Name: Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Dowiedz się o przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej z użyciem kurkuminoidów w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. Ta metoda oferuje obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych leczeń przeciwgrzybiczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od FAPESP (São Paulo Research Foundation, numer procesu FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) i 2008/00601-6. Dziękujemy również dr Anie Pauli Silvie za udzielenie informacji na temat soli rozpuszczalnej w wodzie na bazie CUR.

Protokół badawczy dotyczący wykorzystania myszy został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt (numery spraw 05/2008 i 09/2020) w School of Dentistry, Araraquara, UNESP. Jako szczep referencyjny użyto C. albicans (ATCC 90028). Do niniejszego badania wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szwajcarskich (n = 45) o masie ciała w zakresie 20-30 g. Zwierzęta zostały dostarczone przez Uniwersytet Stanowy São Paulo, UNESP, Botucatu.
1. Przygotowanie PS i wybór źródła światła dla aPDT
<ol>
	<li>Przygotować PS zgodnie ze specyfikacją substancji, która ma być badana. 
	UWAGA: W tym badaniu jako PS użyto rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów (mieszanina soli rozpuszczalnych w wodzie na bazie CUR12) (patrz Tabela materiałów i <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Rozcieńczenia w temperaturze 20 μM, 40 μM i 80 μM (odpowiednio 15,6, 29,2 i 58,4 mg/l) przygotowywano w ultraczystej wodzie bezpośrednio przed użyciem i utrzymywano w temperaturze 5 °C.</li>
	<li>Należy wybrać sprzęt świetlny o odpowiedniej długości fali (takiej samej jak długość fali absorpcji PS), który jest w stanie oświetlić cały fotouczulny cel równomiernie i jednocześnie bez podgrzewania tkanki. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto rękojeści zawierającej diodę elektroluminescencyjną (LED, patrz tabela materiałów), która została zaprojektowana w Instituto de Física de São Carlos (Uniwersytet w São Paulo, São Carlos, SP, Brazylia). Moc wyjściowa dostarczana przez światło wynosiła 89,2 mW/cm2 przy niebieskiej długości fali około 455 nm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum C. albicans
<ol>
	<li>Szczep referencyjny C. albicans (ATCC 90028) należy przechowywać w drożdżowo-peptonowo-glukozowym (YEPD, patrz Tabela Materiałów) z 50% glicerolem w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożony szczep w temperaturze pokojowej, rozprowadzić 100 μl podwielokrotności na szalce Petriego z agarem z dekstrozy Sabouraud (SDA) z chloramfenikolem (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Przenieść pięć kolonii do 10 ml bulionu azotowego z drożdży z 2% glukozą (YNBg) i rosnąć tlenowo w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę drożdży w świeżym YNBg (1:10) i inkubować w stanie tlenowym w temperaturze 37 °C do momentu, gdy gęstość optyczna osiągnie środkową logarytmiczną fazę wzrostu. 
	UWAGA: Wcześniej ustandaryzuj krzywą wzrostu drobnoustrojów dla każdego laboratorium. W obecnych badaniach kulturom pozostawiono inkubację przez około 8 godzin, aż osiągnęły środkową fazę wzrostu, na co wskazuje gęstość optyczna przy 540 nm (OD540), ze średnią wartością 0,536 ± 0,062 dowolnej jednostki (średnia ± odchylenie standardowe [SD]).</li>
	<li>Odwirować kulturę przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie tą samą objętością sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).</li>
	<li>Użyć 100 μl podwielokrotności do wykonania czterech seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń w PBS, rozprowadzić rozcieńczenia na płytkach SDA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w celu zliczenia kolonii. Standardowo stosuje się zawiesiny grzybów w stężeniach około 4,5 × 107 jednostek tworzących kolonie na mililitr (jtk/ml)].</li>
</ol>

