Name: Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Naucz się izolować astrocyty i mikroglej z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do badań in vitro. Ta metoda umożliwia analizę transkryptomiczną i badanie patologii rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Castle Raley z George Washington University Genomics Core za analizy RNA oraz Q2 Lab Solutions za analizy sekwencjonowania RNA. Praca ta była wspierana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke [grant numer F31NS117085] oraz Vivian Gill Research Endowment dla dr Roberta H. Millera. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone po zatwierdzeniu przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Szkole Medycyny i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu George'a Washingtona (Waszyngton, D.C., USA; IACUC#2021-004). W badaniu wykorzystano samce i samice myszy typu dzikiego C57BL / 6J (WT) w wieku od 10 tygodni do 5 miesięcy, które pochodziły od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów) i były trzymane na Uniwersytecie George'a Washingtona. Przegląd przepływu pracy protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.
1. Przygotowanie rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzęta za pomocą Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribromoetanolu i 2,5% 2-metylo-2-butanolu w sterylnej wodzie) (patrz tabela materiałów). Potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u nóg i ogona u myszy.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję serca zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem 1x Dulbecco (DPBS), aby usunąć jednojądrzaste komórki krwi obwodowej.
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę na płytkiej tacy i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić jamę opłucnej. Wprowadzić igłę perfuzyjną 23 G podłączoną do pompy perystaltycznej (patrz Tabela materiałów) do lewej komory i aktywować pompę. Gdy zimny DPBS przepłynie przez serce, utwórz małe nacięcie w prawym przedsionku. 
		UWAGA: Na tym etapie preferowana jest szybsza szybkość perfuzji w celu zwiększenia żywotności komórek. Krew powinna zostać wypłukana w czasie krótszym niż 1 minuta. Oczyszczenie wątroby wskazuje na udaną perfuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia dużymi nożycami i usuń kręgosłup14. Zanurz go w zimnym 1x DPBS z Ca2 + / Mg2 + / 0,2% glukozy na szalce Petriego na lodzie w celu płukania tkanek.</li>
	<li>Zaczynając od teraz, upewnij się, że wszystkie kroki są wykonywane w sterylnym środowisku. Użyj wytłaczania hydraulicznego14, aby odizolować cały rdzeń kręgowy. Użyj igły 18 G i strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej zimnym 1x DPBS z Ca2 + / Mg2 + / 0,2% glukozy. Przenieś rdzeń kręgowy na szalkę Petriego umieszczoną na okładach z lodu zawierających wystarczającą ilość zimnego 1x DPBS z Ca2 + / Mg2 + / 0,2% glukozy, aby zanurzyć całą tkankę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń opony mózgowe pod mikroskopem w okapie z przepływem laminarnym. Przenieś rdzeń kręgowy na pustą szalkę Petriego na okładach z lodu i za pomocą skalpela chirurgicznego z ostrzem nr 10 przetnij cały rdzeń kręgowy na odcinki o długości 2-3 mm.</li>
</ol>
2. Enzymatyczna dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Dodaj mieszankę enzymów 1 i mieszankę enzymów 2 z dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji mózgu dla dorosłych zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów). Zamieszać enzymy w naczyniu kilka razy, aby zapewnić równomierne pokrycie rdzenia kręgowego, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Co 5 minut delikatnie obracaj naczynie, aby zapobiec zbrylaniu się tkanek i ułatwić równomierne rozprowadzenie odczynników.</li>
	<li>Wyjąć naczynie z inkubatora i dodać 350 μl 0,46 mg/ml DNAzy I w pożywce MEM (patrz tabela materiałów). Wymieszaj, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zimnej DMEM/0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i wymieszaj, delikatnie mieszając. Natychmiast przenieś całą zawartość do probówki o pojemności 5 ml.</li>
</ol>
