Name: Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych i martwych perycytów mózgu w wycinkach szczurzych po krwotoku podpajęczynówkowym. Protokół fluorescencyjny umożliwia różnicowanie komórek i badanie apoptozy zależnej od skurczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81960226,81760223); Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Kunming (kmmu20220945). Do badań wykorzystano szczury Sprague-Dawley (SD) obojga płci o wadze 300-350 g.
1. Indukowanie modelu SAH
<ol>
	<li>Znieczulij szczury za pomocą 2% izofluranu i 100% tlenu. Utrzymuj znieczulenie, podając ciągłe znieczulenie wziewne izofluranem (1%-3%). Zabezpiecz głowę szczura za pomocą aparatu stereotaktycznego (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Utwórz model SAH, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wprowadzić igłę do mikroiniekcji do spłuczki nadsiodłowej. Następnie wstrzyknąć autologiczną krew z tętnicy ogonowej szczura (bez antykoagulantu) do spłuczki nadsiodłowej za pomocą pompy strzykawkowej (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wszczepić igłę do mikroiniekcji do prawej bocznej komory mózgu, korzystając z podanych współrzędnych: bregma, −0,8 mm; boczna, 1,4 mm; głębokość, 4 mm9. W przypadku grup SAH wstrzyknij 0,2 ml krwi z tętnicy ogonowej szczura. W przypadku grup pozorowanych podawaj tę samą objętość izotonicznego soli fizjologicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i stabilizacja wycinka mózgu
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić szczury za pomocą 2% inhalacji izofluranu. Po ścięciu głowy należy pobrać całe mózgi i zanurzyć je w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF). 
	UWAGA: Stosować świeżo przygotowane roztwory ACSF o następującym składzie: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH2PO4, 1,5 mMMgSO4, 2,5 mM CaCl2 i 10,11 mM D-Glucose (patrz tabela materiałów). Utrzymuj pH między 7,3 a 7,4.</li>
	<li>Użyj wibratomu (patrz Tabela materiałów), aby przygotować ostre plastry mózgu o grubości 200 μm od szczurów SD w lodowatym ACSF, który jest napowietrzany 5% CO2 i 95% O2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść ostre plastry mózgu o grubości 200 μm w komorze do przechowywania na nylonowej siatce zanurzonej w ACSF. Zrównoważyć roztwór ACSF z 95%O2 i 5% CO2 , utrzymując zakres temperatur 35-37 °C. Pozwól plasterkom mózgu ustabilizować się przez 2 godziny, dając im czas na dostosowanie się (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
</ol>
3. Oznaczanie perycytów w ostrych wycinkach mózgu za pomocą TO-PRO-3
UWAGA: Perycyty z ostrych wycinków mózgu zostały fluorescencyjnie oznaczone za pomocą znacznika TO-PRO-310.
<ol>
	<li>Dodać barwnik fluorescencyjny TO-PRO-3 do ACSF, uzyskując końcowe stężenie 1 μM. Inkubować ostre plastry mózgu w temperaturze pokojowej w ciemnym otoczeniu z ACSF zawierającym TO-PRO-3 przez 20 min. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby nosić rękawice lateksowe podczas obchodzenia się z TO-PRO-3 w celu ochrony.</li>
