Name: Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę hodowli dwuwymiarowych monowarstw z enteroidów bydła do badań nad interakcjami patogen-gospodarz i odpowiedzią immunologiczną. Model umożliwia współhodowlę z komórkami odpornościowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy korzystanie z Cellular and Molecular Core Facility na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim. Badania te były wspierane przez program badawczy Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa (Zdrowie i Produkcja Zwierząt oraz Produkty Zwierzęce: Zdrowie i Choroby Zwierząt, 1025812). Ustalenia i wnioski zawarte w tej publikacji nie zostały formalnie rozpowszechnione przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące jakiekolwiek ustalenia lub politykę agencji.

Establishment of a 2D Monolayer from 3D Bovine Ileal Enteroid Culture

<ol><li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReza+Khorramizadeh%2C+M+%22Animal+Biotechnology%22">Animal Biotechnology</a>. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).</li>
<li>Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+use+of+animal+models+to+advance+scientific+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Innovative use of animal models to advance scientific research.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).</li>
<li>Hamernik, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farm+animals+are+important+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Farm animals are important biomedical models.</a> Animal Frontiers. 9 (3), (2019).</li>
<li>Ribitsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%3A+To+do+or+not+to+do%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972(2020).</li>
<li>Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+model+systems+and+tools+for+basic+and+translational+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology.</a> Genome Medicine. 10 (1), 73(2018).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Roth, J. A., Tuggle, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Livestock+models+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Livestock models in translational medicine.</a> ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+bovine+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the bovine immune response.</a> Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).</li>
<li>Potter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immune+system+of+the+gastrointestinal+tract%3A+maintaining+balance+between+the+good+and+the+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+Study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D-+and+3D-based+intestinal+stem+cell+cultures+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine.</a> Cells. 7 (12), 225(2018).</li>
<li>Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+-+New+models+for+host-helminth+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Organoids - New models for host-helminth interactions.</a> Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).</li>
<li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 43(2021).</li>
<li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54(2018).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+three-dimensional+%283D%29+expansion+of+bovine+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115(2021).</li>
<li>Töpfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+colon+organoids%3A+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical%2C+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42(2005).</li>
<li>Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-vitro+model+for+studying+the+interaction+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+other+enteropathogens+with+bovine+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment%3A+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).</li>
<li>Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cattle+breed+and+basal+diet+on+digestibility%2C+rumen+bacterial+communities%2C+and+eating+and+rumination+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity.</a> Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114(2020).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje fizjologicznie istotny model do badania fizjologii jelit i zaburzeń jelitowych. Kilka grup badawczych opisało wytwarzanie kultur enteroidów bydlęcych, w tym monowarstw 2D 16,19,20,21,22,23,24. Chociaż tworzenie monowarstw nie jest jawnym wyzwaniem technicznym, kilkuminutowe kroki mają kluczowe znaczenie dla konsekwentnego tworzenia udanych kultur. W związku z tym odtwarzalność monowarstw 2D przy użyciu pokrótce opisanych metod w opublikowanej literaturze może być wyzwaniem dla początkującego badacza w dziedzinie organoidów. Protokół opisany w niniejszym dokumencie został zaadaptowany z tych protokołów i tych opublikowanych dla innych gatunków, zapewniając przewodnik krok po kroku dotyczący generowania monowarstw na wkładkach transwell, który jest wysoce powtarzalny.
Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół może być łatwo modyfikowany w celu dopasowania do konkretnych celów projektu eksperymentalnego lub dostępności odczynników. Rzeczywiście, zgodnie z tym protokołem, udane hodowle można osiągnąć poprzez wysiewanie monowarstw o mniejszej gęstości komórek (np. 2,5 x 104) lub przy braku FBS, jak opisano w innych publikacjach24. Jednak zmiana tych parametrów może wymagać zwiększonej hodowli w celu wytworzenia zlewającej się monowarstwy. W związku z tym, jeśli inne czynniki integralnie związane z projektem badania, w tym współhodowla z komórkami odpornościowymi, dyktują określony przebieg czasowy eksperymentu, gęstość wysiewu można zmienić w razie potrzeby. Podczas gdy inne preparaty błon podstawnych można zastąpić w miejsce tego stosowanego w tym protokole do generowania enteroidów 3D i monowarstw 2D, będą one wymagały pewnej optymalizacji w celu określenia optymalnego stosunku błony podstawnej do podłoża.
Zastosowanie wkładek transwell w opisanej metodologii ma wiele zalet w porównaniu ze wzrostem jednowarstwowym na konwencjonalnych wyrobach z tworzyw sztucznych i hodowlach enteroidalnych 3D. W porównaniu ze standardowymi płytkami do hodowli tkankowych, stosowanie transwelli do hodowli jednowarstwowych sprzyja różnicowaniu i organizacji komórek w sposób, który zachowuje podobieństwo do krypt jelitowych14,25. Bariera nabłonkowa jelit jest niezbędna w zapobieganiu translokacji toksyn i mikroorganizmów do organizmu, jednocześnie ułatwiając wchłanianie składników odżywczych. W związku z tym bardzo ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób integralność bariery jelitowej funkcjonuje u osób zdrowych i ulega zmianie podczas zaburzeń jelitowych lub w odpowiedzi na związki. W przeciwieństwie do 3D hodowli enteroidalnych, obiektywna ocena integralności bariery jelitowej jest możliwa przy łączeniu monowarstw na transwellach i pomiarze TEER, jak wykazano w niniejszymdokumencie 14,25. Generowanie monowarstw 2D na transwellach pozwala również na podwójną hodowlę z odpowiednimi typami komórek, takimi jak komórki odpornościowe lub zrębowe. Pozwala to na scharakteryzowanie krytycznie ważnych przesłuchów między komórkami jelitowymi a komórkami mikrośrodowiska tkankowego, czego nie można osiągnąć za pomocą kultur 3D. Odsłonięcie wierzchołkowej powierzchni monowarstwy nie tylko pozwala na eksperymentalne narażenie na patogeny i związki oraz zbieranie produktów świetlnych, ale także umożliwia badania nad innymi aspektami fizjologii i chorób jelit, w tym badanie mikrobioty jelitowej i fizjologii wchłaniania molekularnego lub transportu13. Niezależna kontrola nad wierzchołkową i podstawną powierzchnią jelita jest wyraźną zaletą w porównaniu z modelami enteroidalnymi 3D.
Dzięki kilku eksperymentom próbnym zidentyfikowaliśmy kluczowe kroki, które przyczyniły się do sukcesu protokołu. Podczas gdy próbki całych tkanek jelitowych mogą być przechowywane w lodówce przez noc i przetwarzane następnego dnia, dysocjacja tkanek i izolacja etapów fragmentu krypty muszą być wykonane szybko, aby zapobiec rozpadowi wyizolowanych frakcji krypty. Po zakończeniu mycia PBS, odwirowanie krypt w Wash Media może pomóc w zapobieganiu rozpadowi krypt, jak opisano w kroku 2.3.10. Podczas pasowania enteroidów lub zbierania ich w celu utworzenia jednej warstwy, konieczne jest oddzielenie enteroidów od kopuł BME. Media płuczące muszą być lodowate, aby pomóc w rozpuszczeniu BME. W przeciwieństwie do tego, użycie wstępnie podgrzanego TrypLE i dwukrotne przefiltrowanie zawiesiny komórek może pomóc w utworzeniu pojedynczych komórek potrzebnych do wytwarzania monowarstw. Wreszcie, ręczne manewrowanie płytką w kształcie liczby 8 może pomóc w równomiernym rozproszeniu pojedynczych komórek po wkładzie transwell.
Istotnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że monowarstwy 2D zostały wyprodukowane z enteroidalnych stad uzyskanych od dojrzałego wołu rasy holsztyńskiej (>2 lat). Dojrzewający przewód pokarmowy u cieląt może wymagać niewielkich modyfikacji opisanego protokołu w celu uzyskania optymalnych wyników. Specyficzne dla danej rasy różnice w fizjologii jelit ras bydła opisano w piśmiennictwie26. Chociaż nie wiadomo, czy te różnice mogą wpływać na enteroidy i późniejsze wytwarzanie monowarstw, podejrzewamy, że wszelkie różnice skutkowałyby tylko niewielkimi zmianami w naszym protokole. Ponadto model kultury 2D ma pewne nieodłączne wady. W porównaniu z modelami enteroidalnymi 3D, hodowle 2D mogą nie mieć niektórych aspektów architektury tkanki jelitowej i różnorodności komórkowej, co stwarza ograniczenia i wyzwania związane z rozmnażaniem kultury 2D13. Mimo to badania pokazują, że niektóre monowarstwy mogą emulować oczekiwaną organizację krypty27, a niektóre z tych ograniczeń mogą być nawet przezwyciężone poprzez ustanowienie kultur 2D z interfejsem powietrze-ciecz. Niemniej jednak ograniczenia tego modelu powinny być w pełni rozważone w celu określenia, czy jego zastosowanie jest odpowiednie dla zadawanego pytania eksperymentalnego.
Protokół ten opisuje zoptymalizowany system hodowli, który modeluje przewód pokarmowy bydła przy użyciu enteroidów pochodzących z jelita krętego bydła w celu utworzenia monowarstw na wkładkach transwell. Dzięki szerokiemu wachlarzowi zastosowań, od badań nad chorobami zakaźnymi po odkrywanie leków i medycynę regeneracyjną, ten wysokowydajny system hodowli może doprowadzić do bezprecedensowego rozwoju strategii zapobiegawczych i terapeutycznych, które mogą być wzajemnie korzystne dla zdrowia zwierząt i ludzi.

Modele zwierzęce w badaniach odgrywają kluczową rolę w pogłębianiu naszego zrozumienia patofizjologii chorób i dynamiki odpowiedzi immunologicznej gospodarza podczas infekcji oraz wspierają rozwój nowych strategii prewencyjnych i terapeutycznych1,2,3,4. Modele te wspierają odkrywanie i postęp badań na zwierzętach i mają kluczowe znaczenie dla postępu w badaniach nad zdrowiem człowieka. Przez dziesięciolecia modele gryzoni stanowiły podstawę postępów w mechanizmach odpornościowych i podstawowych badaniach biologicznych nad chorobami człowieka3,5,6,7. Podczas gdy modele gryzoni mają kluczowe znaczenie w badaniach przesiewowych i wczesnych badaniach rozwojowych, duże modele zwierzęce oferują bardziej odpowiednie porównanie w badaniach nad chorobami ludzkimi zarówno we wczesnych odkryciach, jak i późniejszych badaniach rozwojowych, w tym w testach skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa1,3,4,5. Hodowla zwierząt gospodarskich oferuje wyraźne korzyści w porównaniu z modelami gryzoni, zapewniając bardziej wydajną translację do zastosowań u ludzi w przypadku niektórych chorób, w tym kryptosporydiozy, salmonellozy, gruźlicy, syncytialnego wirusa oddechowego i brucelozy1,7,8. Rzeczywiście, te i inne choroby rozwijają się spontanicznie u bydła, które ma kilka analogicznych patogenez choroby i procesów immunologicznych do ludzi, a jako populacja niekrewniacza, bydło naśladuje heterogeniczność genetyczną i środowiskową wpływającą na ludzką odpowiedź immunologiczną5,8,9,10. Korzyści płynące z modeli bydlęcych w badaniach nad chorobami zakaźnymi można zmaksymalizować, stosując najpierw zaawansowany system hodowli, a następnie wdrażając badania in vivo krok po kroku. Początkowe zastosowanie wysoce złożonego systemu hodowli bydła może znacznie zmniejszyć liczbę badań na żywych zwierzętach, jednocześnie zwiększając szanse na udane badania translacyjne i stosowane. Modele hodowlane powinny podsumowywać procesy chorobowe na poziomie narządów, aby zapewnić optymalną trafność predykcyjną, zachowując natywne mikrośrodowisko tkankowe przestrzennie i funkcjonalnie.
Odpowiedź immunologiczna błony śluzowej to wielopłaszczyznowy system składający się z wysoce wydajnej bariery utworzonej przez enterocyty przewodu pokarmowego i różne populacje komórek odpornościowych zlokalizowanych poniżej powierzchni błony śluzowej11. Ten wysoce złożony system ma kluczowe znaczenie podczas infekcji w utrzymaniu homeostazy przewodu pokarmowego i inicjowaniu obrony immunologicznej przed patogenami jelitowymi11. Komunikacja między enterocytami a leżącymi pod nimi wrodzonymi komórkami odpornościowymi inicjuje rozwój ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko mikroorganizmom chorobotwórczym. W związku z tym systemy hodowli, które są porównywalne pod względem poziomu złożoności, są niezbędne do optymalnego badania interakcji patogenów gospodarz-jelito i są wysoce skuteczne w zrozumieniu fizjologii jelit oraz odkrywania i opracowywania leków12,13. Organoidy to solidny system hodowlany, który przypomina architekturą i funkcję tkanki pochodzenia14,15. Wielokomórkowość tych modeli pozwala na badanie roli różnych populacji komórek i interakcji komórkowych związanych ze zdrowiem i chorobą jelit12,14. Jednak modele organoidów pochodzenia ludzkiego w badaniach są obecnie ograniczone ze względu na trudności w uzyskaniu wystarczającej ilości i stałej jakości ludzkich komórek nabłonka jelitowego oraz ograniczoną żywotność komórek w hodowli. Unieśmiertelnione linie komórkowe mogą być wykorzystywane do konsekwentnego uzyskiwania wysokich plonów homologicznych kultur w tych modelach; Jednak transformowane komórki z natury nie mają różnorodności i złożoności funkcjonalnej nieprzekształconych komórek nabłonkowych16,17. Zalety stosowania kultur pochodzących z tkanki bydlęcej jako modelu do badania chorób i fizjologii przewodu pokarmowego obejmują łatwość, z jaką próbki tkanek mogą być konsekwentnie uzyskiwane od zdrowych dawców, lepszą żywotność komórek i większą różnorodność komórkową, którą można osiągnąć tylko w przypadku tkanki nieunieśmiertelnionej. Porównawcza transkryptomika tkanek i charakterystyka organoidów jelitowych ujawniają podobieństwa w zachowanych genach ortologicznych i potencjałach komórkowych między ludźmi a bydłem18. W związku z tym system hodowli organoidów bydlęcych może być korzystny w badaniu chorób jelit u ludzi, a wyniki można łatwo przełożyć na medycynę ludzką. 
Protokół opisany tutaj szczegółowo opisuje skuteczną platformę do oceny odpowiedzi gospodarza na patogeny jelitowe lub związki oraz fizjologii jelit przy użyciu systemu hodowli komórek pierwotnych 2D pochodzących z enteroidów bydlęcych. W przeciwieństwie do organoidów 3D, systemy hodowli 2D generowane na wkładkach transwell pozwalają na podwójną hodowlę komórek jelitowych z komórkami odpornościowymi lub zrębowymi, umożliwiając badanie dynamiki na poziomie tkankowym. Dzięki zastosowaniom w badaniach biomedycznych, rozwoju farmaceutycznym i testowaniu skuteczności, ten fizjologicznie istotny model może przynieść korzyści zdrowotne i rozwojowe zarówno bydła, jak i ludzi.

<table><tbody><tr><td>Końcówka do pipety 0,2 ml&nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-S</td><td></td></tr><tr><td>1 i mikro; m Wkładki do hodowli komórkowych PET 24-dołkowe&nbsp;</td><td>Końcówka</td><td></td> do pipety Corning 353104 <td></td></tr><tr><td>1000 ml&nbsp;</td><td>Igła MidSci</td><td>PR-1250RK-S</td><td></td></tr><tr><td>22 G</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie hodowlane&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtr siatkowy M&nbsp;</td>Probówka wirówkowa <td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 ml&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety 5 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>30075307</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309647</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>Antycytokeratyna -18 (C-04)</td><td>Abcam</td><td>AB668-1001</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement bez witaminy A&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12-587-010</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Belysa</td><td>Luminex</td><td>40-122</td><td>Oprogramowanie do dopasowywania krzywej immunologicznej&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Odczynniki Fishera</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Octan kaspofunginy</td><td>Selleckchem</td><td>S3073</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranina-A (E-5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271738</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher scientific</td><td>12-540-C</td><td></td></tr><tr><td>Kriowiale</td><td>Neptun scientific</td><td>3471.X</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Ultimatrix RGF BME&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>BME001-05</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT) roztwór</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12 1.1 medium (z L-glutaminą, bez HEPES)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.01</td><td></td></tr><tr><td>E-kadheryna&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35070CV</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko mikroskopowe&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-07</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa Fluor 555&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult organoid Podłoże różnicujące (Human)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0214</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu organoidów IntestiCult (Human)</td><td>StemCell Technologies</td><td>0-6010</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700&nbsp;</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299 (Galunisertib)</td><td>System MAGPIX Selleckchem</td><td>S2230</td><td></td></tr><tr><td>System Luminex</td><td>Magpix</td><td>Kompaktowy multipleksator</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX Panel magnetyczny z cytokiną bydlęcą/chemokiną</td><td>MilliporeSigma</td><td>BCYT1-33K</td><td>Multipleksowy test multipleksowy na bazie koralików&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontener Mr. Mroźny&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2103</td><td></td></tr><tr><td>NutriFreeze D10 Pożywka do kriokonserwacji&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-713-1B</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalna platforma wibrująca</td><td>Thermo Fisher</td><td>88880021</td><td></td></tr><tr><td>Pam3Csk4</td><td>invivogen</td><td>tlrl-pms Folia</td><td></td></tr><tr><td>uszczelniająca Parafilm</td><td>dot scientific inc.</td><td></td><td></td>#HS234526C</tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna-FITC&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>5782/12U</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass Anti-fade</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki lizozym (EC3.2.1.17)</td><td>Agilent technologies</td><td>A009902-2</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (FHPI)</td><td>Selleckchem</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem</td><td>Thermo Fisher</td><td>MaxQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>VWR</td><td>BDH7465-2</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Teknova</td><td>S6525</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Trypan Blue&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy TrypLE&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr><tr><td>Woltoomomierz&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Millicell ERS-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Systemy hodowli komórek organoidowych mogą podsumować złożoność obserwowaną w tkankach, co czyni je użytecznymi w badaniu interakcji gospodarz-patogen, ocenie skuteczności i toksyczności leków oraz bioinżynierii tkankowej. Jednak zastosowanie tych modeli z opisanych powodów może być ograniczone ze względu na trójwymiarowy (3D) charakter tych modeli. Na przykład wykorzystanie systemów hodowli enteroidów 3D do badania chorób układu pokarmowego jest trudne ze względu na niedostępność światła jelita i wydzielanych przez niego substancji. Rzeczywiście, stymulacja organoidów 3D patogenami wymaga albo mikroiniekcji światła, mechanicznego rozerwania struktury 3D, albo wytworzenia enteroidów wierzchołkowych. Co więcej, organoidy te nie mogą być hodowane wspólnie z komórkami odpornościowymi i zrębowymi, co ogranicza dogłębną analizę mechanistyczną dynamiki patofizjologicznej. Aby obejść ten problem, zoptymalizowaliśmy dwuwymiarowy (2D) system hodowli monowarstwowej pochodzącej z enteroidów bydła z komórek pierwotnych, umożliwiając jednoczesną hodowlę z innymi istotnymi typami komórek. Krypty jelita krętego wyizolowane od zdrowego dorosłego bydła zostały wyhodowane w celu wygenerowania organoidów 3D, które zostały poddane krioprezerwacji do wykorzystania w przyszłości. Stworzono monowarstwę 2D przy użyciu ożywionych enteroidów 3D, które zostały pasażowane i rozerwane w celu uzyskania pojedynczych komórek, które zostały wysiane na wkładkach hodowli komórek transwell pokrytych ekstraktem z błony podstawnej, odsłaniając w ten sposób ich powierzchnię wierzchołkową. Polarność monowarstwy jelitowej, różnicowanie komórkowe i funkcję bariery scharakteryzowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego. Stymulacja powierzchni wierzchołkowej monowarstwy ujawniła oczekiwaną funkcjonalność monowarstwy, czego dowodem jest wydzielanie cytokin zarówno z przedziału wierzchołkowego, jak i podstawnego. Opisany model jednowarstwowy 2D pochodzący z enteroidów jest bardzo obiecujący w badaniu interakcji gospodarz-patogen i fizjologii jelit, opracowywaniu leków i medycynie regeneracyjnej.