3. Mechaniczna dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Za pomocą pipety P1000 delikatnie rozcieraj tkankę trzy razy, upewniając się, że kawałki tkanki są za każdym razem pobierane w celu dalszej dysocjacji tkanki. Następnie, używając zatkanej 9-calowej szklanej pipety Pasteura, delikatnie rozetrzyj jeszcze pięć razy, upewniając się, że podczas procesu nie powstają pęcherzyki.</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 5 ml pionowo i pozwól chusteczce osiąść na dnie przez 30 sekund. Gdy tkanka się uspokoi, pobrać supernatant za pomocą pipety P1000 i przepuścić go przez filtr 30 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Do tej samej probówki o pojemności 5 ml z pozostałą tkanką dodaj 1 ml zimnego DMEM/0,5% FBS. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie rozetrzyj trzy razy.</li>
	<li>Pozwól tkance osiąść na dnie przez 30 s, a następnie przepuść supernatant przez filtr 30 μm i zbierz go do tej samej probówki o pojemności 15 ml, co poprzednio. Powtórz krok 3.3 i krok 3.4 jeszcze raz.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie usunąć i wyrzucić powstały supernatant za pomocą aspiratora próżniowego.</li>
</ol>
4. Usuwanie mieliny
<ol>
	<li>Usuń mielinę za pomocą roztworu do usuwania zanieczyszczeń (DRS) dostarczonego w zestawie do dysocjacji mózgu dla dorosłych, postępując zgodnie z protokołem producenta. Po usunięciu zanieczyszczeń dodaj 5 ml zimnego DMEM/0,5% FBS do osadu komórkowego i delikatnie odwróć probówkę trzy razy. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Jeśli komórki zostaną wykorzystane do badań in vitro i pozostaną w hodowli, zamiast tego należy użyć wstępnie ogrzanego DMEM/0,5% FBS.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DPBS/0,5% FBS (zimny do badań RNA i ciepły do testów in vitro). Policz komórki i oceń żywotność za pomocą błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Zawiesiny komórkowe pochodzące od wielu zwierząt mogą być łączone w celu zwiększenia stężenia komórek.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając DPBS/0,5% FBS do całkowitej objętości 5 ml. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
</ol>
5. Izolacja mikrogleju i astrocytów
<ol>
	<li>Oznacz ogniwa mikrogranulkami anty-CD11b lub anty-ACSA-2 zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Posortuj komórki według wyboru pozytywnego za pomocą kolumn MS zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Spis materiałów). Po sortowaniu odwirować posortowane komórki o stężeniu 300 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
</ol>
6. Posiewanie komórek do testów in vitro
UWAGA: Jeśli komórki nie zostaną posiane i zostaną natychmiast użyte do analizy RNA, przejdź do kroku 8.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłego DMEM/0,5% FBS. Policz komórki i oceń ich żywotność za pomocą hemacytometru (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do 75 000 komórek na 50 μl. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek do każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną class<="xref">11 w płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby komórki mogły przylgnąć do szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 450 μl ciepłego DMEM/5% FBS/Penicyliny-Streptomycyny (Pen-Strep, patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki.</li>
	<li>Po 3 dniach zastąp połowę podłoża 250 μl ciepłego DMEM/5% FBS/Pen-Strep. W celu konserwacji należy całkowicie wymieniać pożywkę na 500 μl ciepłego DMEM/5% FBS/Pen-Strep co 4-5 dni.</li>
</ol>
7. Immunohistochemia
UWAGA: Najlepiej jest wykonywać analizy immunohistochemiczne po co najmniej 3 dniach, gdy podłoże zostało przynajmniej raz wymienione. Dzięki temu zanieczyszczenia zostały usunięte, a komórki całkowicie przylegają do szkiełka nakrywkowego.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę i oznaczyć komórki anty-mysim mAb O4 (1:100) (patrz Tabela Materiałów) w ciepłym DMEM/5% FBS/10% normalnej surowicy koziej (NGS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Pomiń ten krok i przejdź do kroku 7.3, jeśli komórki nie będą oznaczone O4.</li>