	<li>Przenieść sitko z siatki nylonowej, przenoszące plastry mózgu, z komory załadowczej do 6-dołkowej komory płukania płytek (patrz tabela materiałów). Pozostaw plastry mózgu w komorze płukania na 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). 
	UWAGA: Ten etap płukania kończy proces barwienia, zmniejsza etykietowanie tła i zapobiega niespecyficznemu barwieniu.</li>
	<li>Płukać preparaty łącznie przez 15 minut roztworem ACSF, który jest zrównoważony mieszaniną 5% CO2 i 95% O2 . Ten etap płukania zatrzymuje wchłanianie barwnika i minimalizuje etykietowanie tła (Rysunek 4C).</li>
</ol>
4. Barwienie nieistotnych perycytów mikrokrążenia mózgowego w ostrych wycinkach mózgu
<ol>
	<li>Inkubować wycinki mózgu wstępnie załadowane TO-PRO-3 w temperaturze 37 °C z izolektyną B4 sprzężoną z Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w ciemnym otoczeniu. Po inkubacji płucz plastry mózgu przez 15 minut w ACSF (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E).</li>
	<li>Inkubować wycinki mózgu w ACSF zagazowane 5% CO2 i 95%O2 jak zwykle. Dodać jodek propydyny (PI) o stężeniu 37 μM do obu roztworów w temperaturze 37 °C. To oznaczy nieistotne perycyty mózgu. Inkubuj preparaty w tym roztworze ACSF przez 60 minut w ciemności (<silna klasa="xfig">Rysunek 4F).</li>
	<li>Następnie płucz preparaty przez 15 minut roztworami ACSF, aby zatrzymać wchłanianie barwnika i zminimalizować etykietowanie tła.</li>
</ol>
5. Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w ostrych wycinkach mózgu
<ol>
	<li>Delikatnie przenieś wycinki mózgu do naczyń konfokalnych ze szklanym dnem (patrz Tabela materiałów) za pomocą plastikowych pipet Pasteura. Napełnij naczynia roztworem ACSF uprzednio zrównoważonym z 5% CO2 i 95%O2 . Użyj żelaznej siatki, aby zabezpieczyć plastry mózgu szczura na miejscu.</li>
	<li>Przenieś naczynia konfokalne ze szklanym dnem na stolik mikroskopu konfokalnego. Umieść ostry wycinek mózgu na dnie naczynia i wykonaj go ><za pomocą roztworu ACSF zrównoważonego mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 podczas obrazowania w mikroskopii konfokalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A i <silna klasa="xfig">Rysunek 5Ab').</li>
	<li>Wizualizuj komórki ściany mikrokrążenia kory mózgowej za pomocą obiektywu 40x. Przechwytuj stosy obrazów za pomocą kompatybilnego oprogramowania (patrz Spis materiałów). Użyj odpowiednich filtrów dla IB4 (wzbudzenie/emisja 460 nm/520 nm), PI (wzbudzenie/emisja 545 nm/595 nm) i TO-PRO-3 (wzbudzenie/emisja 606 nm/666 nm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D). 
	UWAGA: Rób zdjęcia z następującymi szczegółami: 40× obiektyw DIC N1, 3 × 12 bitów: 512 × 512 pikseli (0,22 × 0,22 mm), kalibracja: 0,42 μm/px.</li>
	<li>Zidentyfikuj mikrokrążenie mózgowe i perycyty na podstawie ich sieci i morfologii. Zlokalizuj określony region zawierający sieć mikrokrążenia mózgowego na każdym wycinku mózgu i uchwyć obrazy.</li>
	<li>Uważnie zanotuj lokalizację obrazowania, aby zapewnić spójność w kolejnych ujęciach (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B,C). Do dalszej obróbki i analizy należy użyć oprogramowania do analizy obrazu (ImageJ) i oprogramowania do edycji zdjęć (patrz Spis materiałów).</li>
</ol>

