Optymalizacja hodowli komórek nabłonka soczewek pierwotnych myszy: kompleksowy przewodnik po trypsynizacji
21 czerwca 2024
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wideo do hodowli komórek nabłonka soczewki pierwotnej (LEC), mający na celu poprawę odtwarzalności i pomoc w badaniach nad zaćmą i zmętnieniem torebki tylnej (PCO). Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące rozwarstwiania soczewek, izolacji LEC i walidacji, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w tej dziedzinie.
Naszym celem badawczym jest poznanie przyczyn leżących u podstaw zaćmy, ze szczególnym uwzględnieniem funkcji enzymów naprawczych redoks. Naszym celem jest zidentyfikowanie kluczowej roli, jaką ten enzym odgrywa w ochronie soczewek oraz ustalenie ich potencjału jako celów leków w profilaktyce i leczeniu zaćmy. Wśród wielu ekscytujących technologii, nasze badania wykorzystują komórki nabłonka soczewki jako podstawową platformę.
Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla rozwikłania mechanizmu powstawania zaćmy, zmętnienia tylnej torebki i odkrycia nowych leków przeciwzaćmowych. Idąc dalej, skupimy się na zrozumieniu wpływu enzymów antyoksydacyjnych i starzenia się na funkcjonalność soczewek. Naszym celem jest odkrycie innowacyjnych terapii antyoksydacyjnych, które mogą opóźnić starzenie się soczewki, zapobiegać zaćmie i zapewnić skuteczną interwencję w przypadku PCO.
Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na platformie chirurgicznej. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby delikatnie usunąć powieki. Następnie za pomocą zakrzywionej pęsety delikatnie uciskaj przeciwległą stronę oczodołu, powodując wysunięcie oka na zewnątrz.
Użyj noża do zaćmy, aby wykonać ostrożne nacięcie rogówki i użyj zakrzywionej pęsety, aby ostrożnie wyjąć soczewkę. Następnie, za pomocą zakrzywionej pęsety z końcówkami, przenieś soczewki do 60-milimetrowej plastikowej naczynia hodowlanej zawierającej pięć mililitrów sterylnego DPBS i gentamycyny. Delikatnie przepłukać soczewki roztworem DPBS zawierającym gentamycynę.
Po zakończeniu procesu płukania umieść soczewkę na kawałku bibuły filtracyjnej i pozostaw do wyschnięcia. Gdy soczewka odpowiednio wyschnie, przenieś ją ostrożnie na pokrywę szalki Petriego, aby przygotować się do wyjęcia kapsułki soczewki. Następnie obróć soczewkę do góry, upewniając się, że przedni segment jest skierowany do góry.
Trzymając przednią torebkę pęsetą, użyj kleszczyków capsulorhexis w dominującej ręce, aby utworzyć małe rozdarcie. Delikatnie pociągnij oba narzędzia w przeciwnych kierunkach, aby wyjąć kapsułkę. Umieść kapsułkę w DPBS, aż wszystkie sekcje soczewek zostaną zakończone.
Następnie ostrożnie przenieś kapsułkę soczewki na płytkę sześciodołkową. Dodaj jeden mililitr 0,05% roztworu trypsyny do każdej studzienki, aby zainicjować proces trawienia enzymatycznego. Delikatnie wymieszaj roztwór tripsin, aby zapewnić równomierne przenikanie.
Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwól kapsułce trawić się przez osiem do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie zmielić strawioną torebkę soczewki, aby przyspieszyć separację komórek. Dodać 0,5 mililitra pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby ugasić tripsinę.
Przenieść próbki tkanek do probówki wirówkowej i odwirować przy 1000 G przez pięć minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego. Użyj jednego mililitra pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić komórki i zasiać je na 24-dołkowej płytce.
Obraz z kontrastem fazowym hodowanych komórek nabłonka soczewki wykazał, że między trzecim a piątym dniem komórki rozpoczęły fazę proliferacji. Szybki wzrost i logarytmiczne fazy proliferacji można było zaobserwować między siódmym a dziesiątym dniem.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na roli enzymów naprawy redoks w powstawaniu katarakty oraz zmętnieniu tylnej torebki soczewki (PCO). Wykorzystując pierwotne komórki nabłonka soczewki (LECs) jako model, badanie ma na celu sprawdzenie potencjalnych interwencji poprzez zastosowanie leczenia antyoksydacyjnego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Badania nad kataraktą
- Biologia redoks
- Techniki hodowli komórkowych
Wstęp
- Zaćma pozostaje jedną z głównych przyczyn ślepoty.
- Zrozumienie mechanizmów ochrony soczewki oka jest kluczowe dla terapii.
- Poprzednie badania wskazują, że zaburzenia równowagi redoks przyczyniają się do starzenia się soczewki.
Zastosowane metody
- Protokół wideo hodowli pierwotnych komórek nabłonka soczewki
- Myszy jako model biologiczny
- Metody trawienia enzymatycznego i hodowli komórkowej
Główne wyniki
- Osiągnięto pomyślną izolację i hodowlę komórek LEC.
- Proliferację hodowanych komórek obserwowano od trzeciego do dziesiątego dnia.
- Zidentyfikowano możliwości wykorzystania enzymów antyoksydacyjnych jako celów terapeutycznych.
Wnioski
- Badanie dostarcza powtarzalnego protokołu hodowli LEC.
- Wyniki mogą przyczynić się do postępów w zapobieganiu i leczeniu katarakty.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Utworzenie stabilnych kultur pierwotnych komórek nabłonka soczewki (LEC) myszy pozwala na rozwiązanie krytycznego problemu w początkowych etapach poszukiwania leków okulistycznych, zwłaszcza w badaniach nad kataraktą i zmętnieniem tylnej torebki (PCO). Niezawodne systemy LEC umożliwiają analizę mechanistyczną w celu ograniczenia ryzyka oraz walidację celów dla terapeutyków przeciwutleniających i modulujących procesy redox. Niniejszy protokół zapewnia przewidywalność wyników w punkcie przejścia z etapu odkrywania leków do fazy przedklinicznej dla portfeli badawczych dotyczących chorób soczewki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji enzymów naprawczych reduksja-oksydacja w ochronie soczewki i kataraktogenezie.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie autentycznych modeli pierwotnych komórek do badań mechanistycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla kandydatów na leki przeciwutleniające.
- Zwiększa pewność prognostyczną w opracowywaniu terapii celowanych w soczewkę.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia standaryzowany protokół generowania powtarzalnych kultur LEC odpowiednich do dalszych analiz.
- Umożliwia ilościową ocenę proliferacji i żywotności komórek w warunkach eksperymentalnych.
- Wspiera rozwój testów do oceny związków kandydackich wpływających na biologię soczewki.
- Zapewnia gotowość platformy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (high-content screening) modulatorów redox.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki uzyskano in vitro z mechanizmami chorobowymi zaangażowanymi w kataraktę i PCO.
- Ułatwia przejście od etapu odkryć do przedklinicznej walidacji interwencji antyoksydacyjnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów terapeutycznych ukierunkowanych na soczewkę.
- Stanowi podstawę do translacyjnych badań nad biomarkerami w zakresie zdrowia soczewki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół przedstawia pierwotne hodowle LEC jako podstawowe narzędzie obejmujące wczesne etapy odkrywania, walidację celów oraz badania przedkliniczne w procesie opracowywania leków okulistycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących roli enzymów redoks w utrzymaniu funkcji soczewki oraz w patogenezie chorób.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe testy komórkowe do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza odczyty z mikroskopii w kontraście fazowym i immunofluorescencji w celu obiektywnego porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne wnioski z badań in vitro z modelami chorób in vivo w przypadku zaćmy i PCO.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia powtarzalny, zestandaryzowany schemat pracy dla badań nad biologią soczewki w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odkrywaniem leków celowanych w soczewkę.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację, hodowlę i charakterystykę LEC w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne wykorzystanie kapitału w rozwoju terapii okulistycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki redoksowe i przeciwutleniające w zaburzeniach soczewki w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji oka myszy oraz technik hodowli pierwotnych kultur komórkowych.
- Wymaga dostępu do mikroskopii kontrastowej oraz infrastruktury immunofluorescencyjnej w celu charakterystyki komórek.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji etapów izolacji i trypsynizacji pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla innych gatunków lub modeli chorobowych, w zależności od celu badań.
- Ograniczony przez delikatną naturę i powolną proliferację pierwotnych LEC, co wpływa na wydajność procesu.