	<li>Delikatnie spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je trzykrotnie w ciepłym DMEM/5% FBS. Dodać kozi anty-mysi 594 IgM (1: 300) (patrz tabela materiałów) w ciepłym DMEM/5% FBS/10% NGS i inkubować w temperaturze RT przez 15 minut w ciemności. Delikatnie spłucz trzy razy w ciepłym DMEM/5% FBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki zimnym 5% kwasem octowym/metanolem przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć trzy razy 1x PBS, a następnie oznaczyć odpowiednim przeciwciałem: anty-króliczym GFAP (1:500), anty-mysim GFAP (1:500) lub anty-króliczym Iba1 (1:500) w 1% Triton-X100/10% NGS w 1x DPBS (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w ciemności, jeśli zostały już poplamione O4.</li>
	<li>Delikatnie spłucz trzy razy PBS. Oznaczyć odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym: anty-mysie 594 IgG (1: 500), anty-króliczym 488 IgG (1: 500) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Delikatnie spłucz trzy razy PBS. Barwienie przeciwstawne za pomocą DAPI (1: 1000) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Spłukać trzykrotnie PBS, dodać podłoże montażowe (patrz Tabela Materiałów) i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.</li>
</ol>
8. Ekstrakcja RNA
UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby było co najmniej 100 000 komórek, aby wydobyć wystarczającą ilość RNA do analizy. W razie potrzeby można połączyć komórki z 2-3 rdzeni kręgowych.
<ol>
	<li>Ekstrahować RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Dla każdego etapu mycia z buforem płuczącym RW1 znajdującym się w zestawie, pozostaw komórki w buforze mycia na dodatkowe 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć wszelkie pozostałe genomowe DNA za pomocą DNazy I zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Inkubować z DNazą w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie przemyć buforem RW1.</li>
	<li>Aby zwiększyć wydajność RNA, przed elucją, należy inkubować próbki w wodzie wolnej od RNAzy w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Oceń integralność i ilość RNA za pomocą bioanalizatora15 (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

Efficient Extraction of Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
<li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons%3A+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic%2C+infectious%2C+inflammatory%2C+and+autoimmune+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712(2019).</li>
<li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia%3A+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).</li>
<li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration%2C+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).</li>
<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226(2017).</li>
<li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li>
<li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Żaden

Izolacja czystych, żywotnych komórek pierwotnych ma zasadnicze znaczenie dla badania struktury i funkcji określonych typów komórek. U dorosłych myszy, szczególnie w rdzeniu kręgowym, zadanie to stanowi poważne wyzwanie, ponieważ istniejące protokoły często nie są dostosowane do dorosłego rdzenia kręgowego10,17. Protokół ten przedstawia wydajną i opłacalną metodę mającą zastosowanie w różnych dalszych zastosowaniach, w tym w hodowli komórek, cytometrii przepływowe...

Astrocyty i mikroglej to wszechstronne komórki glejowe, które odgrywają istotną rolę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), obejmując takie obowiązki, jak regulacja funkcji neuronów, przyczynianie się do rozwoju OUN, utrzymywanie bariery krew-mózg i uczestniczenie w innych krytycznych procesach1,2,3,4. Oprócz swojej roli w utrzymaniu homeostazy, te komórki glejowe odgrywają również kluczową rolę w mechanizmach uszkodzeń i naprawy. Mikroglej jest dobrze znany ze swoich zdolności fagocytarnych, zapalnych i migracyjnych po zniewagach lub urazach5,6,7. Odpowiedzi astrocytów w chorobie są równie zróżnicowane i obejmują udział w stanie zapalnym, tworzeniu się blizn glejowych i naruszeniu bariery krew-mózg8,9. Chociaż nasza wiedza na temat szkodliwej i naprawczej roli mikrogleju i astrocytów w OUN wzrosła, nieodłączna heterogeniczność zarówno ich struktury, jak i funkcji wymaga solidnych narzędzi do badania ich w różnych kontekstach.
