Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej
27 października 2023
Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.
Kandydoza jamy ustnej jest bardzo rozpowszechniona, zwłaszcza w ruchomych wyrostkach zębowych u osób z obniżoną odpornością. Leczenie lekami przeciwgrzybiczymi ma wady, takie jak nawroty i oporność. Tak więc nasza grupa jest badana pod kątem alternatyw terapeutycznych od ponad 20 lat.
Ponieważ kliniczne modele zwierzęce są równie ważne, jak kroki poprzedzające badania kliniczne, staramy się ustalić mysz morską z kandydozą jamy ustnej. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna lub APDT to szybka alternatywa, która może być szeroko stosowana jako alternatywa dla obecnych metod leczenia przeciwbakteryjnego. Wymaga połączenia skupionego światła laserowego i tlenu, aby wywołać działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko szerokiemu spektrum mikroorganizmów jamy ustnej, w tym tych opornych na konwencjonalne leki.
Kurkumina może być obiecującym fotouczulaczem na biofilmy Candida, jednak jest to hydrofobowy polifenol o niskiej rozpuszczalności w wodzie i biodostępności. W związku z tym przeprowadzono badania mające na celu zwiększenie skuteczności mediatora kurkuminy APDT poprzez zastosowanie systemów dostarczania leków lub powiązanie fotouczulacza z przeciwbakteryjnym zapaleniem wątroby. Szerokie stosowanie leków przeciwgrzybiczych doprowadziło do globalnego zagrożenia oporności u gatunków Candida i późniejszych niepowodzeń leczenia.
W związku z tym głównym celem naszych badań było kontrolowanie biofilmów Candida w walce z opornością na leki przeciwgrzybicze poprzez działanie fotodynamiczne. Opracowany przez nas mysi model jamy ustnej Candida może być wykorzystany do oceny patogenezy naszych zakażeń przez Candida oraz skuteczności alternatywnych metod przeciwgrzybiczych. Używamy modelu do oceny skuteczności APDT, w którym pośredniczy rozpuszczalny w wodzie związek kurkuminoidowy.
Na początek losowo rozłóż myszy, których jama ustna jest ujemna dla wzrostu Candida, na dziewięć grup, z których każda odpowiada innemu stężeniu kurkuminoidów ze światłem lub bez. Pierwszego dnia wstrzyknąć podskórnie lek immunosupresyjny prednizolon wszystkim członkom grupy. Zapewnij chlorowodorek tetracykliny w stężeniu 0,83 miligrama na mililitr w wodzie pitnej od pierwszego dnia do końca eksperymentu.
Drugiego dnia należy podać domięśniowo chlorek chlorpromazyny na każdy mięsień uda, aby uspokoić mysz do inokulacji wewnątrzustnej. Następnie zanurz sterylny wacik w świeżo przygotowanej standaryzowanej zawiesinie Candida albicans. Po ułożeniu myszy w pozycji leżącej na plecach pocieraj jej język nasączonym wacikiem przez 30 sekund.
W piątym dniu należy podać bezpłatne podskórne wstrzyknięcie prednizolonu w celu utrzymania immunosupresji. Siódmego dnia, przed zabiegiem, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na podkładce wyposażonej w nici. Owiń nić wokół siekaczy, aby usta były otwarte.
Dozować 70 mikrolitrów fotouczulacza na grzbiet języka każdej myszy należącej do grupy C plus Lplus . Następnie przenieś język z powrotem do jamy ustnej i trzymaj mysz w ciemnym otoczeniu przez 20 minut jako okres przed napromienianiem. Po okresie fotouczulnienia umieść urządzenie LED na grzbiecie języka i oświetlaj je przez siedem minut.
Nałóż fotouczulacz na grupy C plus L minus, jak pokazano, i trzymaj myszy w ciemności przez 27 minut natychmiast po podaniu, przetrzyj grzbiet języka przez jedną minutę, używając sterylnego bawełnianego wacika, aby pobrać Candida albicans z języka. Umieść każdy wymazówkę z próbką w probówce zawierającej jeden mililitr sterylnej soli fizjologicznej i wiruj przez jedną minutę. Aby ponownie zawiesić komórki drobnoustrojów.
Bezzwłocznie wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w PBS i poszczepić 25 mikrolitrów aliquat na płytkach z dekstrozą sabourauda w dwóch egzemplarzach, inkubować płytki tlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach użyj cyfrowego licznika kolonii, aby określić liczbę kolonii drożdży. Oblicz obciążenie Candida albicans dla każdego zwierzęcia.
Ósmego dnia po prawidłowej eutanazji zwierzęcia przystąp do chirurgicznego usunięcia języka, wykonaj usunięcie języka przed brodawką okołoporodową, aby upewnić się, że cały język został usunięty. Na koniec przystąp do analizy histopatologicznej izolowanego języka. Mysi model kandydozy jamy ustnej wykazał typowe białe plamy i pseudobłony na języku zakażonych myszy.
Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna zmniejszała żywotność Candida albicans przy stężeniu kurkuminoidów 80 mikromolowych. Języki niezakażonych zwierząt wykazywały normalne, zdrowe tkanki, w tym nienaruszoną blaszkę właściwą, błonę podstawną i brodawki nitkowate W grupie C minus L minus w zrogowaciałej warstwie nabłonka zaobserwowano drożdże i włókna W zrogowaciałej warstwie nabłonka Łagodna reakcja zapalna była obecna w leżącej poniżej tkance łącznej. Natomiast myszy leczone przeciwbakteryjną terapią fotodynamiczną za pośrednictwem 80 mikromolowców.
