Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych
5 kwietnia 2024
Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.
Nasze laboratorium koncentruje się na badaniu interakcji gospodarz-patogen oraz dynamiki komórek odpornościowych, które zachodzą po zakażeniu. Mamy nadzieję, że dzięki zastosowaniu solidnego modelu hodowli komórkowej uda nam się dokładniej odzwierciedlić złożone interakcje zachodzące in vivo na poziomie tkanki. W części opublikowanej literatury opisującej międzypokoleniowość u bydła brakuje szczegółów niezbędnych do tego, aby protokół był łatwy do odtworzenia, co sprawia, że jego zastosowanie przez niedoświadczonych badaczy jest wyzwaniem.
Zaletą naszego modelu jest to, że zapewniamy niezwykle szczegółowy protokół, który może być z powodzeniem stosowany przez początkujących badaczy. Stworzenie monowarstwy Transwell umożliwia wspólną hodowlę z komórkami odpornościowymi, ujawniając wgląd w interakcję między tkanką a patogenem. przy jednoczesnym zachowaniu organizacji podobnej do in vivo.
Ten wszechstronny model jest cenny do badania wielu chorób bydła o złożoności wykraczającej poza modele jednokomórkowe. Nasze laboratorium wykorzysta ten model do zbadania czynników immunologicznych wpływających na podatność na zakażenie Cryptosporidium. Ułatwi to porównanie dorosłego bydła i cieląt, przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkanek i mikrośrodowiska komórek odpornościowych.
Wyniki tych prac mają bezpośredni potencjał translacyjny dla zdrowia ludzkiego. Na początek umieść wkładki do hodowli komórkowych w 24-dołkowym ostrzu adaptera do hodowli tkankowej. Wstępnie pokryj wierzchołkową stronę wkładek 100 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej lub BME w enteroidalnym pożywce wzrostowej.
Załaduj dodatkową wkładkę do użycia jako kontrola podczas pomiarów integralności bariery. Następnie inkubuj powlekaną wkładkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Po zakończeniu inkubacji odessać pożywkę do hodowli enteroidalnych 3D.
Zbierz enteroidy jelita krętego bydła w jednym mililitrze lodowatego podłoża do mycia. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć kopuły i zebrać je w 15-mililitrowej stożkowej tubie. Za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipet miareczkować 30 razy, aby wytworzyć fragmenty enteroidu.
Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dalej miareczkować około 40 razy, aby rozbić fragmenty enteroidu. Uzupełnić objętość probówki do 10 mililitrów lodowatym środkiem myjącym. Następnie odwirować probówkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Ostrożnie odessać supernatant, łącznie z warstwą BME. Następnie, dla każdych czterech kopuł, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego enzymu ekspresowego TrypLE. Przenieś mieszaninę na 24-dołkową płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 10 minut.
Delikatnie odpipetować mieszaninę jednomililitrową pipetą, aby dalej rozbić enteroidy. Następnie odpipetuj mieszaninę pipetą o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozbić fragmenty na pojedyncze komórki. Użyj trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w sterylną igłę o rozmiarze 22, aby zassać i dozować zawiesinę komórek cztery razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
Za pomocą mikroskopu monitoruj dysocjację komórek, aż 80% enteroidów zostanie rozbitych na pojedyncze komórki. Teraz zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj cztery objętości pożywki płuczącej FBS, aby wygasić reakcję.
Następnie przefiltruj enteroidy przez wstępnie powlekane sitko o średnicy 40 mikrometrów dwukrotnie do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę o masie 300 g przez pięć minut, aby wydzielić granulki komórek. Odessać supernatant z probówki wirówkowej z dysocjacją suspensendium komórek jelita krętego bydła.
Zawiesić osad w niewielkiej objętości pożywki wzrostowej organoidów. Następnie użyj metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru, aby określić żywotność komórek. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu powlekającego z wkładki do hodowli komórkowej.
Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki na wierzchołkowej powierzchni wstępnie powlekanej wkładki hodowlanej. Teraz dodaj 700 mikrolitrów kompletnej pożywki FBS do podstawowej bocznej strony wkładki. Przesuń płytkę około 10 razy w kształcie liczby osiem, aby równomiernie rozprowadzić komórki na wkładce.
Następnie umieść talerz na podgrzewaczu do talerzy w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po inkubacji zastąp pożywkę na składnikach wierzchołkowych i podstawowych świeżymi enteroidalnymi pożywkami wzrostowymi.
Następnego dnia usuń pożywkę z wierzchołkowych i podstawowych przedziałów bocznych. Ostrożnie umyć wkładkę PBS i zastąpić ją enteroidalnymi pożywkami różnicującymi, uzupełnionymi tylko inhibitorami. Formowanie się enterosfery zaobserwowano kilka godzin po posiewie z platerowanych krypt bydlęcych.
Po dwóch dniach, światło sfer było dobrze zdefiniowane, z pączkującymi strukturami zaobserwowanymi w dniu 4. Dojrzałe enteroidy obserwowano w dniu 7. Barwienie immunologiczne siedmiodniowych, 3D enteroidów wykazało obecność różnych linii komórkowych.