Uzyskanie dalszego wglądu w rolę mikrogleju i astrocytów w zdrowiu i chorobie wymaga połączonego podejścia badań in vivo i in vitro. Techniki in vivo wykorzystują skomplikowane wzajemne oddziaływanie między komórkami glejowymi a neuronami w obrębie OUN, podczas gdy metodologie in vitro okazują się przydatne przy ocenie funkcji pojedynczych komórek lub reakcji na określone bodźce. Każda metoda ma unikalne zalety; Badania in vitro są niezbędne do zrozumienia specyficznych ról tych typów komórek bez bezpośredniego lub pośredniego udziału sąsiednich komórek. Ponadto testy in vitro wykorzystujące nieśmiertelne linie komórkowe oferują pewne korzyści, w tym zdolność do rozmnażania się w nieskończoność, opłacalność i łatwość konserwacji. Należy jednak zauważyć, że komórki pierwotne bardziej naśladują normalne reakcje fizjologiczne w porównaniu z liniami komórkowymi. To fizjologiczne znaczenie ma kluczowe znaczenie w testach funkcjonalnych i analizach transkryptomicznych.
Jednym z wyzwań w pozyskiwaniu komórek pierwotnych, szczególnie z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, jest ilość i żywotność próbek. Dorosły rdzeń kręgowy, mniejszy niż mózg i zawierający znaczną ilość mieliny, stwarza wyjątkowe trudności. Chociaż istnieje kilka opublikowanych protokołów szczegółowo opisujących izolację czystych, żywotnych komórek glejowych od noworodków lub mózgu dorosłej myszy 10,11,12,13, te metodologie mogą nie być odpowiednie do badania chorób i urazów specyficznych dla rdzenia kręgowego. W tym protokole oferujemy kompleksową procedurę skutecznego izolowania czystego, żywotnego mikrogleju i astrocytów z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając dalsze zastosowania w hodowli komórkowej i analizach transkryptomicznych. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wyizolowania tych komórek od dorosłych myszy w wieku od 10 tygodni do 5 miesięcy, wykazując jego użyteczność w różnych kontekstach, w tym w badaniach z udziałem myszy z warunkowym nokautem, odpowiedziami na leki, badaniami rozwojowymi i modelami związanymi z wiekiem.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol, 98%</td><td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>45% roztwór glukozy</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką 5 ml</td><td>Kwas</td><td></td> octowy Eppendorf 30122305 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrokulek anty-ACSA2</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent Technologie</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>myszy typu dzikiego (WT) C57BL/6J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (mikroglej) Mikrokulki</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 i mikro; m filtr</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczająca (hemacytometr)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNaza do oczyszczania RNA</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP (mysz)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP (królik)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysz 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Kozioł anty-Królik 488</td><td>IgG Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało Iba1 (królik)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Separator MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>System pomp Masterflex C/L</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Montaż podłoża</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS Kolumny</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało O4</td><td>R& D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Zatkana 9-calowa szklana pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek Ostrze do skalpela chirurgicznego nr 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji małych żył, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocyty i mikroglej odgrywają kluczową rolę w rozwoju ośrodkowego układu nerwowego, reagowaniu na urazy i chorobach neurodegeneracyjnych. Te wysoce dynamiczne komórki wykazują szybkie reakcje na zmiany środowiskowe i wykazują znaczną niejednorodność pod względem morfologii, profili transkrypcyjnych i funkcji. Chociaż nasza wiedza na temat funkcji komórek glejowych w zdrowiu i chorobie znacznie się rozwinęła, nadal istnieje potrzeba przeprowadzenia in vitro analiz specyficznych dla komórek w kontekście urazów lub urazów, aby kompleksowo scharakteryzować różne populacje komórek. Izolowanie komórek od dorosłej myszy ma kilka zalet w porównaniu z liniami komórkowymi lub noworodkami, ponieważ pozwala na analizę komórek w warunkach patologicznych i w określonych punktach czasowych. Ponadto skupienie się na izolacji specyficznej dla rdzenia kręgowego, z wyłączeniem zajęcia mózgu, umożliwia badania nad patologiami rdzenia kręgowego, w tym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego, uszkodzeniem rdzenia kręgowego i stwardnieniem zanikowym bocznym. Protokół ten przedstawia skuteczną metodę izolowania astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając natychmiastową lub przyszłą analizę z potencjalnymi zastosowaniami w dalszych badaniach funkcjonalnych, molekularnych lub proteomicznych.

Metody przedstawione w niniejszym protokole umożliwiają wyizolowanie czystych i żywotnych mikroglejów oraz astrocytów z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, co ułatwia różnorodne dalsze zastosowania, w tym funkcjonalne lub histologiczne analizy in vitro oraz analizę RNA.
Pomyślna izolacja do badań in vitro doprowadzi do ciągłej proliferacji komórek przez kilka dni. Komórki dorosłe wykazują wolniejsze tempo proliferacji w porównaniu z komórkami izolowanymi od zwierząt noworodkowy...

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Nasze badania mają na celu scharakteryzowanie określonych populacji komórek w ośrodkowym układzie nerwowym, w szczególności w rdzeniu kręgowym, przy użyciu przedklinicznych modeli choroby. Próbujemy ustalić, w jaki sposób te komórki są dotknięte w warunkach patologicznych i w różnych punktach czasowych. Analiza komórek może być trudna, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym, ponieważ komórki w mózgu i rdzeniu kręgowym tworzą bardzo złożoną matrycę, a wszystko jest bardzo ściśle połączone, więc może być trudno wyizolować te komórki bez uszkodzenia systemu.Nasz protokół rozwiązuje problemy z istniejącymi metodami badania chorób rdzenia kręgowego poprzez skuteczne izolowanie żywotnych mikrogleju i astrocytów z małego, bogatego w mielinę dorosłego rdzenia kręgowego myszy. Umożliwia to prowadzenie badań in vitro nad chorobami związanymi z rdzeniem kręgowym w dalszej analizie, wypełniając kluczową lukę badawczą. Protokół ten ma kilka zalet, takich jak analiza astrocytów i mikrogleju w warunkach patologicznych i w określonych punktach czasowych.Koncentruje się również wyłącznie na izolowaniu komórek glejowych z tego dorosłego rdzenia kręgowego, z wyłączeniem zajęcia mózgu. Dzięki temu naukowcy mogą badać patologie rdzenia kręgowego na poziomie komórkowym. Aby rozpocząć, usuń rdzeń kręgowy myszy pozbawionej głowy, która została perfuzjona PBS.Zanurz rdzeń kręgowy w zimnym DPBS na szalce Petriego na lodzie. Za pomocą igły o rozmiarze 18 i 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej zimnym DPBS użyj wytłaczania hydraulicznego, aby odizolować cały rdzeń kręgowy w kapturze z przepływem laminarnym. Przenieś rdzeń kręgowy na szalkę Petriego z zimnymi DPBS umieszczonymi na okładach z lodu.Za pomocą mikroskopu wewnątrz okapu z przepływem laminarnym ostrożnie usuń wszelkie widoczne opony mózgowe ostrymi kleszkami. Następnie przenieś rdzeń kręgowy na pustą szalkę Petriego i użyj ostrza skalpela chirurgicznego numer 10, aby pociąć go na odcinki o długości od dwóch do trzech milimetrów. W celu enzymatycznej dysocjacji komórek rdzenia kręgowego dodaj mieszanki enzymatyczne jeden i dwa do kawałków rdzenia kręgowego.Zamieszaj enzymy w naczyniu kilka razy, aby zapewnić równomierne pokrycie rdzenia kręgowego. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, ręcznie obracając naczynie co 10 minut. Po inkubacji dodaj 350 mikrolitrów DNAzy I. Delikatnie zamieszaj naczynie, aby wymieszać.Następnie dodaj jeden mililitr zimnego DMEM uzupełnionego 0,5% FBS przed delikatnym wymieszaniem. Natychmiast przenieś całą zawartość do pięciomililitrowej tuby. Za pomocą pipety P1000 delikatnie rozcieraj tkankę trzy razy.Następnie użyj zatkanej dziewięciocalowej szklanej pipety Pasteura, aby delikatnie rozcierać tkankę jeszcze pięć razy. Umieść rurkę pionowo na 30 sekund, aby tkanka mogła się uspokoić. Za pomocą pipety P1000 odessać supernatant i przenieść go przez filtr 30 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Do probówki z pozostałymi tkankami dodaj jeden mililitr DMEM uzupełnionego FBS. Następnie delikatnie rozetrzeć trzykrotnie pipetą Pasteura. Po pozostawieniu tkanki na dnie, przepuść supernatant przez filtr 30 mikrometrów i zbierz go do tej samej 15-mililitrowej probówki, której używano wcześniej.Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 300G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj aspiratora próżniowego, aby ostrożnie wyrzucić supernatant. Użyj roztworu do usuwania zanieczyszczeń dostarczonego w zestawie do dysocjacji mózgu dla dorosłych, aby usunąć mielinę z osadu komórkowego.Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM uzupełnionego FBS do granulki i delikatnie odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać. Po odwirowaniu odrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze DPBS uzupełnionego FBS. Ponownie odwirować przed wyrzuceniem supernatantu.Oznacz ogniwa mikrokulkami anty-ACSA-2, postępując zgodnie z protokołem producenta. Użyj kolumn separacji magnetycznej, aby oddzielić komórki przez wybór pozytywny. Następnie odwirować komórki w temperaturze 300 G przez 10 minut, przed wyrzuceniem supernatantu.Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze ciepłego DMEM uzupełnionego FBS. Przenieś zawiesinę komórek do hemocytometru, aby policzyć komórki i ocenić ich żywotność. Dostosuj stężenie komórek do 75 000 komórek na 50 mikrolitrów za pomocą FBS/DMEM.Następnie przenieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe pokryte poli-l-lizyną na płytce 24-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby mogła przylgnąć do szkiełka nakrywkowego. Następnie ostrożnie dodaj 450 mikrolitrów ciepłego antybiotyku uzupełnionego FBS / DMEM do każdej studzienki.Zaobserwowano udaną izolację i proliferację mikrogleju i astrocytów. Czwartego dnia zaobserwowano, że astrocyty tworzą dłuższe procesy, podczas gdy owalne komórki mikrogleju z krótszymi wrzecionami były widoczne. Astrocyty utworzyły połączoną, zlewającą się warstwę do siódmego dnia, przy czym mikroglej wykazywał mniej i krótsze procesy.Sortowanie komórek potwierdziło od 92 do 93% żywotności izolowanej hodowli komórkowej.

isolation-pure-astrocytes-microglia-from-adult-mouse-spinal-cord-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Mikroglej jest uważany za jedne z najbardziej wszechstronnych komórek w organizmie, zdolne do adaptacji morfologicznej i funkcjonalnej. Ich heterogeniczność i wielofunkcyjność umożliwiają utrzymanie homeostazy mózgu, a jednocześnie są powiązane z różnymi patologiami neurologicznymi. Tutaj opisano technikę oczyszczania mikrogleju rdzenia kręgowego.

Szybkie i skuteczne wzbogacenie mikrogleju rdzenia kręgowego myszy

Naucz się izolować astrocyty i mikroglej z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do badań in vitro. Ta metoda umożliwia analizę transkryptomiczną i badanie patologii rdzenia kręgowego.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Przeglądaj więcej filmów