Visualization of Brain Pericyte Contractility Post-Subarachnoid Hemorrhage

<ol><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+properties+of+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li>
<li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li>
<li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li>
<li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+%CE%B12+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li>
<li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li>
<li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining%3A+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+An+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowano techniki obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji ważnych perycytów mózgu, nieistotnych perycytów mózgu oraz mikrokrążenia w wycinkach mózgu. W ostrych wycinkach mózgu szczura proces ten obejmuje wstępne znakowanie perycytów za pomocą TO-PRO-311, a następnie komórek śródbłonka mikronaczyniowego za pomocą IB412; następnie identyfikacja martwych perycytów odbywa się za pomocą PI. Protokół ten jest prosty, powtarzalny i ma duże zastosowanie...

Perycyty mózgu, wyróżniające się smukłymi wypukłościami i wystającymi ciałami komórek, otaczają mikrokrążenie1,2. Podczas gdy zwiększenie przepływu krwi w mózgu jest głównie napędzane przez rozszerzenie naczyń włosowatych, mniejsze tętnice wykazują wolniejsze tempo rozszerzania 3. Kurczliwość perycytów wywiera wpływ na średnicę naczyń włosowatych i morfologię perycytów, wpływając na dynamikę naczyń krwionośnych4. Skurcz perycytów mózgu prowadzi do zwężenia naczyń włosowatych, a w scenariuszach patologicznych nadmierny skurcz może utrudniać przepływ erytrocytów5. Różne czynniki, w tym noradrenalina uwalniana z miejsca sinawy, mogą indukować skurcz perycytów mózgu w naczyniach włosowatych6. Pełniąc rolę regulacyjną w przepływie krwi w mózgu, perycyty wykazują syntezę 20-HOTE, służąc jako czujnik tlenu podczas hiperoksji7. Wywołany stresem oksydacyjno-azotatywnym skurcz perycytów mózgu szkodliwie wpływa na naczynia włosowate5. Pomimo badań zarówno in vivo, jak i ex vivo nad skurczem perycytów mózgu8, nadal istnieje ograniczona wiedza na temat obrazowania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu.
Najważniejsze, obrazowanie perycytów mózgu po utrwaleniu tkanek pogarsza ich żywotność i późniejszą ocenę kurczliwości. Co więcej, w scenariuszach takich jak zaburzenia neurologiczne (np. krwotok podpajęczynówkowy - SAH), transgeniczne znakowanie perycytów mózgu nie rozróżnia żywotnych i nieżywotnych perycytów, co potwierdza nasze wstępne badanie śmierci perycytów mózgu wywołanej SAH9. 
Aby sprostać tym wyzwaniom, zastosowaliśmy TO-PRO-3 do oznaczania żywych perycytów, podczas gdy martwe były barwione jodkiem propidyny (PI). Użyliśmy technologii obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, aby zobrazować żywotne i nieżywotne perycyty mózgu w wycinkach mózgu, zachowując jednocześnie aktywność plasterków podczas obrazowania. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie powtarzalnej metody obrazowania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu, służąc jako cenne narzędzie do badania wpływu perycytów mózgu na mikrokrążenie mózgowe po SAH.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>ABC biochemia</td><td>ABC703006</td><td>RT</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td><td>RT</td></tr><tr><td>Folia</td><td>aluminiowa MIAOJIE</td><td>225 mm x 273 mm</td><td>RT</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>RT</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania konfokalnego</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements 4.10.00</td><td></td></tr><tr><td>RT Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Nikon</td><td>N-SIM/C2si</td><td>RT</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu (5% CO2, 95% O2)</td><td>PENGYIDA</td><td>40L</td><td></td></tr><tr><td>RT Naczynia konfokalne ze szklanym dnem</td><td>Beyotime</td><td>FCFC020-10szt</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>RT</td></tr><tr><td>Klej</td><td>EVOBOND</td><td>KH-502</td><td>RT</td></tr><tr><td>Maszyna do lodu</td><td>XUEKE</td><td>IMS-20</td><td>RT</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>RT System znieczulenia wziewnego</td><td>SCIENCE</td><td>QAF700</td><td>RT</td></tr><tr><td>Izolektyna B 4- FITC</td><td>SIGMA</td><td>L2895&ndash; 2MG</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447&ndash; 40&ndash; 7</td><td>RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>RT</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647&ndash; 14&ndash; 5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10049&ndash; 21&ndash; 5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>RT</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>NEST Biotechnology</td><td>318314</td><td></td></tr><tr><td>RT Pompa perystaltyczna</td><td>Scientific Industries Inc</td><td>Model 203</td><td></td></tr><tr><td>RT Propidium (jodek)</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-D0815/CS-7538</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>SCIENCE</td><td>QA</td><td>RT</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard PUMP</td><td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td><td>RT</td></tr><tr><td>Termostatyczna łaźnia wodna</td><td>OLABO</td><td>HH-2</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikrotom wibracyjny</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

Perycyty są kluczowymi komórkami ściennymi znajdującymi się w mikrokrążeniu mózgowym, odgrywającymi kluczową rolę w aktywnym modulowaniu przepływu krwi w mózgu poprzez regulację kurczliwości. Konwencjonalnie ich kurczliwość mierzy się, obserwując przesunięcia morfologiczne i zmiany średnicy naczyń włosowatych w określonych okolicznościach. Jednak po utrwaleniu tkanki, ocena żywotności i wynikająca z tego kurczliwość perycytów w perycytach zobrazowanych mózgów staje się zagrożona. Podobnie, genetyczne znakowanie perycytów mózgu nie jest w stanie rozróżnić perycytów żywotnych i nieżywotnych, szczególnie w stanach neurologicznych, takich jak krwotok podpajęczynówkowy (SAH), gdzie nasze wstępne badanie potwierdza śmierć perycytów mózgu. W celu przezwyciężenia tych ograniczeń opracowano niezawodny protokół, umożliwiający jednoczesne znakowanie fluorescencyjne zarówno funkcjonalnych, jak i niefunkcjonalnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu. Ta metoda znakowania umożliwia wizualizację mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, jednocześnie oznaczając mikrokrążenie wycinka mózgu. Ten innowacyjny protokół umożliwia ocenę kurczliwości okołocytów mózgu, jej wpływu na średnicę naczyń włosowatych i strukturę perycytów. Badanie kurczliwości perycytów mózgu w kontekście SAH pozwala na dogłębne zrozumienie jej wpływu na mikrokrążenie mózgowe.