Pierwszym krokiem w generowaniu 2D monowarstw pochodzących z enteroidów jest przygotowanie pobranego fragmentu tkanki jelitowej (Rysunek 1A) do dysocjacji tkanki. Odbywa się to poprzez usunięcie przylegającego tłuszczu i krezki z tkanki (Rysunek 1B>), a następnie rozcięcie tkanki wzdłużnie w celu odsłonięcia powierzchni światła, aby warstwa śluzu jelita mogła zostać usunięta poprzez delikatne zeskrobanie za pomocą szkiełka przedmiotowego. Pobrany fragment jelita jest następnie cięty na progresywnie mniejsze fragmenty tkanki (Rysunek 1C), aby ułatwić dysocjację. Krypty są następnie oddzielane od leżącej pod nimi tkanki podśluzowej za pomocą serii przemyć buforami chelatującymi (Rysunek 1D,E) oraz PBS. Izolowane krypty jelitowe (Rysunek 1F) są następnie osadzane w kopułkach macierzy błony podstawnej (Rysunek 2A) i hodowane przez kilka dni w celu wygenerowania 3D enteroidów. Z 10-calowego fragmentu jelita cienkiego bydlęcego można wyizolować około 900 000 krypt i wykorzystać je do tworzenia enteroidów. Już po kilku godzinach hodowli wysiane krypty zaczynają się wydłużać i przekształcać w enterosfery (Rysunek 2B). Po 2 dniach można zaobserwować wyraźnie zdefiniowane światło (Rysunek 2C), a struktury pączkujące pojawiają się już w 4. dniu hodowli (Rysunek 2D). Do 7. dnia rozwijają się dojrzałe enteroidy (Rysunek 2E). Barwienie immunofluorescencyjne 7-dniowych 3D enteroidów wykazuje obecność różnych linii komórkowych. Mikroskopia konfokalna enteroidów przedstawiona na Rysunku 3 wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, białka E-kadheryny w złączach przylegających, barwienie Chromograniną A (Chr-A) wskazujące na obecność komórek enteroendokrynnych, Lizozymem (LYZ) wykazującym komórki Panetha oraz Cytokeratyną-18 (CK-18) reprezentującą enterocyty. Po 7-10 dniach hodowli enteroidy powinny zostać pasażowane, aby umożliwić ich dalszą ekspansję i zapobiec przeludnieniu. Ustalono, że optymalny czas pasażowania enteroidów to 7-10 dni po pierwotnej izolacji krypt, co w ostateczności zależy od stanu zdrowia i tempa wzrostu enteroidów w hodowli. Optymalna gęstość wysiewu w celu uzyskania pożądanej morfologii i żywotności enteroidów, jak pokazano na Rysunku 2E, wynosi 400 krypt na kopułkę. Enteroidy można łatwo krio konserwować, a rozmrożone fragmenty enteroidów w pełni regenerują się do użytku eksperymentalnego po dwóch pasażach po rozmrożeniu. Warto zaznaczyć, że przed krio konserwacją zaleca się przeprowadzenie co najmniej dwóch pasaży pierwotnej hodowli krypt.
Aby wytworzyć 2D monolayer pochodzący z enteroidów, 3D enteroidy są zbierane, a następnie w serii etapów mechanicznie homogenizowane w obecności roztworu dysocjującego (Ryc. 4A) do postaci pojedynczych komórek. Pojedyncze komórki można następnie wysiać na wkład transwell, który został uprzednio pokryty roztworem pożywki hodowlanej z macierzą błony podstawnej. Średnio z czterech kopułek z 3D enteroidami można wysiać cztery transwelle. Liczba przetwarzanych 3D enteroidów zależy zatem od liczby transwelli potrzebnych do eksperymentu. Wysianie pojedynczych komórek z gęstością 1 x 105 i początkowa hodowla w obecności 20% FBS (Ryc. 4B-D>) pozwala uzyskać konfluentny monolayer w czasie krótszym niż 1 tydzień. Postępującą konfluencję 2D monolayera w hodowli można monitorować w czasie za pomocą mikroskopii świetlnej (Ryc. 4E,F). Pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) mogą potwierdzić konfluencję oraz scharakteryzować integralność bariery nabłonkowej w czasie i w odpowiedzi na stymulację eksperymentalną (Ryc. 5A). Średnio po siedmiu dniach hodowli monolayer o konfluencji bliskiej 100% będzie miał odpowiadającą mu wartość TEER na poziomie ~1500 Ω·cm2. Podłużna ocena wartości TEER 2D monolayera z enteroidów wykazuje stały wzrost wartości TEER przez siedem dni, osiągając maksymalną średnią wartość 1546 Ω·cm2, po czym następuje spadek do najniższej wartości 11,5 Ω·cm2 uzyskanej w dwunastym dniu (Ryc. 5B). Barwienie immunofluorescencyjne zróżnicowanych monolayerów wskazuje, że zgodnie z tym protokołem tworzą się nienaruszone, zorganizowane, spolaryzowane płaty nabłonka jelitowego (Ryc. 6). Mikroskopia konfokalna zabarwionego 2D monolayera wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, E-kadheryny oraz barwienia F-aktyny (Ryc. 6A-D). Mikroskopia fluorescencyjna 2D monolayera wykazuje cechy zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego, gdzie barwienie na Chromograninę-A (Chr-A) wykazuje obecność komórek enteroendokrynnych, lizozym (LYZ) wskazuje na komórki Panetha, a cytokeratyna-18 (CK-18) wskazuje na linie komórkowe enterocytów (Ryc. 6E-L). Modelowanie Z-stack pokazuje oczekiwaną polaryzację hodowli 2D monolayera z charakterystycznym osadzaniem F-aktyny, która znajduje się w mikrokosmkach pokrywających aspekt apikalny zróżnicowanych enterocytów, oraz E-kadheryny, białka zlokalizowanego w złączach przylegających rozmieszczonych między komórkami nabłonka (Ryc. 6M).
Funkcjonalność monowarstwy można ocenić poprzez stymulację apikalną różnymi komponentami, w tym ligandami receptorów Toll-podobnych (TLR) lub patogenami, a następnie poprzez ilościowe oznaczenie cytokin w nadsączach kultur komórkowych pobranych z przedziałów apikalnego i bazalnego. Rzeczywiście, gdy apikalna strona monowarstwy jest stymulowana przez 24 h agonistą TLR 1/2 Pam3csk4 w 4. dniu hodowli, obserwuje się zwiększoną produkcję cytokin w obu przedziałach w porównaniu z monowarstwami niepoddanymi działaniu preparatu (Rysunek 7A,B).
<img alt="Schemat przetwarzania tkanki i dysocjacji krypt: jelito kręte bydlęce, tkanka odtłuszczona, uzyskane fragmenty krypt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Izolacja krypt jelitowych bydła od zdrowych dorosłych osobników. Obrazy ilustrujące przetwarzanie tkanki: (A) całego jelita krętego dorosłego bydła, (B) odtłuszczonego jelita krętego, (C) jelita krętego pociętego na kawałki o długości 2,5 cala (6,3 cm) w PBS na lodzie, (D) sekcji tkanki jelita krętego w buforze dysocjującym nr 1 w temperaturze 4 °C, (E) w buforze dysocjującym 2 w wstrząsowej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C oraz (F) wyizolowanych fragmentów krypt jelita krętego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozwój organoidów 3D w ciągu 7 dni, obrazy mikroskopowe, wysiew enteroidów w kopułkach, wzrost komórkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Rozwój pierwotnych enteroidów jelita krętego bydła 3D w matrycy błony podstawnej. Reprezentatywne obrazy (A) kopułek enteroidów 3D utworzonych w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej oraz (B-E) rozwoju enteroidów 3D w dniach 0, 2, 4 i 7 hodowli. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencyjne barwienie trójwymiarowych enteroidów jelitowych, schemat jądra, F-aktyny, CK-18, E-cad, nałożenie obrazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Trójwymiarowe enteroidy jelitowe wykazują barwienie linii komórek nabłonkowych. Reprezentatywne obrazy 3D enteroidów po 7 dniach hodowli wykazują obecność barwienia jąder, F-aktyny, cytokeratyny-18 (CK-18), chromograniny-A (Chr-A), ekadheryny (E-cad), lizozymu (Lyz) oraz nałożenie obrazów (Merge). Pasek skali 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tworzenie monowarstwy 2D, obrazy mikroskopowe; progresja gęstości komórek, analiza wyników eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Utworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy pochodzącej z enteroidów jelita krętego z enteroidów jelita krętego. Reprezentatywne obrazy (A) fragmentów 3D enteroidów w roztworze dysocjującym w przygotowaniu do wysiewu monowarstwy, pojedynczych komórek wysianych na wkładce transwell z gęstością wysiewu 1 x 105 obrazowanych w dniu 0 za pomocą mikroskopii (B) świetlnej, (C) kontrastowej (fazowej) oraz (D) w jasnym polu, a także rozwój monowarstwy na wkładkach transwell obrazowanych w dniu piątym za pomocą mikroskopii (E) kontrastowej (fazowej) i (F) w jasnym polu. Powiększenie 40x, pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat pomiaru TEER kultur monowarstw 2D enteroidów; wykres przedstawia TEER w ciągu 12 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) monowarstwy pochodzącej z enteroidów 2D na wkładkach transwell. (A) Schemat przedstawiający sposób uzyskiwania pomiarów TEER monowarstwy 2D komórek nabłonka jelitowego (IEC) przy użyciu elektrod typu chopstick STX2 woltomierza, (B) Monitorowanie podłużne pomiarów TEER monowarstwy 2D w ciągu 12 dni hodowli komórkowej. Każdy punkt danych reprezentuje średnią wartość TEER oraz błąd standardowy średniej (SEM) uzyskany z dwóch powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Markery monolayery 2D IEC; E-kadheryna, F-aktyna, Lyz; mikroskopia fluorescencyjna; różnicowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6:Zróżnicowane monolayery 2D pochodzące z enteroidów na wkładkach transwell przekształcają się w spolaryzowane arkusze nabłonka jelitowego. (A-M) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne monolayery 2D pochodzącej z enteroidów na wkładce transwell po 5 dniach hodowli, pokazujące (A) jądro (niebieski), (B) E-kadherynę (czerwony), (C) F-aktynę (zielony) oraz (D) nałożenie 3 obrazów (merge), (E,I) barwienie jąder, (F) chromograninę-A, (J) cytokeratynę-18, (G,K) lizozym oraz (H,L) nałożenie obrazów. (M) Modelowanie Z-stack pokazujące rozkład tych samych białek markerowych komórek nabłonka w arkuszu monolayery 2D. Obrazy uzyskano z 2 powtórzeń biologicznych. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Poziomy IL-1α i IL-8; wykres słupkowy; strony apikalna i bazalna; porównanie grupy nieleczonej i leczonej Pam3csk4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Bydlęce pierwotne monowarstwy pochodzące z enteroidów 2D na wkładkach transwell są funkcjonalnie aktywne. Sekrecja cytokin do znadkomórkowego i podkomórkowego supernatantu hodowli (A) IL-1α oraz (B) IL-8 przez monowarstwy 2D na wkładkach transwell po 5 dniach hodowli, w grupie nieleczonej lub stymulowanej Pam3csk4 przez 24 h. Dane są reprezentatywne dla średnich poziomów cytokin i SEM z monowarstw pochodzących z zamrożonych zapasów krypt od jednego zwierzęcia i trzech niezależnych eksperymentów. Ilość cytokin oznaczono za pomocą analizy multipleksowej opartej na koralikach (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, a analizy przeprowadzono przy użyciu kompaktowej jednostki multipleksowej (Tabela materiałów) oraz oprogramowania do dopasowania krzywej immunoanalizy (Tabela materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Stężenia początkowe i końcowe odczynników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę.</a>

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Nasze laboratorium koncentruje się na badaniu interakcji gospodarz-patogen oraz dynamiki komórek odpornościowych, które zachodzą po zakażeniu. Mamy nadzieję, że dzięki zastosowaniu solidnego modelu hodowli komórkowej uda nam się dokładniej odzwierciedlić złożone interakcje zachodzące in vivo na poziomie tkanki. W części opublikowanej literatury opisującej międzypokoleniowość u bydła brakuje szczegółów niezbędnych do tego, aby protokół był łatwy do odtworzenia, co sprawia, że jego zastosowanie przez niedoświadczonych badaczy jest wyzwaniem.Zaletą naszego modelu jest to, że zapewniamy niezwykle szczegółowy protokół, który może być z powodzeniem stosowany przez początkujących badaczy. Stworzenie monowarstwy Transwell umożliwia wspólną hodowlę z komórkami odpornościowymi, ujawniając wgląd w interakcję między tkanką a patogenem. przy jednoczesnym zachowaniu organizacji podobnej do in vivo.Ten wszechstronny model jest cenny do badania wielu chorób bydła o złożoności wykraczającej poza modele jednokomórkowe. Nasze laboratorium wykorzysta ten model do zbadania czynników immunologicznych wpływających na podatność na zakażenie Cryptosporidium. Ułatwi to porównanie dorosłego bydła i cieląt, przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkanek i mikrośrodowiska komórek odpornościowych.Wyniki tych prac mają bezpośredni potencjał translacyjny dla zdrowia ludzkiego. Na początek umieść wkładki do hodowli komórkowych w 24-dołkowym ostrzu adaptera do hodowli tkankowej. Wstępnie pokryj wierzchołkową stronę wkładek 100 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej lub BME w enteroidalnym pożywce wzrostowej.Załaduj dodatkową wkładkę do użycia jako kontrola podczas pomiarów integralności bariery. Następnie inkubuj powlekaną wkładkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Po zakończeniu inkubacji odessać pożywkę do hodowli enteroidalnych 3D.Zbierz enteroidy jelita krętego bydła w jednym mililitrze lodowatego podłoża do mycia. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć kopuły i zebrać je w 15-mililitrowej stożkowej tubie. Za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipet miareczkować 30 razy, aby wytworzyć fragmenty enteroidu.Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby dalej miareczkować około 40 razy, aby rozbić fragmenty enteroidu. Uzupełnić objętość probówki do 10 mililitrów lodowatym środkiem myjącym. Następnie odwirować probówkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odessać supernatant, łącznie z warstwą BME. Następnie, dla każdych czterech kopuł, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego enzymu ekspresowego TrypLE. Przenieś mieszaninę na 24-dołkową płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 10 minut.Delikatnie odpipetować mieszaninę jednomililitrową pipetą, aby dalej rozbić enteroidy. Następnie odpipetuj mieszaninę pipetą o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozbić fragmenty na pojedyncze komórki. Użyj trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w sterylną igłę o rozmiarze 22, aby zassać i dozować zawiesinę komórek cztery razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.Za pomocą mikroskopu monitoruj dysocjację komórek, aż 80% enteroidów zostanie rozbitych na pojedyncze komórki. Teraz zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj cztery objętości pożywki płuczącej FBS, aby wygasić reakcję.Następnie przefiltruj enteroidy przez wstępnie powlekane sitko o średnicy 40 mikrometrów dwukrotnie do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę o masie 300 g przez pięć minut, aby wydzielić granulki komórek. Odessać supernatant z probówki wirówkowej z dysocjacją suspensendium komórek jelita krętego bydła.Zawiesić osad w niewielkiej objętości pożywki wzrostowej organoidów. Następnie użyj metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru, aby określić żywotność komórek. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu powlekającego z wkładki do hodowli komórkowej.Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki na wierzchołkowej powierzchni wstępnie powlekanej wkładki hodowlanej. Teraz dodaj 700 mikrolitrów kompletnej pożywki FBS do podstawowej bocznej strony wkładki. Przesuń płytkę około 10 razy w kształcie liczby osiem, aby równomiernie rozprowadzić komórki na wkładce.Następnie umieść talerz na podgrzewaczu do talerzy w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po inkubacji zastąp pożywkę na składnikach wierzchołkowych i podstawowych świeżymi enteroidalnymi pożywkami wzrostowymi.Następnego dnia usuń pożywkę z wierzchołkowych i podstawowych przedziałów bocznych. Ostrożnie umyć wkładkę PBS i zastąpić ją enteroidalnymi pożywkami różnicującymi, uzupełnionymi tylko inhibitorami. Formowanie się enterosfery zaobserwowano kilka godzin po posiewie z platerowanych krypt bydlęcych.Po dwóch dniach, światło sfer było dobrze zdefiniowane, z pączkującymi strukturami zaobserwowanymi w dniu 4. Dojrzałe enteroidy obserwowano w dniu 7. Barwienie immunologiczne siedmiodniowych, 3D enteroidów wykazało obecność różnych linii komórkowych.Białko E-kadheryny zlokalizowano na złączu adhezyjnym. Enteroidy były dodatnie dla komórek enteroendokrynnych i komórek paneth wytwarzających lizozym. Zlewające się monowarstwy 2D zaobserwowano w czasie krótszym niż jeden tydzień hodowli.Aby rozpocząć, należy wyjąć z inkubatora płytkę hodowlaną Transwell zawierającą monowarstwę enteroidu 2D jelita krętego bydła. Pozostawić płytkę do zrównoważenia w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez kilka minut. Upewnij się, że elektrody STX2 zostały wstępnie kondycjonowane, a woltomierz skalibrowany na 1,000 omów, zgodnie z instrukcjami producenta.Włóż dłuższy koniec sondy do podstawnego przedziału bocznego, a krótszy koniec do komory wierzchołkowej hodowli komórek nabłonkowych Transwell. Po ustabilizowaniu konfiguracji wykonaj trzy pomiary przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej na wkładkę Transwell, w tym wkładkę pozbawioną komórek. Oblicz średnią z pomiarów dla każdej odpowiedniej wkładki.Odejmij średni pomiar studzienek ślepych od dołka doświadczalnego, a następnie pomnóż go przez powierzchnię wkładki, aby określić odporność bariery nabłonkowej. Zlewające się monowarstwy 2D zaobserwowano w czasie krótszym niż jeden tydzień hodowli. Pomiary TEER wykazały stały wzrost wartości w ciągu siedmiu dni, zanim spadły w dniu 12.Mikroskopia konfokalna barwionej monowarstwy 2D wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, barwienia E-kadheryną i F-aktyną. Komórki wydają się być zróżnicowane z komórkami enteroendokrynnymi, komórkami Panetha i liniami komórek enterocytów. Stymulacja wierzchołkowa monowarstwy skutkowała zwiększoną produkcją cytokin.

generation-bovine-primary-enteroid-derived-two-dimensional-monolayer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.

In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa

Tutaj opisujemy protokół tworzenia i hodowli trójwymiarowych (3D) organoidów żołądkowych pochodzących od ludzi i myszy oraz metodę transferu organoidów 3D do jednowarstwowej 2-wymiarowej. Opisano również zastosowanie monowarstwy nabłonka żołądka jako nowatorskiego testu na ranę drapaną do badań nad regeneracją.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Poznaj metodę hodowli dwuwymiarowych monowarstw z enteroidów bydła do badań nad interakcjami patogen-gospodarz i odpowiedzią immunologiczną. Model umożliwia współhodowlę z komórkami odpornościowymi.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Przeglądaj więcej filmów