3. Indukcja OC u myszy
UWAGA: Poniższa metodologia została wcześniej opisana przez Takakura et al.13 i powielona przez naszą grupę10,14, z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Losowo rozmieść myszy w dziewięciu grupach (n = 5), odpowiadających tej samej liczbie zabiegów (plik uzupełniający 1). 
	UWAGA: Jama ustna myszy powinna być ujemna dla wzrostu Candida. Należy to sprawdzić, pobierając wymaz z jamy ustnej i posiewając próbkę na SDA.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w pudełkach z propylenem10 (maks. 5 myszy w pudełku), z wiórami drzewnymi na wykładzinę podłogową, w wiwarium o kontrolowanej temperaturze 23 ± 2 °C w cyklu 12/12 godzin światło/ciemność. Nie ma potrzeby dostarczania specjalnego wzbogacenia.</li>
	<li>Utrzymuj myszy na diecie ekstrudowanych myszy i filtrowanej wodzie ad libitum.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć lek immunosupresyjny, prednizolon (100 mg/kg masy ciała, patrz Tabela Materiałów), po raz pierwszy w pierwszym dniu wszystkim członkom grup C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ i C-L- (Plik uzupełniający 1). 
	UWAGA: Trzymaj myszy z tej samej grupy w tym samym pudełku i monitoruj je codziennie pod kątem wszelkich oznak stresu i utraty wagi. Zasięgnij porady weterynarza w sprawie leków przeciwbólowych lub zmienionej żywności/wody, jeśli zauważysz stres lub utratę wagi.</li>
	<li>Począwszy od pierwszego dnia i do końca eksperymentu, podawaj chlorowodorek tetracykliny w wodzie pitnej w ilości 0,83 mg/ml13.</li>
	<li>Zaszczepić języki myszy drugiego dnia, w tym grupy C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ i C-L- (Plik uzupełniający 1), inokulum C. albicans. Nie należy szczepić myszy z ujemnej grupy kontrolnej (NCtrl).
	<ol>
		<li>Uspokoić zwierzęta poprzez wstrzyknięcie domięśniowe 10 mg/kg chlorku chloropromazyny (patrz tabela materiałów) w każdy mięsień uda przed przeprowadzeniem szczepienia.</li>
		<li>Przeprowadzić inokulację wewnątrzustną myszy, mocząc sterylny wacik (po jednym na zwierzę) w świeżo przygotowanej (tj. przygotowanej bezpośrednio przed inokulacją) standaryzowanej zawiesinie C. albicans.</li>
		<li>Umieść myszy z uspokojeniem w pozycji leżącej. Delikatnie wyciągnij ich języki z ust za pomocą sterylnych kleszczy. Pocieraj język każdej myszy nasączonym wacikiem przez 30 sekund. Monitoruj myszy, dopóki nie wyzdrowieją z sedacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W piątym dniu należy podać uzupełniające podskórne wstrzyknięcie prednizolonu (100 mg/kg masy ciała) w celu utrzymania immunosupresji. 
	UWAGA: Ten protokół jest wystarczający do utrzymania infekcji przez 7 dni po inokulacji wewnątrzustnej. Oś czasu protokołu jest pokazana w Rysunek 2.</li>
</ol>
4. Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna i odzyskiwanie C. albicans ze zmian w jamie ustnej
<ol>
	<li>W siódmym dniu, przed leczeniem, znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg masy ciała) w połączeniu z ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść każde zwierzę w pozycji leżącej na podłożu na podkładce14,15wyposażone w druty ze stali nierdzewnej, które można owinąć wokół siekaczy, aby utrzymać otwarte usta. 
	UWAGA: Podkładki izotermiczne są zalecane do ogrzewania myszy podczas sedacji, zapobiegając hipotermii w temperaturze pokojowej i unikając śmiertelności związanej ze znieczuleniem15. Każde znieczulone zwierzę powinno być monitorowane pod kątem braku odruchu wycofania, gdy palce u nóg są ściśnięte w celu potwierdzenia głębokości znieczulenia. W razie potrzeby można podać jedną dawkę podtrzymującą ketaminy w 1/3 dawki pierwotnej (bez ksylazyny).</li>
	<li>Z cofniętą żuchwą i policzkami delikatnie umieść język na zewnątrz jamy ustnej.</li>