W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgowe zazwyczaj nie ulegają śmierci komórkowej. Rysunek 6 ilustruje to zjawisko, gdzie kolor żółty wskazuje obecność żywych perycytów mózgowych; perycyty mózgowe nie wykazują barwienia PI, co świadczy o ich żywotności. Aby sprawdzić, czy perycyty pozostają przytwierdzone do mikrokrążenia po śmierci komórkowej, zastosowano metody w szczurzym modelu SAH, a następnie przeprowadzono obrazowanie.
Opracowano metody obraz...

Wstępne dochodzenie potwierdza, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) powoduje zanik perycytów mózgu. Ocena kurczliwości perycytów po SAH wymaga rozróżnienia między żywotnymi i nieżywotnymi perycytami mózgu. W związku z tym opracowano procedurę oznaczania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu jednocześnie w wycinkach mózgu, ułatwiając obserwację przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

Nasze badanie wykazało znaczny wzrost zgonów okołocytalnych, rozpoczynających się po sześciu godzinach od SAH. Wykazało to dodatnią korelację między liczbą perycytów nieistotnych dla ciała a czasem, jaki upłynął po SAH. Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po SAH i technikach izolacji perycytów posunęło naprzód badania w mojej dziedzinie.Obecnie dość trudno jest w pełni odróżnić barwione perycyty od barwionych komórek śródbłonka. Nasze badanie wykazało apoptozę zależną od skurczu w perycytach po SAH. Opracowaliśmy bardzo niezawodny protokół, który umożliwia znakowanie fluorescencyjne zarówno funkcjonalnej, jak i niefunkcjonalnej perycyty mózgu podczas resekcji w tym samym czasie.Aby utworzyć krwotok podpajęczynówkowy lub model SAH, włóż igłę do mikroiniekcji do znieczulonej spłuczki nadsiodłowej szczura. Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknąć autologiczną krew pobraną z tętnicy ogonowej szczura do spłuczki nadsiodłowej. Teraz wszczepić kolejną igłę w prawą boczną komorę mózgową na podanych współrzędnych.W przypadku modeli SAH wstrzyknij 0,2 mililitra krwi z tętnicy ogonowej szczura. W przypadku grup pozorowanych wstrzyknąć taką samą objętość izotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Po dekapitacji wydobądź cały mózg szczura i zanurz go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF).Za pomocą wibratomu przygotuj ostre plastry mózgu o wielkości 200 mikrometrów w lodowato zrównoważonym ACSF. Umieść plastry mózgu na nylonowej siatce zanurzonej w zrównoważonym ACSF w komorze do przechowywania w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza. Aby oznaczyć perycyty, dodaj barwnik fluorescencyjny TO-PRO-3 do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF.Teraz inkubuj świeżo pokrojony mózg szczura w obciążonym barwnikiem ACSF przez 20 minut w ciemnym otoczeniu w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś sitko z siatki nylonowej wraz z plastrami mózgu do sześciodołkowej komory do płukania płytek. Pozostaw plastry mózgu w komorze na 10 minut.Aby oznaczyć nieistotne perycyty, inkubuj wycinki mózgu znakowane TO-PRO-3 w sprzężonej izolektynie B4 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji płucz plastry mózgu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym przez 15 minut. Następnie umieść plastry mózgu w ACSF zagazowanym 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem.Do tego dodaj jodek propidyny o stężeniu 37 mikromolów w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać wchłanianie barwnika i zminimalizować etykietowanie tła, płucz preparaty przez 15 minut w ACSF. W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgu nie doświadczają śmierci komórki.Wykryto żywotne perycyty, które nie były barwione jodkiem propidyny. Modele SAH wykazały kluczowe perycyty w obrębie mikrokrążenia. Wykryto również nieistotne perycyty.Znakowane jodkiem propidyny nieistotne perycyty pozostały przyłączone do całego mikrokrążenia. Na początek użyj plastikowej pipety Pasteura, aby delikatnie przenieść fluorescencyjnie zabarwione wycinki mózgu do szklanych naczyń konfokalnych. Napełnij te naczynia zrównoważonym ACSF.Za pomocą żelaznej siatki zabezpiecz plastry mózgu szczura na miejscu. Następnie umieść naczynia konfokalne ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu konfokalnego. Umieść ostry wycinek mózgu na dnie naczynia i perfuzuj z równoważeniem ACSF podczas obrazowania.Korzystając z obiektywu 40X, zobacz komórki ściany mikrokrążenia kory mózgowej. Następnie użyj kompatybilnego oprogramowania do przechwytywania stosów obrazów. Zidentyfikuj mikrokrążenie mózgowe i perycyty na podstawie ich sieci i morfologii, a następnie zlokalizuj określony region zawierający sieć mikrokrążenia mózgowego na każdym wycinku mózgu i uchwyć obrazy.W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgu nie doświadczają śmierci komórki. Wykryto żywotne perycyty, które nie były barwione jodkiem propidyny. Modele SAH wykazały kluczowe perycyty w obrębie mikrokrążenia.Wykryto również nieistotne perycyty. Nieistotne perycyty znakowane jodkiem propidyny pozostały odłączone od całego układu krążenia.

