Zdalna aktywacja neuronów w połączeniu z automatycznym pobieraniem próbek krwi w celu indukcji i pomiaru krążącego hormonu luteinizującego u myszy
August 25th, 2023
Pulsatywność hormonu luteinizującego (LH) jest cechą charakterystyczną funkcji rozrodczych. Opisujemy protokół zdalnej aktywacji określonych populacji neuronów związany z seryjnym automatycznym pobieraniem krwi. Technika ta pozwala na czasową modulację hormonalną, multipleksowanie i minimalizowanie efektów manipulacji na poziomie LH u przytomnych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych zwierząt.
Naszym celem jest zrozumienie roli określonych populacji neuronów w regulacji pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego. W tym celu wymagamy precyzyjnej kontroli alokacji, tożsamości i aktywności neuronów w połączeniu z sekwencyjnym pobieraniem próbek krwi bez niepokojenia lub stresowania zwierząt. Obecna metoda pobierania sekwencyjnych próbek krwi u przytomnych myszy ogranicza się do nacięć ogona, wymaga długiego okresu szkolenia i jest podatna na kontakt z ludźmi i stres środowiskowy.
Zautomatyzowana infuzja i pobieranie próbek krwi może być przeprowadzane bez obecności badaczy, co ogranicza stres i pozwala na uchwycenie zmian hormonalnych u przytomnych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych myszy. Technika ta jest atutem w badaniach neurobiologicznych, ponieważ zapewnia solidny system wsparcia. Centrum Fenotypowania Metabolicznego Myszy Michigan oferuje zautomatyzowaną infuzję i szerokie eksperymenty z próbkowaniem jako podstawową usługę.
Na początek wstrzyknij zapobiegawczy środek przeciwbólowy znieczulonej myszy. Za pomocą maszynki do strzyżenia ogol głowę myszy. Zainstaluj zwierzę na stole stereotaktycznym i prawidłowo ustaw nauszniki.
Przymocuj usta myszy do części myszy i ostrożnie ustaw język na zewnątrz, aby zapobiec uduszeniu. Po sprawdzeniu głębokości znieczulenia umieść podporę pod zwierzęciem, aby upewnić się, że ciało i głowa pozostają wypoziomowane w poziomie. I użyj ciepłej podkładki z papierem, aby utrzymać temperaturę zwierzęcia.
Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie za pomocą jodu i alkoholu zdezynfekuj głowę myszy. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy, a nacięcie rozciąga się zza oczu, aby założyć szew lambda.
Odsłoń czaszkę i przetrzyj ją sterylną bawełnianą końcówką nasączoną 0,9 roztworem chlorku sodu. Pod mikroskopem stereoskopowym zidentyfikuj żyłę rostralną lub RRV i użyj sterylnego ołówka, aby ją oznaczyć. Używając sterylnej igły jako odniesienia, potwierdź orientację mózgu.
Upewnij się, że współrzędne DV i ML nie uległy zmianie. Następnie umieścić sterylną szklaną pipetę zawierającą roztwór wirusa do punktu odniesienia RRV, aby uzyskać zerowe odniesienie przednio-tylne. Przesuwaj pipetę wzdłuż szwu strzałkowego, aż do osiągnięcia wybranej współrzędnej przednio-tylnej.
Zaznacz to miejsce sterylnym ołówkiem i podnieś igłę. Ostrożnie wywierć małe kółko wokół zaznaczonej pozycji, aby uniknąć złamania górnej zatoki strzałkowej i usuń kawałek czaszki małymi kleszczami. Następnie, używając górnej środkowej zatoki strzałkowej jako bocznego odniesienia pożywki, przesuń pipetę do pozycji i opuść ją, aż dotknie opony twardej jako odniesienie grzbietowo-brzuszne.
Utworzyć niewielką przerwę w oponie twardej i opuścić pipetę do preferowanej pozycji grzbietowo-brzusznej. Wstrzyknąć określoną ilość wirusa związanego z adenowirusem lub wektorami AAV do mózgu i usunąć pipetę. Uwolnij mysz od nauszników.
Następnie zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych. Przenieś zwierzę do oddzielnej, ogrzewanej klatki, aby mogło dojść do siebie. Miej oko na regenerację myszy.
Gdy odzyska przytomność, przywróć go do pierwotnej osłony, gdy w pełni wyzdrowieje. Aby rozpocząć, wstrzyknij myszowi wektory związane z AAV do mózgu myszy. Po trzech do czterech tygodniach od wstrzyknięcia wirusa należy ogolić brzuszne i tylne obszary szyi znieczulonej myszy.