	<li>W przypadku myszy z grup C+L+ należy odpipetować 70 μl PS na grzbiet języka (w jednym z badanych stężeń). Trzymaj myszy w ciemnym otoczeniu przez okres 20 minut jako okres przed napromienianiem. Upewnij się, że w tym czasie język każdego zwierzęcia pozostaje umieszczony w jamie ustnej, aby zapobiec połknięciu fotouczulacza (PS).</li>
	<li>Po okresie fotouczulenia wyciągnij język z ust w celu oświetlenia. Umieść urządzenie LED na grzbiecie języka i zapal przy 37,5 J/cm2 (7 minut z obecnym urządzeniem) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>W przypadku zwierząt z grupy C+L- należy odpipetować 70 μl PS w jednym z badanych stężeń na grzbiecie języka i trzymać myszy w ciemności przez 27 minut.</li>
	<li>W przypadku zwierząt z grupy C-L+ (leczonych światłem bez wcześniejszego uczulenia na światło) należy odpipetować 70 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej na grzbiecie języka. Trzymaj myszy w ciemności przez 20 minut, a następnie oświetl ich języki napięciem 37,5 J/cm2 (7 minut z niniejszym urządzeniem).</li>
	<li>W przypadku myszy z grupy C-L- (nieleczonych PS ani światłem) należy odpipetować 70 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej na grzbiecie języka i trzymać je w ciemności przez 27 minut.</li>
	<li>Odzyskać C. albicans z języków wszystkich myszy natychmiast po leczeniu. Przetrzyj grzbiet języka przez 1 minutę sterylnym wacikiem.</li>
	<li>Umieść każdy wymazówkę z próbką w probówce zawierającej 1 ml sterylnej soli fizjologicznej i wiruj przez 1 minutę w celu ponownego zawieszenia komórek drobnoustrojów.</li>
	<li>Natychmiast wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia w PBS i płytkę 25 μl podwielokrotności na płytkach SDA w dwóch egzemplarzach. Inkubować płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach użyj cyfrowego licznika kolonii (patrz Tabela materiałów), aby określić liczbę kolonii drożdży. Obliczyć obciążenie C. albicans (jtk/ml) dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Przekształć wartości jtk/ml w log10 i przeanalizuj je prawidłowo, zgodnie z projektem eksperymentu i założeniami dotyczącymi danych. 
	UWAGA: W niniejszym dochodzeniu użyto jednoczynnikowego testu ANOVA Welcha i testu post-hoc Gamesa-Howella (α = 0,05)16.</li>
</ol>
5. Analizy histopatologiczne
<ol>
	<li>W ósmym dniu znieczulić myszy ketaminą w dawce 100 mg/kg w połączeniu z ksylazyną w dawce 10 mg/kg we wstrzyknięciu dootrzewnowym i poddać je eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy (200 mg/kg podawanej dootrzewnowo). Potwierdź zgon, sprawdzając, czy nie ma ruchów oddechowych (bezdech) i nie ma bicia serca (asystolia).</li>
	<li>Ostrożnie uszczypnij język i wyciągnij go z pyska zwierzęcia. Za pomocą ręcznego skalpela wykonaj nacięcie przed brodawkami okołowymi, aby chirurgicznie usunąć cały język, nie powodując żadnych obrażeń w przedniej i środkowej części.</li>
	<li>Utrwal język w 10% buforowanej formalinie (pH 7,2-7,4) na 24 godziny i myj go pod bieżącą wodą przez 2 godziny.</li>
	<li>Kontynuuj włączanie do procesu parafinowego: odwodnienie, klarowanie i impregnacja10,14.</li>
	<li>Wyciąć odcinki szeregowe (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu, a następnie przymocować sekcje do szkiełek podstawowych. Przystąp do barwienia tych skrawków za pomocą kwasu okresowego Schiffa i hematoksyliny (PAS-H) do badania histopatologicznego i identyfikacji grzybów poprzez obserwację pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Poproś patologa, najlepiej ślepego na badane grupy, aby zbadał reakcję tkanek spowodowaną zakażeniem C. albicans.</li>
	<li>Opisz charakterystykę histologiczną tkanki (nabłonka i tkanki łącznej), zwłaszcza miejscowe reakcje zapalne o różnym nasileniu.</li>
</ol>

