechwycone obrazy, aby określić ilościowo wynaczynienie błękitu Evansa za pomocą oprogramowania Image J.
W przeciwieństwie do myszy, którym wstrzyknięto SEV z łożyska normoksycznego, myszy, którym wstrzyknięto SEV z niedotlenionych łożysk, wykazywały postępujący spadek wyniku neurologicznego do 24 godzin po wstrzyknięciu. Mózgi myszy, którym wstrzyknięto SEV z niedotlenionych łożysk, miały wyższe wynaczynienie błękitu Evansa niż mózgi zwierząt, którym wstrzyknięto SEV z łożysk normoksyjnych. Mózgi myszy, którym wstrzyknięto SEV z niedotlenionych łożysk, wykazały zmniejszoną ilość skrzepu w pięciu białkach, co ma kluczowe znaczenie dla szczelności bariery krew-mózg.
Wszystkie te wyniki wskazują na przerwanie bariery krew-mózg wprowadzone przez SEV z niedotlenionych łożysk.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) pochodzących z eksplantatów łożyska w warunkach hipoksji na barierę krew-mózg (BBB) u nieciężarnych dorosłych samic myszy. Celem badań jest odkrycie potencjalnych mechanizmów, poprzez które pęcherzyki te mogą przyczyniać się do powikłań naczyniowych związanych z preeklampsją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Położnictwo
Wprowadzenie
- Predyspozycja do przedwczesnej rzucawki wiąże się z powikłaniami naczyniowymi u kobiet w ciąży.
- Poprzednie badania wykazały, że osocze kobiet z przedwczesną rzucawką może uszkadzać barierę krew-mózg (BBB).
- Konkretne szkodliwe czynniki obecne w osoczu pozostają nieznane.
- Wykazano, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z osocza kobiet z przedwczesną rzucawką lub z niedotlenionych łożysk wpływają na BBB.
Cel badania
- Ocena wpływu sEVs na barierę krew-mózg (BBB).
- Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia BBB w związku z preeklampsją.
- Analiza roli mikroRNA w regulacji białek trawiennych w komórkach śródbłonka mózgu.
Zastosowane metody
- Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z eksplantów łożyska.
- Hodowla eksplantów w warunkach hipoksji.
- Ocena integralności bariery krew-mózg u nieciężarnych dorosłych myszy samic.
- Analiza zawartości mikroRNA w izolowanych pęcherzykach.
Główne wyniki
- Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) z hipoksycznych eksplantów łożyska zaburzają barierę krew-mózg (BBB).
- Zidentyfikowano specyficzne mikroRNA, które mogą wpływać na integralność BBB.
- Wykazano potencjalny związek między czynnikami łożyska a powikłaniami naczyniowymi w preeklampsji.
- Przedstawiono wgląd w mechanizmy uszkodzenia BBB.
Wnioski
- Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) odgrywają istotną rolę w rozszczelnieniu bariery krew-mózg (BBB).
- Konieczne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć zaangażowane w ten proces mechanizmy.
- Niniejsze badania mogą doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu powikłań związanych z preeklampsją.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zaburzenie bariery krew-mózg (BBB) przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) pochodzące z niedotlenionych ludzkich łożysk podkreśla mechanistyczny związek między dysfunkcją łożyska a ryzykiem naczyniowym w mózgu w przebiegu przedeklampsji. Model ten umożliwia badanie sygnalizacji zapośredniczonej przez krążące pęcherzyki oraz jej wpływu na integralność BBB, co dostarcza danych dla wczesnej walidacji celów terapeutycznych w przypadku powikłań naczyniowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji molekularnych czynników ryzyka neurologicznego u matek, co ma znaczenie dla selekcji projektów badawczych w obszarze badań naczyniowych i neurozapalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad sEV z łożyska jako mediatorami uszkodzenia BBB.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla białek i mikroRNA związanych z pęcherzykami.
- Ułatwia badanie szlaków sygnalizacji matczyno-płodowej w oparciu o postawione hipotezy.
- Zapewnia platformę do ustalania priorytetów dla celów molekularnych powiązanych z powikłaniami naczyniowymi mózgu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany model in vivo do ilościowego określania zmian przepuszczalności BBB.
- Umożliwia powtarzalny pomiar ekstrawazacji błękitu Evansa jako wyniku ilościowego.
- Wspiera standaryzację analizy w celu przesiewania związków modulujących pęcherzyki.
- Przygotowuje systemy biologiczne do dalszych badań mechanistycznych i farmakologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami dysfunkcji naczyniowo-nerwowej związanej z preeklampsją, które mają znaczenie kliniczne.
- Umożliwia opracowanie translacyjnych biomarkerów w oparciu o wskaźniki integralności BBB.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację hipotez terapeutycznych.
- Dostarcza wartości prognostycznej dla dostosowanego do ryzyka wdrażania interwencji ukierunkowanych na układ naczyniowy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy schemat pracy sytuuje badania nad zaburzaniem BBB za pośrednictwem sEV na styku wczesnego odkrywania i walidacji modeli przedklinicznych, łącząc wgląd w mechanizmy z punktami końcowymi translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących uszkodzeń BBB wywoływanych przez pęcherzyki oraz wyjaśnianie związanych z nimi szlaków.
- Przesiew: Zapewnia ilościowe i powtarzalne wyniki do analizy porównawczej efektów działania pęcherzyków.
- Analityka: Umożliwia znormalizowany pomiar ekstrawasacji błękitu Ewansa w celu porównania różnych stanów.
- Badania translacyjne: Łączy in vivo zaburzenia BBB z klinicznymi markerami ryzyka w przerośnięciu łożyska (preeklampsji).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę in vivo do oceny różnorodnych populacji pęcherzyków oraz interwencji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukuje ryzyko mechanistyczne związane z zaburzeniami bariery krew-mózg (BBB) pośredniczonymi przez pęcherzyki.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów integralności BBB.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w programach terapeutycznych dotyczących naczyniowych i neurozapalnych schorzeń.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modeli w odniesieniu do powikłań naczyniowo-mózgowych u matek, z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii łożyska, izolacji pęcherzyków oraz modeli neuronaczyniowych in vivo.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do oczyszczania pęcherzyków i obrazowania ilościowego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów iniekcji, oceny (scoringu) i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody do różnych systemów modelowych lub źródeł pęcherzyków.
- Ograniczenia obejmują specyficzność modelu dla stanu przedrzucawki oraz wymóg precyzyjnej charakterystyki pęcherzyków.