Białko E-kadheryny zlokalizowano na złączu adhezyjnym. Enteroidy były dodatnie dla komórek enteroendokrynnych i komórek paneth wytwarzających lizozym. Zlewające się monowarstwy 2D zaobserwowano w czasie krótszym niż jeden tydzień hodowli.
Aby rozpocząć, należy wyjąć z inkubatora płytkę hodowlaną Transwell zawierającą monowarstwę enteroidu 2D jelita krętego bydła. Pozostawić płytkę do zrównoważenia w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez kilka minut. Upewnij się, że elektrody STX2 zostały wstępnie kondycjonowane, a woltomierz skalibrowany na 1,000 omów, zgodnie z instrukcjami producenta.
Włóż dłuższy koniec sondy do podstawnego przedziału bocznego, a krótszy koniec do komory wierzchołkowej hodowli komórek nabłonkowych Transwell. Po ustabilizowaniu konfiguracji wykonaj trzy pomiary przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej na wkładkę Transwell, w tym wkładkę pozbawioną komórek. Oblicz średnią z pomiarów dla każdej odpowiedniej wkładki.
Odejmij średni pomiar studzienek ślepych od dołka doświadczalnego, a następnie pomnóż go przez powierzchnię wkładki, aby określić odporność bariery nabłonkowej. Zlewające się monowarstwy 2D zaobserwowano w czasie krótszym niż jeden tydzień hodowli. Pomiary TEER wykazały stały wzrost wartości w ciągu siedmiu dni, zanim spadły w dniu 12.
Mikroskopia konfokalna barwionej monowarstwy 2D wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, barwienia E-kadheryną i F-aktyną. Komórki wydają się być zróżnicowane z komórkami enteroendokrynnymi, komórkami Panetha i liniami komórek enterocytów. Stymulacja wierzchołkowa monowarstwy skutkowała zwiększoną produkcją cytokin.
Przegląd
To badanie przedstawia pierwotny system kultury komórek bydlęcych 2D pochodzących z enteroidów do badania fizjologii i patofizjologii tkanki przewodu pokarmowego. Model umożliwia współkulturę z odpowiednimi typami komórek tkankowych, poprawiając badania translacyjne w dziedzinie chorób przewodu pokarmowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Gastroenterologia
Tło
- Enteroidy to nowy model do badania interakcji tkankowych.
- W istniejącej literaturze brakuje protokołów powtarzalnych dla początkujących badaczy.
- Model ma na celu dokładniej odwzorować warunki in vivo.
- Model uwzględnia złożoność interakcji gospodarz-patogen u bydła.
Cel badania
- Opracowanie szczegółowego protokołu tworzenia solidnego modelu kultury komórkowej.
- Badanie czynników immunologicznych wpływających na podatność na zakażenie Cryptosporidium.
- Ułatwienie porównań między dorosłymi bydłami a cielętami.
Stosowane metody
- Tworzenie monowarstw Transwell do współkultury z komórkami odpornościowymi.
- Szczegółowy krok po kroku protokół dotyczący kultury enteroidów i ich dysocjacji.
- Pomiar transepithelialnej rezystancji elektrycznej (TEER).
- Immunostaining do identyfikacji różnych linii komórkowych w enteroidach.
Główne wyniki
- Dojrzałe enteroidy były obserwowane do dnia 7 z zdefiniowanymi strukturami.
- Pomiar TEER wskazywał na stabilną barierę nabłonkową.
- Immunostaining potwierdził obecność komórek enteroendokrynnych i Panetha.
- Konfluentne 2D monowarstwy zostały osiągnięte w mniej niż tydzień.
Wnioski
- Opracowany model jest cenny do badania złożonych chorób bydła.
- Daje wgląd w interakcje tkankowo-patogenowe.
- Wyniki mają potencjalne implikacje translacyjne dla zdrowia ludzkiego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing a bovine primary enteroid-derived 2D monolayer system addresses the need for physiologically relevant, reproducible in vitro models in early discovery and translational research. This platform enables direct access to the intestinal lumen and supports co-culture with immune cells, facilitating mechanistic de-risking and predictive confidence in host-pathogen and drug response studies. Its reproducibility and scalability position it as a reusable asset for portfolio-wide gastrointestinal research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions in a tissue-relevant context.
- Supports functional validation of immune and epithelial cell responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving in vivo-like architecture.
- Provides a platform for comparative studies across developmental stages or disease states.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible monolayers suitable for quantitative readouts.
- Allows for direct measurement of barrier integrity via TEER and cytokine secretion.
- Supports assay scalability and cross-laboratory reproducibility for compound evaluation.
- Enables co-culture with immune cells for multi-parametric screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery and preclinical validation by modeling complex tissue interactions.
- Reduces translational risk by mirroring in vivo immune and epithelial dynamics.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for gastrointestinal targets.
Pipeline & Workflow Integration
This 2D monolayer system integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, assay development, and translational studies in gastrointestinal biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of epithelial and immune cell interactions.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs such as TEER and cytokine profiles.
- Analytics: Enables direct comparison of barrier function and immune responses across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for diverse gastrointestinal research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gastrointestinal research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gastrointestinal programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and organoid culture techniques.
- Needs access to specialized instrumentation for TEER measurement and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other species or disease models with protocol optimization.
- Limitations include the need for careful handling to maintain monolayer integrity and differentiation.