Effective aPDT Using Curcuminoids for Oral Candidiasis in Mice

<ol><li>Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+candidiasis%3A+a+disease+of+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+fungi+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Oral candidiasis: a disease of opportunity.</a> Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15(2020).</li>
<li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Candida+albicans+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li>
<li>Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans-epithelial+interactions+and+pathogenicity+mechanisms%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface.</a> Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).</li>
<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li>
<li>Quindós, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+tools+for+oral+candidiasis%3A+Current+and+new+antifungal+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+oral%2C+patologia+oral+y+cirugia+buccal%22%5BJournal%5D)">Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs.</a> Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).</li>
<li>Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+basis+of+azole+antifungal+resistance+in+the+opportunistic+pathogenic+fungus+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).</li>
<li>Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+in+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 1020995(2013).</li>
<li>Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+curcumin+in+nanoformulations%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130(2021).</li>
<li>Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-mediated+Photodynamic+Therapy+for+the+treatment+of+oral+infections-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).</li>
<li>Dovigo, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-mediated+photodynamic+inactivation+of+Candida+albicans+in+a+murine+model+of+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis.</a> Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).</li>
<li>Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+light-activated+curcumin+and+curcuminoids+films+for+catheters+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+SurfacesB%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination.</a> Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386(2022).</li>
<li>Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+curcumin-mediated+photodynamic+inactivation+to+reduce+oral+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).</li>
<li>Takakura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+model+of+oral+candidiasis+with+local+symptoms+characteristic+of+oral+thrush%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush.</a> Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).</li>
<li>Mima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Candida+albicans+to+photodynamic+therapy+in+a+murine+model+of+oral+candidosis%5BTitle%5D)+AND+%22OralSurgery%2C+Oral+Medicine%2C+Oral+Pathology%2C+Oral+Radiology+and+Endodontology%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis.</a> OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).</li>
<li>Solis, N. V., Filler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+oropharyngeal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Mouse model of oropharyngeal candidiasis.</a> Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).</li>
<li>Marôco, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMar%C3%B4co%2C+J+%22An%C3%A1lise+Estat%C3%ADstica+com+o+SPSS+Statistics+25%22">Análise Estatística com o SPSS Statistics 25</a>. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).</li>
<li>Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+oral+candidiasis+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental oral candidiasis in animal models.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).</li>
<li>Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mini-host+models+in+the+study+of+medically+important+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of mini-host models in the study of medically important fungi.</a> The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).</li>
<li>Carmello, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+oral+candidiasis+using+Photodithazine-+mediated+photodynamic+therapy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo.</a> PLoS One. 11 (6), e0156947(2016).</li>
<li>Sakima, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+curcumin-loaded+polymeric+nanoparticles+in+a+murine+model+of+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis.</a> Molecules. 23 (8), 2075(2018).</li>
<li>Abe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucocorticoid+antagonist%2C+mifepristone+affects+anti-Candida+activity+of+murine+neutrophils+in+the+presence+of+prednisolone+in+vitro+and+experimental+candidiasis+of+prednisolone-treated+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).</li>
<li>Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+and+the+colonization+and+infection+of+the+mouths+of+germ-free+and+conventionalized+rats+with+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans.</a> Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).</li>
<li>Russell, C., Jones, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oral+inoculation+of+Candida+albicans+in+tetracycline-treated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats.</a> Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).</li>
<li>Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+oral+candidiasis+with+methylene+blue-+mediated+photodynamic+therapy+in+an+immunodeficient+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22OralSurgery%2C+Medicine%2C+Pathology%2C+Radiology+and+Endodontology%22%5BJournal%5D)">Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model.</a> OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).</li>
<li>Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+candidosis+by+Candida+albicans+in+normal+and+xerostomic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Oral+Research%22%5BJournal%5D)">Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice.</a> Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).</li>
<li>Hidalgo, K. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy+in+combination+with+nystatin+in+the+treatment+of+experimental+oral+candidiasis+induced+by+Candida+albicans+resistant+to+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole.</a> Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140(2019).</li>
</ol>

