Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym
18 sierpnia 2023
Wstępne dochodzenie potwierdza, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) powoduje zanik perycytów mózgu. Ocena kurczliwości perycytów po SAH wymaga rozróżnienia między żywotnymi i nieżywotnymi perycytami mózgu. W związku z tym opracowano procedurę oznaczania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu jednocześnie w wycinkach mózgu, ułatwiając obserwację przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.
Nasze badanie wykazało znaczny wzrost zgonów okołocytalnych, rozpoczynających się po sześciu godzinach od SAH. Wykazało to dodatnią korelację między liczbą perycytów nieistotnych dla ciała a czasem, jaki upłynął po SAH. Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po SAH i technikach izolacji perycytów posunęło naprzód badania w mojej dziedzinie.
Obecnie dość trudno jest w pełni odróżnić barwione perycyty od barwionych komórek śródbłonka. Nasze badanie wykazało apoptozę zależną od skurczu w perycytach po SAH. Opracowaliśmy bardzo niezawodny protokół, który umożliwia znakowanie fluorescencyjne zarówno funkcjonalnej, jak i niefunkcjonalnej perycyty mózgu podczas resekcji w tym samym czasie.
Aby utworzyć krwotok podpajęczynówkowy lub model SAH, włóż igłę do mikroiniekcji do znieczulonej spłuczki nadsiodłowej szczura. Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknąć autologiczną krew pobraną z tętnicy ogonowej szczura do spłuczki nadsiodłowej. Teraz wszczepić kolejną igłę w prawą boczną komorę mózgową na podanych współrzędnych.
W przypadku modeli SAH wstrzyknij 0,2 mililitra krwi z tętnicy ogonowej szczura. W przypadku grup pozorowanych wstrzyknąć taką samą objętość izotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Po dekapitacji wydobądź cały mózg szczura i zanurz go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF).
Za pomocą wibratomu przygotuj ostre plastry mózgu o wielkości 200 mikrometrów w lodowato zrównoważonym ACSF. Umieść plastry mózgu na nylonowej siatce zanurzonej w zrównoważonym ACSF w komorze do przechowywania w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza. Aby oznaczyć perycyty, dodaj barwnik fluorescencyjny TO-PRO-3 do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF.
Teraz inkubuj świeżo pokrojony mózg szczura w obciążonym barwnikiem ACSF przez 20 minut w ciemnym otoczeniu w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś sitko z siatki nylonowej wraz z plastrami mózgu do sześciodołkowej komory do płukania płytek. Pozostaw plastry mózgu w komorze na 10 minut.
Aby oznaczyć nieistotne perycyty, inkubuj wycinki mózgu znakowane TO-PRO-3 w sprzężonej izolektynie B4 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji płucz plastry mózgu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym przez 15 minut. Następnie umieść plastry mózgu w ACSF zagazowanym 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem.
Do tego dodaj jodek propidyny o stężeniu 37 mikromolów w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać wchłanianie barwnika i zminimalizować etykietowanie tła, płucz preparaty przez 15 minut w ACSF. W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgu nie doświadczają śmierci komórki.
Wykryto żywotne perycyty, które nie były barwione jodkiem propidyny. Modele SAH wykazały kluczowe perycyty w obrębie mikrokrążenia. Wykryto również nieistotne perycyty.
Znakowane jodkiem propidyny nieistotne perycyty pozostały przyłączone do całego mikrokrążenia. Na początek użyj plastikowej pipety Pasteura, aby delikatnie przenieść fluorescencyjnie zabarwione wycinki mózgu do szklanych naczyń konfokalnych. Napełnij te naczynia zrównoważonym ACSF.
Za pomocą żelaznej siatki zabezpiecz plastry mózgu szczura na miejscu. Następnie umieść naczynia konfokalne ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu konfokalnego. Umieść ostry wycinek mózgu na dnie naczynia i perfuzuj z równoważeniem ACSF podczas obrazowania.
Korzystając z obiektywu 40X, zobacz komórki ściany mikrokrążenia kory mózgowej. Następnie użyj kompatybilnego oprogramowania do przechwytywania stosów obrazów. Zidentyfikuj mikrokrążenie mózgowe i perycyty na podstawie ich sieci i morfologii, a następnie zlokalizuj określony region zawierający sieć mikrokrążenia mózgowego na każdym wycinku mózgu i uchwyć obrazy.
W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgu nie doświadczają śmierci komórki. Wykryto żywotne perycyty, które nie były barwione jodkiem propidyny. Modele SAH wykazały kluczowe perycyty w obrębie mikrokrążenia.
Wykryto również nieistotne perycyty. Nieistotne perycyty znakowane jodkiem propidyny pozostały odłączone od całego układu krążenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ krwotoku podpajęczynówkowego (SAH) na perycyty mózgowe, zwracając szczególną uwagę na mechanizmy śmierci komórek perycytów oraz ich kurczliwość. Opracowano model z wykorzystaniem skrawków mózgu szczura w celu odróżnienia perycytów żywotnych od nieżywotnych. Podejście to umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w celu oceny żywotności perycytów po SAH.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia immunofluorescencyjna
Wstęp
- Wiadomo, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) indukuje śmierć perycytów mózgowych.