Oczyść ogolone obszary za pomocą trzech peelingów jodowych na zmianę z 70% roztworem etanolu. Wykonaj brzuszne nacięcie w skórze między łopatkami. Następnie umieść gazę chirurgiczną na nacięciu i ułóż zwierzę w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga.
Następnie wykonaj małe pionowe nacięcie po prawej stronie szyi nad obojczykiem, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną i żyłę szyjną. Po oddzieleniu tkanki podskórnej należy odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną i umieścić szew pod żyłą. Zwiąż dystalny koniec żyły szyjnej, aby zatrzymać przepływ krwi.
Za pomocą mikrokleszczy i nożyczek wykonaj małe nacięcie w zapadniętej żyle. Teraz włóż cewnik żylny skosem skierowanym w dół i przesuwaj go proksymalnie w kierunku żyły głównej górnej, aż dotrze do prawego przedsionka. Za pomocą jedwabnego szwu 7-0 przymocuj cewnik do naczynia.
Wypreparuj tkanki łączne, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną. W przybliżeniu wstępnie umieszczono dwie pętle szwów jedwabnych 7-0, które pozostają niezapięte na poziomie, na którym rozdzielają się tętnice szyjne wewnętrzne i zewnętrzne. Aby tymczasowo zatrzymać przepływ krwi, pociągnij wcześniej założoną pętlę do szwów.
Następnie za pomocą mikronożyczek lub igły o rozmiarze 27 utwórz mały otwór w ścianie naczynia. Wprowadzić cewnik tętniczy proksymalnie, zwalniając pętlę szwów i przesunąć cewnik, aby dotrzeć do łuku aorty bez dotykania zastawki aortalnej. Użyj dwóch wstępnie umieszczonych, aby przymocować cewnik do naczynia.
Tuneluj wszystkie cewniki podskórnie, zewnętrznie je z tyłu szyi przez wstępnie nacięte nacięcie i zamknij nacięcie brzuszne. Połącz cewniki z portami żylnymi lub tętniczymi łącznika rurkowego pokrytego silikonem wykonanego z rurki igłowej o rozmiarze 25. Po zamknięciu nacięcia brzusznego zabezpiecz łącznik podskórnie, gdy tylna skóra jest uszczelniona szwami.
Za pomocą drutów chirurgicznych ze stali nierdzewnej napełnij cewniki heparynizowaną solą fizjologiczną i szczelnie zatkaj końce cewników. Aby przymocować zwierzę do automatycznego systemu pobierania krwi 24 godziny po operacji, podłącz hak mocujący do metalowego pierścienia z tyłu szyi i podłącz linię tętniczą. Po podłączeniu cewnika tętniczego do linii iniekcyjnej należy przymocować cewniki żylne do przewodów do pobierania próbek.
Ustawić czas wstrzykiwania i dawkę na 0,5 miligrama na kilogram przy 500 mikrolitrach na minutę. Ustaw czas i częstotliwość pobierania krwi, w tym rozcieńczenie próbki solą fizjologiczną. System automatycznie uzupełni taką samą ilość soli fizjologicznej, aby zastąpić pobraną krew.
Wykonaj automatyczne wstrzyknięcie wstępne. Następnie wykonaj automatyczne wstrzyknięcie dożylne leku N-tlenku klozapiny z szybkością wstrzykiwania 500 mikrolitrów na minutę. Następnie należy pobrać próbki krwi po wstrzyknięciu.
Przedstawiono wzorce hormonu luteinizującego u dorosłych samic kiss1-EYFP, które otrzymały jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV-hM3Dq mCherry w jądro łukowate. Poziomy hormonu luteinizującego są na ogół niskie, ale zwykle obserwuje się różnice ze względu na jego pulsacyjne uwalnianie. Gwałtowny wzrost poziomu hormonu luteinizującego występuje w odpowiedzi na wstrzyknięcie N-tlenku klozapiny.
Większość neuronów mCherry zlokalizowanych jednocześnie z Kiss1-EYFP wykazała, że aktywacja wirusa i neuronów jest specyficzna dla populacji docelowej. Pokazano pulsacyjny wzorzec uwalniania hormonu luteinizującego u myszy typu dzikiego, po którym następuje odpowiedź na wstrzyknięcie IP kisspeptyny-10. Zaobserwowano wyraźne impulsy hormonu luteinizującego typowe dla samicy w dierui, wykazujące niski poziom podstawowego hormonu luteinizującego.