C. albicans jest związany z infekcjami jamy ustnej i przełyku u osób z obniżoną odpornością, cukrzycą, długotrwałym stosowaniem antybiotyków i złą higieną jamy ustnej 1,3. Badania nad chorobami zakaźnymi u ludzi wymagają zarówno badań in vitro, jak i in vivo, zanim będzie można bezpiecznie i dokładnie zaprojektować badania kliniczne. W niniejszej pracy opisano metodę ustalania mysiego modelu OC, który można wykorzystać do oceny patogene...

Kandydoza jamy ustnej (OC) jest główną infekcją grzybiczą jamy ustnej; jest spowodowana przerostem Candida spp. Czynniki predysponujące do OC obejmują dysfunkcję endokrynologiczną, stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania, radio- i chemioterapię, niedobory żywieniowe, kserostomię (niski przepływ śliny), używanie protez zębowych, złą higienę, a zwłaszcza immunosupresję1. Wśród gatunków Candida Candida albicans jest najbardziej rozpowszechniona i zjadliwa; Występuje jako gatunek komensalny w organizmie człowieka i jako patogen oportunistyczny. C. albicans ma zdolność zmiany morfologii z drożdży komensalnych (blastoporów) na patogenne włókna (strzępki i pseudostrzępki)2. Formy nitkowate, zwłaszcza strzępki, mogą atakować nabłonek gospodarza poprzez endocytozę lub aktywną penetrację, powodując infekcję3. Inne czynniki wirulencji C. albicans obejmują adhezję, tworzenie biofilmu oraz wydzielanie enzymów i toksyn lipolitycznych i hydrolitycznych, takich jak lipazy, fosfolipazy, proteinazy i kandydalizyna4.
Zabiegi OC polegają na stosowaniu środków przeciwgrzybiczych, zwłaszcza miejscowych polienów i azoli (nystatyny i mikonazolu)5. Wykazują one jednak tylko krótkotrwałą skuteczność, a nawroty są częste. Ponadto nadużywanie leków przeciwgrzybiczych spowodowało problem rozwoju i rozprzestrzeniania się oporności na leki przeciwgrzybicze6. Dlatego potrzebne są alternatywne terapie, takie jak przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT), która łączy fotosensybilizator (PS) i światło o odpowiedniej długości fali (takiej samej, jak absorpcja PS) w obecności tlenu. PS są wiązane lub pobierane przez komórki, a po aktywacji przez światło wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS), które są toksyczne dla uczulonych komórek7.
W aPDT, jednym z zastosowanych fotosensybilizatorów (PS) jest kurkumina (CUR), naturalnie występujący związek pozyskiwany z kłączy kurkumy (Curcuma longa L.). Kurkumina posiada liczne właściwości terapeutyczne, w tym właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe i przeciwbakteryjne8,9. Wcześniejsze badanie wykazało, że aPDT wykorzystujący CUR skutecznie zmniejszał C. albicans w mysim modelu kandydozy jamy ustnej, nie powodując żadnych szkód w tkankach gospodarza10. CUR jest głównym kurkuminoidem ekstrahowanym z kurkumy, ale w tej roślinie znajdują się również inne polifenole, takie jak demetoksykurkumina i bis-demetoksykurkumina. APDT za pośrednictwem kurkuminoidów wykazał działanie przeciwbakteryjne przeciwko biofilmom Staphylococcus aureus hodowanym w cewnikach11. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jego działanie przeciwgrzybicze wobec C. albicans pozostaje niejasne. Dlatego w tym badaniu oceniliśmy aPDT, w którym pośredniczy sól kurkuminoidowa przeciwko C. albicans w mysim modelu OC.

