21 listopada 2023
Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.
Celem naszych badań jest zbadanie powstawania obwodów nerwowych w rozwijającej się korze mózgowej. Naszym celem jest zrozumienie roli aktywności neuronalnej w tym procesie. W ostatnich latach mikroskopia dwufotonowa pozwoliła zaobserwować proces powstawania obwodów neuronalnych u żywych zwierząt.
Opracowaliśmy metodę obrazowania pojedynczych neuronów w korze mózgowej noworodka. Jednocześnie badając wzorce aktywności i zmiany w ich morfologii, będziemy w stanie wyjaśnić, które wzorce aktywności są zaangażowane w tworzenie celów neuronalnych. Aby rozpocząć, przymocuj dwuosiowy goniometr z tytanową płytką do płytki stolika w celu pozycjonowania XY pod mikroskopem.
Aktywuj oprogramowanie do skanowania, ustaw piksele na 512 na 512 dwukierunkowe na włączone za pomocą obiektywu 20X. Po wykonaniu operacji okna czaszki umieść szczenię wyrażające GCaMP po jednej stronie półkuli na poduszce grzewczej. Za pomocą przymocuj tytanowy pręt do głowicy do tytanowej płytki.
Następnie wyreguluj kąt okna w poziomie za pomocą goniometru. Oświetl powierzchnię mózgu podświetleniem i wybierz obszar obrazowania za pomocą pozycjonowania XY z soczewką obiektywową 5X. Pod soczewką 20X zanurzoną w wodzie podawaj krople do oczu do okienka czaszki.
Po wyłączeniu podświetlenia zeskanuj powierzchnię mózgu w trybie jednego fotonu. Zwiększ intensywność lasera, aby uwidocznić zieloną autofluorescencję ze szkła i powierzchni mózgu. Zakryj mikroskop, aby zapobiec zakłóceniom światła zewnętrznego.
Uruchom oprogramowanie do skanowania w trybie dwóch fotonów do obrazowania. Następnie skalibruj moc lasera i wzmocnienie detektora, aby optymalnie zobrazować sygnały GCaMP. Zlokalizuj głębokość w obszarze obrazowania wypełnionym wieloma neuronami wykazującymi ekspresję GCaMP, a następnie rozpocznij obrazowanie poklatkowe, aby przechwycić sygnały GCaMP.
Mikroskopia fotonowa wykazała aktywność neuronów warstwy czwartej w korze beczkowej młodego młodego po urodzeniu w szóstym dniu z zieloną fluorescencją. Zielony GCaMP był bardziej widoczny, co skutkowało wyciekiem sygnału do czerwonego kanału i identyfikacją 14 obszarów zainteresowania. Aby rozpocząć, uruchom MATLAB i wykonaj łatwy zestaw narzędzi wapniowych, aby uzyskać dostęp do początkowego graficznego interfejsu użytkownika.
W początkowym graficznym interfejsie użytkownika wybierz opcję Korekcja ruchu, aby otworzyć graficzny interfejs korekcji ruchu. Użyj opcji Dodaj pliki, aby przesłać plik TIFF zawierający dane obrazowania. Następnie ustaw niesztywną korekcję ruchu na pustą, współczynnik zwiększania próbkowania na 50, maksymalne przesunięcie na 15, początkową wielkość partii i szerokość pojemnika na 200.
Kliknij Uruchom korekcję ruchu, aby rozpocząć korektę. W początkowym graficznym interfejsie użytkownika aktywuj automatyczne wykrywanie ROI, aby uzyskać dostęp do graficznego interfejsu użytkownika wykrywania ROI. Użyj funkcji Dodaj pliki, aby zaimportować dane obrazowania z korekcją ruchu.
Ustaw inicjalizację na zachłanność, metodę wyszukiwania na elipsę, dekonwolucję na ograniczony FOOPSI SPGL1 i autoregresję na zanik. Następnie ustaw szacowaną liczbę ROI na 60. Przypisz szacowaną szerokość ROI do 17, próg scalania do 0,95, współczynnik krówki do 0,95, przestrzenne i czasowe zmniejszanie próbkowania do jednego, a iteracje czasowe do pięciu.
Następnie kliknij przycisk Uruchom wykrywanie ROI, aby rozpocząć proces wykrywania. W początkowym graficznym interfejsie użytkownika wybierz opcję Uściślanie ROI, aby uruchomić GUI uściślania ROI. Użyj przycisku Załaduj dane, aby zaimportować dane ROI.
Wybierz ROI o niskiej częstotliwości aktywności znajdujące się pod czaszką lub te, które nakładają się na neuryty innych neuronów. Kliknij opcję Wyklucz zwrot z inwestycji, aby wykluczyć ten zwrot z inwestycji. Oblicz wartości delta F przez F, korzystając z tego równania.
Wybierz XLSX jako format eksportu danych i wykonaj eksport danych, aby wygenerować plik Excel wypełniony nieprzetworzonymi wartościami delta F przez F. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona dla wartości delta F przez F wśród ROI i skonstruuj macierz współczynników korelacji. Użyj oprogramowania Fiji, aby wyznaczyć granice lufy na podstawie obrazu TCA-RFP.
Następnie przypisz ROI do odpowiadających im beczek lub przegród. Porównaj współczynniki korelacji parami w identycznych beczkach i różnych beczkach. Wygeneruj od 1 000 do 10 000 zastępczych zestawów danych, losowo permutując związek między pozycjami ROI a śladami jonów wapnia.
W każdym zastępczym zbiorze danych oblicz indywidualnie średni współczynnik korelacji w beczkach i określ istotność statystyczną korelacji. Wyższe współczynniki korelacji parami zaobserwowano w obrębie tych samych jednostek przetwarzania sensorycznego niż w różnych jednostkach. Aktywności wykazały silniejszą synchronizację w obrębie tych samych jednostek, pomimo większych odległości, przewyższając korelację z fizycznie bliższymi neuronami z różnych jednostek.
Średnia współczynników korelacji w obrębie tych samych baryłek była znacznie wyższa niż obliczona na podstawie 10 000 zestawów danych zastępczych. Korelacja w obrębie tych samych baryłek była znacznie silna w trzech różnych oknach czasowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejsze badanie analizuje tworzenie się obwodów neuronalnych w rozwijającej się korze mózgu noworodków myszy, wykorzystując mikroskopię dwufotonową do wizualizacji aktywności pojedynczych neuronów. Celem badań jest wyjaśnienie, w jaki sposób wzorce aktywności neuronalnej przyczyniają się do formowania połączeń docelowych w korze mózgu.
Wysokorozdzielcze obrazowanie in vivo spontanicznej aktywności neuronalnej w korze sensorycznej noworodków myszy umożliwia uzyskanie bezprecedensowego wglądu w wczesne formowanie się obwodów i synchronizację specyficzną dla poszczególnych obszarów. Możliwość ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz zwiększa pewność prognostyczną na najwcześniejszych etapach walidacji celów w OUN. Integracja ilościowego mapowania aktywności pojedynczych neuronów dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dotyczących celów neurorozwojowych i modeli istotnych w kontekście chorobowym.
Ten schemat obrazowania i analizy łączy wczesne etapy odkryć, walidację celów oraz opracowywanie modeli przedklinicznych w badaniach nad OUN.