Kurkuminoidy miały mniej komórek grzybów w zrogowaciałej warstwie nabłonka języka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykorzystuje połączenie skupionej wiązki światła laserowego i rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów w celu uzyskania efektów przeciwdrobnoustrojowych przeciwko mikroorganizmom jamy ustnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Terapeutyka
- Zdrowie jamy ustnej
Wstęp
- Kandydoza jamy ustnej jest powszechna, szczególnie u osób z immunosupresją.
- Konwencjonalne leczenie przeciwgrzybicze napotyka na problemy, takie jak nawroty i oporność.
- W celu rozwiązania tych problemów prowadzone są badania nad terapiami alternatywnymi.
- Modele zwierzęce są kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia przed rozpoczęciem badań klinicznych.
Cel badania
- Ustanowienie mysiego modelu kandydozy jamy ustnej.
- Ocena skuteczności aPDT jako alternatywnej metody leczenia.
- Zbadanie potencjału kurkuminoidów w połączeniu z niebieskim światłem LED.
Zastosowane metody
- Opracowanie mysiego modelu kandydozy jamy ustnej.
- Zastosowanie przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej (aPDT).
- Wykorzystanie rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów.
- Naświetlanie niebieskim światłem LED w celu aktywacji terapii.
Główne wyniki
- aPDT wykazała działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko mikroorganizmom jamy ustnej.
- Kurkuminoidy wykazały potencjał w redukcji kandydozy jamy ustnej.
- Połączenie światła i kurkuminoidów było skuteczne w modelu mysim.
- Wyniki sugerują, że aPDT może być realną alternatywą dla leczenia przeciwgrzybiczego.
Wnioski
- aPDT stanowi obiecującą alternatywę w leczeniu kandydozy jamy ustnej.
- Dalsze badania są niezbędne do potwierdzenia skuteczności w warunkach klinicznych.
- Niniejsze badanie przyczynia się do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Antymikrobiologiczna terapia fotodynamiczna (aPDT) oparta na kurkuminoidach w mysim modelu kandydozy jamy ustnej odpowiada na pilną potrzebę opracowania alternatywnych strategii przeciwgrzybiczych w obliczu rosnącej oporności i częstości nawrotów. Ten przedkliniczny schemat postępowania umożliwia ilościową ocenę skuteczności przeciwgrzybiczej, zwiększając pewność predykcyjną i ograniczając ryzyko mechanistyczne w punkcie przejścia z etapu odkrywania do fazy przedklinicznej. Powtarzalność modelu oraz dane ilościowe stanowią podstawę do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju portfolio leków przeciwgrzybiczych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów przeciwgrzybiczych oraz testowanie hipotez terapeutycznych w kontrolowanym systemie in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie redukcji ładunku grzybiczego oraz zmian histopatologicznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla interwencji opartych na fotousensybilizatorach i świetle.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany model zwierzęcy do ustandaryzowanej oceny kandydatów na leki przeciwgrzybicze.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników liczenia kolonii do analizy porównawczej.
- Umożliwia ocenę zależności dawka-odpowiedź oraz progów terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie kandydozy jamy ustnej u gospodarzy z immunosupresją.
- Wspiera ciągłość translacyjną od wyników in vitro do walidacji skuteczności in vivo.
- Umożliwia podejmowanie przedklinicznych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie statystycznie istotnych redukcji obciążenia grzybiczego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten mysi model aPDT stanowi pomost między wczesnym etapem odkryć a walidacją przedkliniczną, zapewniając platformę do ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz ilościowej oceny skuteczności przed translacją kliniczną.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie efektów przeciwgrzybiczych i wyjaśnienie mechanizmu działania terapii fotodynamicznej z wykorzystaniem kurkuminoidów.
- Przesiewanie: Standaryzacja warunków testów in vivo w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych pomiarów obciążenia grzybiczego.
- Analityka: Zastosowanie analizy statystycznej (ANOVA Welcha, test Gamesa-Howella) do porównania grup badawczych i ustalenia istotności statystycznej.
- Badania translacyjne: Modelowanie klinicznie istotnej infekcji i immunosupresji w celu wsparcia rozwoju badań przedklinicznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Opracowanie powtarzalnego modelu zwierzęcego do oceny alternatywnych metod zwalczania grzybicy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie kandydatów na leki przeciwgrzybicze.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych, skalowalnych i powtarzalnych danych dotyczących skuteczności in vivo.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym sortowanie portfela projektów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów przeciwgrzybiczych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe wyniki przedkliniczne.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obsługi zwierząt, protokołów immunosupresji oraz modelowania infekcji doustnych.
- Wymagany jest dostęp do źródeł niebieskiego światła LED, preparacji fotousensybilizatorów oraz ilościowych testów mikrobiologicznych.
- Konieczna jest standaryzacja procedur zakażania, leczenia i analizy pomiędzy zespołami.
- Adaptacja protokołu może być niezbędna w przypadku innych gatunków grzybów lub schematów immunosupresji.
- Moc statystyczna i liczebność grup muszą być wystarczające do przeprowadzenia rzetelnych porównań skuteczności.