<table><tbody><tr><td>C. albicans</td><td>ATCC (Rockville, Md, USA)</td><td>90028</td><td>Używany do przygotowania wirówki do inokulum Candida</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp; Wirówka 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesja, Niemcy</td><td>022628146 (NA)</td><td>Służy do przygotowania inokulum Candida</td></tr><tr><td>Chlorek chlorpromazyny 2 mg / ml</td><td>Apteka mieszająca, Araraquara, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>Służy do uspokajania zwierząt podczas inokulacji Candida</td></tr><tr><td>Rozpuszczalna w wodzie sól na bazie kurkuminy</td><td>PDTPharma, Cravinhos, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Składa się w 53,4% z naturalnej kurkuminy i&nbsp; 46,6% z innych kurkuminoidów (demetoksykurkuminy i bis-demetoksykurkuminy). Przygotowany w wodzie i N-metyloD-glukaminie (końcowa średnia masa cząsteczkowa 730,32 g.mol&minus; 1)</td></tr> <tr><td>Cyfrowy licznik kolonii</td><td>CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Cient&iacute; ficos Ltda, Araraquara, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Służy do liczenia kolonii na płytkach agarowych</td></tr><tr><td>Wytłaczana karma dla myszy</td><td>Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lind&oacute; ia, S&atilde; o Stan Paulo, Brazylia.</td><td>&nbsp;-</td><td>Używany do karmienia myszy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy 10%</td> <td>Ketamina Agener, Uni&atilde; o Qu&iacute; mika Farmac&ecirc; utica Nacional S/A, Embu-Gua&ccedil; u, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Służy do znieczulania zwierząt przed&nbsp; zabiegami i do eutanazji</td></tr><tr><td>Rękojeść z diodą elektroluminescencyjną (prototyp)</td><td>Instituto de F&iacute; sica de S&atilde; o Carlos, Uniwersytet S&atilde; o Paulo, S&atilde; o Carlos, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Wykonane z LXHL-PR09, emiter Luxeon III, Lumileds Lighting, San Jose, Kalifornia, USA</td></tr><tr><td>Octan metyloprednizolonu 40 mg</td><td>DEPO-MEDROL, Pfizer, Nowy Jork</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Stosowany jako lek immunosupresyjny</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica&nbsp; Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>SM2500</td><td>Służy do cięcia seryjnych sekcji języków</td></tr><tr><td>Pudełka propylenowe (obudowy klatek) H13 x L20 x D30 cm</td><td>Bonther Equipments, Ribeir&atilde; o Preto, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Używany do trzymania zwierząt przez cały okres eksperymentalny</td></tr><tr><td>Sabouraud Agar dekstrozowy z chloramfenikolem</td><td>HiMedia, Bombaj, Indie</td><td>MM1067-500G</td><td>Pożywka hodowlana do wzrostu drożdży (agar)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Spektrofotometr Kasvi K37-VIS , S&atilde; o Jos&eacute; dos Pinhais, PR, Brazylia</td><td>K37-VIS&nbsp;</td><td>Służy do standaryzacji stężenia inokulum</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny&nbsp;</td><td>Apteka mieszająca, Araraquara, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Antybiotyk podawany w celu wywołania dysbiozy jamy ustnej</td></tr><tr><td>Wióry drzewne</td><td>J.R. Wood Shaquis, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, S&atilde; o Stan Paulo, Brazylia&</td><td>nbsp;-</td><td>Używany do wykładzin podłogowych wewnątrz skrzynek mieszkalnych</td></tr><tr><td>Ksylazyna 2%</td><td>Calmiun, Uni&atilde; o Qu&iacute; mika Farmac&ecirc; utica Nacional S/A, Embu-Gua&ccedil; u, SP, Brazylia</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Stosowany w połączeniu z ketaminą do znieczulenia</td></tr><tr><td>Rosół azotowy drożdżowy&nbsp;</td><td>Difco, InterLab, Detroit, MI, Stany Zjednoczone</td><td>DF0919-07-3&nbsp;</td><td>Pożywka do wzrostu drożdży (bulion)</td></tr><tr><td>Bulion drożdżowo-peptonowy dekstrozowy</td><td>NutriSelect Basic, Sigma Aldrich</td><td>Y1375</td><td>Pożywka hodowlana do utrzymania szczepów w temperaturze -80&deg; C i rosną</td></tr></tbody></table>

przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna (aPDT) została gruntownie zbadana in vitro, a przedkliniczne modele zwierzęce infekcji są odpowiednie do oceny alternatywnych metod leczenia przed badaniami klinicznymi. Badanie to opisuje skuteczność aPDT w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. Czterdzieści myszy poddano immunosupresji za pomocą podskórnych zastrzyków prednizolonu, a ich języki zaszczepiono za pomocą wacika z jamy ustnej uprzednio nasączonego zawiesiną komórek C. albicans. Tetracyklinę podawano w wodzie pitnej w trakcie trwania eksperymentu. Pięć dni po zaszczepieniu grzybów myszy zostały losowo podzielone na osiem grup; Dziewiąta grupa nieleczonych niezakażonych myszy została włączona jako kontrola ujemna (n = 5). Trzy stężenia (20 μM, 40 μM i 80 μM) mieszaniny kurkuminoidów badano za pomocą niebieskiego światła LED (89,2 mW/cm2; ~455 nm) i bez światła (odpowiednio grupy C+L+ i C+L-). Samo światło (C-L+), brak leczenia (C-L-) i zwierzęta bez infekcji oceniano jako kontrolę. Dane analizowano za pomocą testów ANOVA i Gamesa-Howella firmy Welch (α = 0,05). Kandydoza jamy ustnej została stwierdzona u wszystkich zakażonych zwierząt i uwidoczniona makroskopowo poprzez obecność charakterystycznych białych plam lub pseudobłon na grzbiecie języków. Wycinki histopatologiczne potwierdziły dużą obecność drożdży i włókien ograniczonych do zrogowaciałej warstwy nabłonka w grupie C-L-, a obecność komórek grzybów była wizualnie zmniejszona w obrazach uzyskanych od myszy poddanych aPDT z kurkuminoidami 40 μM lub 80 μM. aPDT, w którym pośredniczyły kurkuminoidy o długości 80 μM, sprzyjały zmniejszeniu liczby kolonii o 2,47 log10 w porównaniu z tymi w grupie C-L- (p = 0,008). Wszystkie pozostałe grupy nie wykazały statystycznie istotnego zmniejszenia liczby kolonii, w tym grupy z fotouczulaczem (C+L-) lub samym światłem (C-L+). APDT za pośrednictwem kurkuminoidów zmniejszył obciążenie grzybami z języków myszy.

Mysi model OC wykazał typowe białe plamy i błony rzekome na językach wszystkich zakażonych myszy (Rycyna 4A). C. albicans wyizolowany od zwierząt z grupy C-L potwierdził kolonizację tkanek przez ten mikroorganizm (wartości w zakresie od 1,62 x 104 do 4,80 x 105 CFU/mL). Zgodnie z oczekiwaniami, zwierzęta z grupy NCtr nie wykazały żadnych zmian tkankowych ani wzrostu kolonii po pobraniu próbek (Rycina 4B).
<p class="jove_content...

