Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Nasze badania dotyczą skutecznych kombinacji zmodyfikowanych bakterii i komórek CAR-T w leczeniu guzów litych. Ważne jest dla nas, aby zbadać, jak te dwie terapie komórkowe działają w kontekście kompletnego układu odpornościowego przy użyciu syngenicznych modeli raka myszy. Badanie funkcji komórek CAR-T w syngenicznych modelach nowotworów było ograniczone przez brak znormalizowanych protokołów generowania mysich komórek CAR-T.

Mysie limfocyty T są szczególnie trudne do transdukcji i hodowli ex vivo przy użyciu tradycyjnych metod. Opracowaliśmy ten protokół, aby usprawnić produkcję mysich komórek CAR-T, aby umożliwić badanie w modelach syngenicznych, które zapewniają ważny kontekst do oceny aktywności nowych technologii CAR. Na początek należy odpipetować 3,75 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do probówki oznaczonej A i rozcieńczyć pożywkę 105 mikrolitrami odczynnika do transfekcji.

Zmieszaj zawartość probówki, aby dobrze wymieszać. Następnie dodaj 3,75 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do probówki oznaczonej B. Rozcieńczyć plazmidy ekspresyjne 90 mikrolitrami odczynnika wzmacniającego. Teraz dodaj zawartość probówki A do probówki B i odpipetuj roztwór, aby dobrze wymieszał przed inkubacją.

Ostrożnie usuń 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych z przygotowanej płytki Phoenix-ECO. Następnie stopniowo dodawać całą objętość mieszanki transfekcyjnej do płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Umieść pożywkę do zbierania wirusów MTCM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ją podgrzać. Teraz przechyl płytkę Phoenix-ECO i odpipetuj pożywkę hodowlaną. Następnie powoli odpipetować 30 mililitrów podgrzanego podłoża do zbierania wirusów na przechyloną płytkę.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze. Po 48 godzinach od transfekcji zbierz supernatant wirusa. Przefiltruj go przez filtry PVDF o średnicy 0,45 mikrometra.

Grzbietem sterylnej strzykawki zmiażdż izolowane mysie śledziony przez sitko o średnicy od 70 do 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie umyj sitko 5 mililitrami buforu do izolacji komórek T. Po doprowadzeniu końcowej objętości komórek do 50 mililitrów, policz komórki za pomocą hemocytometru.

Granulować komórki przez odwirowywanie przez 10 minut w 450 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy zawierający splenocyty za pomocą zalecanego zestawu do izolacji limfocytów T. Następnie wyizoluj limfocyty T CD3-dodatnie za pomocą selekcji negatywnej.

Przenieś magnetycznie oddzielony izolat do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Ponownie sprawdź liczbę komórek. Odwirować wyizolowane limfocyty T przez 10 minut w temperaturze 450 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś paletę komórek w pożywce aktywacyjnej MTCM. Teraz dodaj kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami i interleukinę-2 do zawiesiny komórek, aby aktywować limfocyty T. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

W dniu zero, wstępnie pokryj nieleczone, sterylne, 24-dołkowe płytki 0,5 mililitra ludzkiego odczynnika wzmacniającego transdukcję fibronektyny. Przechowuj płytki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia usuń odczynnik transdukcji ze studzienek.

Zatkać studzienki równą objętością sterylnie przefiltrowanego, uzupełnionego BSA PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij BSA PBS i umyj studzienki 0,5 do 1 mililitra PBS. Następnie dodaj 1 mililitr schludnego retrowirusa do każdej wstępnie zakodowanej studzienki.

Odwirować płytkę w temperaturze 2000 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 1 mililitr aktywowanych limfocytów T do każdej studzienki obciążonej wirusem. Ponownie odwirować płytki w temperaturze 450 G przez 10 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Piątego dnia ponownie zawieś komórki, aby oddzielić aktywowane limfocyty T od kulek pokrytych przeciwciałem. Umieść zawiesinę komórek na magnesie na 30 sekund, a następnie przenieś zawiesinę do naczynia do hodowli ex vivo.

Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed analizą cytometryczną przepływową. Zastosowanie zestawu do izolacji komórek T pozwoliło uzyskać czystość komórek T poniżej 98% przed transdukcją. Osiągnięto powtarzalne wskaźniki ekspresji CAR na poziomie od 65 do 75%.

Posiewy ex vivo z interleukinami 7 i 15 doprowadziły do 15-krotnego wystąpienia do 10 dnia po aktywacji z pojedynczej śledziony. Hodowla limfocytów T z interleukinami doprowadziła do porównywalnych częstości występowania limfocytów T CD8-dodatnich i CD4-dodatnich. Po 10 dniach hodowli ex vivo zaobserwowano, że populacje pamięci komórek macierzystych są zachowane.