W odpowiedzi na podanie kisspeptyny wykryto natychmiastowy i silny wzrost hormonu luteinizującego.
Przegląd
To badanie bada rolę określonych populacji neuronów w regulacji pulsującej sekrecji hormonu luteinizującego (LH). Autorzy przedstawiają protokół, który umożliwia zautomatyzowane pobieranie krwi i aktywację neuronów u zdrowych i nieprzerwanych zwierząt, pozwalając na precyzyjne monitorowanie zmian hormonalnych bez stresu związanego z ludzką obsługą.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Endokrynologia
- Zautomatyzowane monitorowanie fizjologiczne
Tło
- Pulsacyjna sekrecja hormonu luteinizującego (LH) jest niezbędna dla funkcji rozrodczych.
- Obecne metody pobierania krwi u świadomych myszy są ograniczone i wywołujące stres.
- Zautomatyzowane techniki mogą zmniejszyć stres zwierząt, poprawiając jakość danych.
- Zrozumienie kontroli neuronowej nad uwalnianiem hormonów podwzgórzowych jest kluczowe dla badań nad zdrowiem rozrodczym.
Cel badania
- Rozwój metody zdalnej aktywacji neuronów związanych z sekrecją LH.
- Możliwość sekwencyjnego pobierania krwi u świadomych myszy bez stresu.
- Poprawa niezawodności monitorowania hormonów w eksperymentach neuronaukowych.
Stosowane metody
- Do manipulacji aktywnością neuronów zastosowano stereotaksyczne wstrzyknięcie wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do mózgu.
- Badanie wykorzystywało świadome, swobodnie poruszające się myszy do pomiarów fizjologicznych.
- Zastosowano zautomatyzowane systemy pobierania krwi, aby zmniejszyć interwencję człowieka.
- Procedury obejmowały staranne techniki chirurgiczne do wszczepienia cewników dla dostępu tętniczego i żylnego.
Główne wyniki
- Opracowany protokół z powodzeniem umożliwił monitorowanie pulsacji LH i reakcji na aktywność neuronów.
- Zautomatyzowane pobieranie próbek zminimalizowało efekty stresu, poprawiając integralność danych.
- Wyniki zapewniają wgląd w dynamikę modulacji hormonalnej poprzez sterowanie neuronami.
Wnioski
- To badanie pokazuje skuteczną metodę badania kontroli neuronowej nad funkcjami endokrynologicznymi.
- Podejście to umożliwia lepsze zrozumienie regulacji LH, co ma zastosowanie w badaniach nad zdrowiem rozrodczym.
- Możliwość tej metody do rejestrowania zmian hormonalnych u nieprzerwanych zwierząt znacząco przyczynia się do metodologii neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise, stress-free measurement of circulating luteinizing hormone (LH) in conscious mice addresses a critical bottleneck in neuroendocrine target validation and mechanistic de-risking for reproductive biology. Automated neuronal activation and blood sampling enable high-fidelity, quantitative readouts essential for early discovery and translational research. This approach enhances predictive confidence in neuroendocrine pathway interrogation and supports risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of specific neuronal populations controlling LH secretion for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating neuronal input effects on hormone release.
- Provides quantitative, time-resolved hormone data to inform predictive models.
- Facilitates portfolio triage by clarifying neuroendocrine pathway contributions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible hormone measurements in undisturbed, freely moving animals.
- Standardizes assay conditions by minimizing environmental and handling stress artifacts.
- Enables scalable, automated sampling for robust compound or genetic screening.
- Supports reliable evaluation of neuroendocrine modulators in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical hormone dynamics with disease-relevant neuroendocrine endpoints.
- Ensures continuity from mechanistic discovery to translational biomarker development.
- Reduces biological risk by providing high-confidence, physiologically relevant data.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroendocrine targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless hypothesis testing and quantitative readouts across the neuroendocrine research continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neuronal control over hormone secretion.
- Screening: Provides reproducible, automated hormone assays for compound or genetic screens.
- Analytics: Delivers high-resolution, quantitative LH measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical biomarker validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neuroendocrine pathway studies across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroendocrine research.
- Operational Value: Standardizes and automates sampling, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroendocrine targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and neuroendocrine physiology.
- Needs access to automated blood sampling and infusion instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for data comparability.
- Adaptation may be needed for different neuronal targets or hormonal endpoints.
- Potential limitations include surgical complexity and animal welfare considerations.