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been extensively investigated in vitro, and preclinical animal models of infections are suitable for ...

Kandydoza jamy ustnej jest bardzo rozpowszechniona, zwłaszcza w ruchomych wyrostkach zębowych u osób z obniżoną odpornością. Leczenie lekami przeciwgrzybiczymi ma wady, takie jak nawroty i oporność. Tak więc nasza grupa jest badana pod kątem alternatyw terapeutycznych od ponad 20 lat.Ponieważ kliniczne modele zwierzęce są równie ważne, jak kroki poprzedzające badania kliniczne, staramy się ustalić mysz morską z kandydozą jamy ustnej. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna lub APDT to szybka alternatywa, która może być szeroko stosowana jako alternatywa dla obecnych metod leczenia przeciwbakteryjnego. Wymaga połączenia skupionego światła laserowego i tlenu, aby wywołać działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko szerokiemu spektrum mikroorganizmów jamy ustnej, w tym tych opornych na konwencjonalne leki.Kurkumina może być obiecującym fotouczulaczem na biofilmy Candida, jednak jest to hydrofobowy polifenol o niskiej rozpuszczalności w wodzie i biodostępności. W związku z tym przeprowadzono badania mające na celu zwiększenie skuteczności mediatora kurkuminy APDT poprzez zastosowanie systemów dostarczania leków lub powiązanie fotouczulacza z przeciwbakteryjnym zapaleniem wątroby.

curcuminoid-mediated-antimicrobial-photodynamic-therapy-on-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu zastosowania czerwonego światła na wzrost biofilmu Candida albicans. Niekoherentne urządzenie do pomiaru światła czerwonego o długości fali 635 nm i gęstości energii 87,6 J·cm-2 stosowano przez cały okres wzrostu biofilmów Candida albicans przez 48 godzin.

Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans

Rosnąca częstość występowania lekoopornych Candida albicans jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) może stanowić strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Niniejszy protokół opisuje skuteczność aPDT za pośrednictwem Rose bengal na wielolekoopornym szczepie C. albicans in vitro.

Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem róży bengalskiej w celu zahamowania Candida albicans

Znaczenie małych kolonii w lekooporności Candida spp. nie zostało w pełni zbadane. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) stanowi obiecującą strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Badanie to pokazuje, że aPDT za pośrednictwem róży bengalskiej skutecznie dezaktywuje Candida glabrata i indukuje drobne kolonie, prezentując unikalną procedurę.

Indukcja drobnych kolonii w Candida glabrate za pomocą terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Ten artykuł przedstawia dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii beztlenowych, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji bakterii beztlenowych oddziałujących z komórkami gospodarza. Badanie to można zastosować do każdego uprawianego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Celem tego protokołu jest imitacja kolonizacji pochwy przez Streptococcus grupy B (GBS) w modelu mysim. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi immunologicznych gospodarza i czynników bakteryjnych przyczyniających się do utrzymywania się GBS w pochwie, a także do testowania strategii terapeutycznych.

Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Infekcje wywołane przez wielolekooporne (MDR) szczepy bakteryjne stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, co spowodowało konieczność opracowania alternatywnych metod leczenia. Przedstawiamy protokół oceny skuteczności terapii przeciwdrobnoustrojowym światłem niebieskim (aBL) w zakażeniach MDR Acinetobacter baumannii w oparzeniach myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

In vivo (in vivo) Badanie przeciwdrobnoustrojowej terapii światłem niebieskim w wielolekoopornych zakażeniach oparzeniami Acinetobacter baumannii przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Dowiedz się o przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej z użyciem kurkuminoidów w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. Ta metoda oferuje obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych leczeń przeciwgrzybiczych.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Przeglądaj więcej filmów