- Zrozumienie żywotności perycytów po SAH jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów uszkodzeń naczyniowo-nerwowych.
- Obecne metody mają trudności z odpowiednim odróżnieniem perycytów żywych od nieżyjących.
- Konieczne są nowe techniki obrazowania, aby obserwować zmiany w perycytach podczas SAH.
Cel badania
- Ocena kurczliwości pericytów oraz żywotności komórek po poodmaźnym krwotoku podpawłkowym (SAH).
- Opracowanie niezawodnego protokołu jednoczesnego znakowania żywych i martwych pericytów.
- Udoskonalenie technik obrazowania w celu lepszej obserwacji zachowania pericytów w skrawkach mózgu.
Zastosowane metody
- Przekroje mózgu szczura wykorzystano jako model ex vivo do badania pericytów.
- SAH wywołano poprzez wstrzyknięcie autologicznej krwi do cysterny nadsiodłowej u znieczulonych szczurów.
- W badaniu zastosowano techniki immunofluorescencji w celu znakowania pericytów i oceny ich żywotności.
- Kluczowe etapy obejmowały inkubację z barwnikami fluorescencyjnymi oraz badania obrazowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Ocenę żywotności pericytów przeprowadzano w różnych odstępach czasu po wystąpieniu SAH.
Główne wyniki
- Badanie wykazało znaczący wzrost śmiertelności perycytów począwszy od szóstej godziny po SAH.
- Stwierdzono dodatnią korelację między liczbą nieżyjących perycytów a czasem po SAH.
- Pod względem mechanistycznym w perycytach po SAH zaobserwowano apoptozę zależną od skurczu.
- Żywe perycyty zidentyfikowano obok wariantów nieżyjących przy użyciu technik znakowania fluorescencyjnego.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę różnicowania między żywotnymi a nieżywotnymi pericytami po krwotoku podpajęczynówkowym (SAH).
- Otrzymane wyniki pogłębiają zrozumienie dynamiki pericytów w odpowiedziach naczyniowo-nerwowych na uraz.
- Wnioski z badania mają znaczenie dla zrozumienia uszkodzeń naczyniowo-nerwowych w różnych patologiach mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne różnicowanie żywych i nieżyjących perycytów mózgowych w ostrych skrawkach mózgu po krwotoku podpajęczniczym (SAH) wypełnia krytyczną lukę w walidacji celów naczyniowo-nerwowych. Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczą, ilościową ocenę kurczliwości i żywotności perycytów, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na etapie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną wczesnego etapu wyboru celów naczyniowo-nerwowych oraz segregacji portfolio w procesie poszukiwania leków na schorzenia ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację żywotności perycytów po urazie w celu rzetelnej walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez korelację kurczliwości perycytów ze zmianami mikronaczyniowymi po SAH.
- Ułatwia identyfikację celów naczyniowo-nerwowych o predykcyjnej wartości translacyjnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do powtarzalnej oceny funkcji i żywotności pericytów.
- Dostarcza ilościowe wyniki obrazowania odpowiednie do standaryzacji testów i dalszych procesów przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na kurczliwość i przeżywalność pericytów w kontekście tkanek istotnych dla przebiegu choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje pomiary żywotności i kurczliwości perycytów z translacyjnymi biomarkerami uszkodzeń naczyniowo-nerwowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach naczyniowych OUN.
- Służy do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju programów terapeutycznych w obszarze naczyniowo-nerwowym z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoków i procesów roboczych
Niniejszy protokół integruje wczesny etap przejścia od odkrywania do badań przedklinicznych w zakresie celów naczyniowo-nerwowych, łącząc badania mechanistyczne z walidacją modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących dysfunkcji mikrokrażenia zapośredniczonej przez perycyty po krwawieniu podpajęczynówkowym (SAH).
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do opracowywania testów i selekcji związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie żywotności i kurczliwości perycytów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki ex vivo z modelami in vivo uszkodzeń naczyniowo-nerwowych w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia możliwość ponownego wykorzystania przepływu pracy w zakresie obrazowania i znakowania dla portfeli badawczych nad naczyniami OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów naczyniowo-nerwowych i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę żywotności perycytów oraz obrazowanie w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów naczyniowo-nerwowych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o wiarygodne dane dotyczące żywotności.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu konfokalnym i obchodzeniu się z tkanką naczyniowo-nerwową.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znakowania i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych modeli chorób OUN lub gatunków.
- Interpretacja może być ograniczona przez specyficzność barwników oraz nakładanie się z oznakowaniem komórek śródbłonka.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:06
Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging
2:05
Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging
3:40
Confocal Imaging of Vital and Non‐Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices