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przestrzenie okołonaczyniowe (PVS) to wypełnione płynem przestrzenie wokół naczyń krwionośnych mózgu biorących udział w drenażu płynów. Aby zbadać zmiany w PVS podczas udaru małego naczynia, należy wykonać rezonans magnetyczny (MRI) obszaru zwojów podstawy mózgu pacjenta. Protokół obrazowania obejmuje sekwencje szybkiego echa spinowego i odzysku inwersji tłumionej płynem (T2-zależnych) od fluktuacji (FLAIR). Obrazowanie T2-zależne zwiększa kontrast między PVS wypełnionym płynem...

Rezonans magnetyczny przestrzeni okołonaczyniowych w mózgu człowieka podczas udaru małego naczynia

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Opisano standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego za pomocą wewnątrzświetlnego koła perforacji Willisa. Perforacja naczynia i krwawienie podpajęczynówkowe są monitorowane za pomocą monitorowania ciśnienia śródczaszkowego. Ponadto rejestrowane i kontrolowane są różne parametry życiowe w celu utrzymania warunków fizjologicznych.

Mysi model krwotoku podpajęczynówkowego

Eksperymentalny model krwotoku podpajęczynówkowego (SAH) z kontrolowanym ciśnieniem śródczaszkowym u królika łączy standardowe procedury — kaniulację tętnicy podobojczykowej i przezskórne nakłucie cisterna magna, co umożliwia dokładne naśladowanie ludzkich stanów patofizjologicznych po SAH. Przedstawiamy instrukcje krok po kroku i omawiamy kluczowe punkty chirurgiczne dla udanego eksperymentalnego tworzenia SAH.

Model przetoczkowy krwi królika do badania ostrych i późnych następstw krwotoku podpajęczynówkowego: aspekty techniczne

Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, która pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję drzewa naczyniowo-mózgowego u myszy po mikrotomografii komputerowej i określeniu objętości całych segmentów naczynia, które mogą być użyte do ilościowego określenia skurczu naczyń mózgowych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego.

Wolumetryczna metoda ilościowego oznaczania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Opisaliśmy w tym protokole standaryzowany model myszy z krwotokiem podpajęczynówkowym (SAH) poprzez podwójne wstrzyknięcie autologicznej krwi pełnej do cisterna magna. Wysoki stopień standaryzacji procedury podwójnej iniekcji stanowi model SAH od średniego do ostrego ze względnym bezpieczeństwem w odniesieniu do śmiertelności.

Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Tutaj prezentujemy standaryzowany model myszy SAH, indukowany przez wewnątrznaczyniową perforację filamentu, w połączeniu z obrazowaniem metodą rezonansu magnetycznego (MRI) 24 godziny po operacji, aby zapewnić prawidłowe miejsce krwawienia i wykluczyć inne istotne patologie wewnątrzczaszkowe.

Model perforacji wewnątrznaczyniowej krwotoku podpajęczynówkowego w połączeniu z obrazowaniem metodą rezonansu magnetycznego (MRI)

Ta praca demonstruje wykorzystanie multimodalnej platformy obrazowania opartej na ultradźwiękach do nieinwazyjnego obrazowania udaru niedokrwiennego. System ten pozwala na ilościowe określenie natlenienia krwi za pomocą obrazowania fotoakustycznego i upośledzonej perfuzji w mózgu za pomocą angiografii akustycznej.

Zintegrowana tomografia fotoakustyczna, ultrasonograficzna i angiograficzna (PAUSAT) do nieinwazyjnego obrazowania całego mózgu udaru niedokrwiennego

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Poznaj metodę obrazowania żywych i martwych perycytów mózgu w wycinkach szczurzych po krwotoku podpajęczynówkowym. Protokół fluorescencyjny umożliwia różnicowanie komórek i badanie apoptozy zależnej od skurczu.

Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym

Przeglądaj więcej filmów