Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Jedna z najskuteczniejszych celowanych terapii przeciwnowotworowych opiera się na przeciwciałach, takich jak przeciwciało anty-HER2 trastuzumab. Działanie przeciwnowotworowe trastuzumabu obejmuje zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową, ADCC, przez komórki NK lub komórki NK. Zrozumienie mechanizmów regulujących wrażliwość komórek nowotworowych na terapię przeciwciałami przeciwko receptorowi czynnika wzrostu, ze szczególnym uwzględnieniem ADCC, może mieć kluczowe znaczenie dla opracowania nowych, bardziej skutecznych metod leczenia.

Modele 3D, takie jak sferoidy komórek rakowych, okazały się lepsze w przewidywaniu odpowiedzi immunologicznej nowotworów na różne terapie przeciwnowotworowe. Dlatego stworzyliśmy model sferoidalny ADCC przy użyciu linii komórkowej NK92 natural killer, komórek raka piersi JIMT-1 eksprymujących GFP i trastuzumabu. Stworzyliśmy system testowy ADCC, indukując anty-HER2-dodatnie komórki raka piersi JIMT-1 do tworzenia trójwymiarowych klastrów zwanych sferoidami.

Linia komórkowa JIMT-1 użyta w eksperymentach stabilnie ulega ekspresji białka zielonej fluorescencji. Eksperyment rozpoczynamy od przygotowania 96-dołkowej płytki do tworzenia sferoid. Aby stworzyć dno w kształcie litery U i odpychające komórki, pokryj 96-dołkową płytkę roztworem 0,5% agarozy w PBS.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez około 30 do 45 minut. W międzyczasie trypsynizacja i liczenie komórek JIMT-1 do wysiewu komórek. Umyj komórki dwoma mililitrami sterylnego PBS.

Dodaj dwa mililitry trypsyny-EDTA do kolby i umieść kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 minut. Po inkubacji postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 się odłączyły. Przerwij trawienie za pomocą dwóch mililitrów pożywki JIMT-1 i zbierz zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki.

Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego w komorze Burkera i dostosuj liczbę komórek do 20 000 komórek na ml. Zasiej komórki na 96-dołkowej płytce, pipetując 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki w celu utworzenia sferoid. Pozwól komórkom zbić się razem podczas trzydniowej inkubacji w temperaturze 37 stopni w inkubatorze CO2.

Regularnie sprawdzaj rozmiar i kształt sferoid za pomocą odwróconego mikroskopu. Trzeciego dnia po indukcji sferoid pokryj 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości roztworem Pluronic F-127 w DMSO. Powłoka ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia przywieraniu sferoid JIMT-1 EGFP do powierzchni szkła lub płyty.

Po okresie inkubacji trwającym 45 minut w temperaturze pokojowej odessać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć studzienki pożywką niezawierającą surowicy DMEM F12. Przenieść sferoidy na 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości w trzech porcjach za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Dodać sunitynib do studzienek o stężeniu 40 mikromolowym w 10 mikrolitrach na studzienkę i odpipetować świeżą pożywkę JIMT-1 do studzienek kontrolnych w celu zwiększenia objętości.

Inkubować płytkę przez godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni. Podczas gdy trwa inkubacja wstępnie potraktowanych sferoid, należy zebrać komórki NK92 z kolby do 15-mililitrowej probówki. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego w komorze Burkera i dostosuj liczbę komórek, aby osiągnąć stosunek efektora do celu 20 do 1.

Wybarwić komórki NK 10-mikromolowym roztworem CellTracker Blue i umieścić je w inkubatorze CO2 na godzinę w temperaturze 37 stopni. Aby zmyć nadmiar barwnika, należy dwukrotnie odwirować komórki NK w temperaturze 150 RCF przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki na świeżym nośniku JIMT-1.

Dodaj wybarwione komórki NK do docelowych sferoid JIMT-1 EGFP, pipetując 55 mikrolitrów na studzienkę wraz z przeciwciałem anty-HER2 trastuzumabem. Rozcieńczyć trastuzumab w pożywce JIMT-1 do stężenia 10 mikrogramów na ml. Dodaj 110 mikrolitrów świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych i inkubuj płytkę przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni.

W rezultacie całkowita objętość leczenia dodanego do ADCC wynosi 110 mikrolitrów, a końcowe stężenie sunitynibu wynosi 20 mikromoli na litr. Aby wykryć i zmierzyć apoptozę śmierci komórki po zabiegach, wybarwić sferoidy koniugatem Annexin V Alexa Fluor 647 przez jedną godzinę w pożywce JIMT-1. Po zakończeniu etapów eksperymentalnych przenieś płytkę do urządzenia do analizy o wysokiej zawartości.

Płytka jest obrazowana 24 godziny po dodaniu czynników NK do komórek docelowych. Do obrazowania używamy analizatora o wysokiej zawartości i oprogramowania do analizy obrazu. Wybierz typ mikropłytki z listy płytek za pomocą opcji Typ płytki.

Użyj 96-dołkowej płytki sitowej o wysokiej zawartości. Wybierz dwa szczytowe autofokusy, jak testy przeprowadzane na płytkach z obiektywem 10x i aperturą numeryczną 0,3, korzystając odpowiednio z opcji autofokusa i obiektywu. Wybierz tryb konfokalny z opcją OptiMode i zastosuj Binning 2 do opcji Binning.

W przypadku sferoid obrazowania wybierz odpowiednie kanały za pomocą opcji Wybór kanału. Aby wykryć komórki JIMT-1 przetoczone przez EGFP, wybierz EGFP z 200-milisekundowym czasem integracji, 50% mocą lasera, dwumikrometrową wysokością stosu, wzbudzeniem 488 nanometrów i długościami fal emisji 500, 550 nanometrów. Aby wykryć komórki apoptotyczne, użyj Alexa 647 z czasem integracji 100 milisekund, 50% mocą lasera, 10-mikrometrową wysokością stosu, wzbudzeniem 640 nanometrów, długościami fal emisji 650, 760 nanometrów.

Aby zobrazować komórki NK w sferoidach, wybierz następujący kanał: DAPI z czasem integracji 100 milisekund, 50% mocą lasera, wysokością stosu wynoszącą dwa mikrometry, wzbudzeniem 405 nanometrów i długością fali emisji 435 418 nanometrów. W opcji Wybór układu wybierz stosy Z, ponieważ komórki w sferoidach zwykle znajdują się na różnych płaszczyznach ogniskowych mikroskopu. 10 płaszczyzn o odległości 10 mikrometrów wystarcza do pokrycia całego obszaru sferoidalnego.

Ustaw wartości pierwszej i ostatniej płaszczyzny odpowiednio na 0 mikrometrów i 90 mikrometrów. Przed rozpoczęciem pomiaru można wykonać przykładowe obrazy za pomocą funkcji Snapshot w celu sprawdzenia poprawności ustawień. Ustaw liczbę dołków i pól do obrazowania za pomocą opcji Zdefiniowany układ.

Zidentyfikuj sferoidy za pomocą komórek fluorescencyjnych EGFP lub JIMT-1 za pomocą opcji Obszar drobnej tekstury i odfiltruj je według rozmiaru. Usuń obiekty obramowania przy użyciu modułu Wybierz populację. Ponieważ komórki dodatnie aneksyny pojawiają się na sferoidach obwodowych, zmierz intensywność aneksyny w pierścieniu apoptotycznym.

W module Select Region (Wybierz region) ustaw obramowanie zewnętrzne na wartość minus 90. Wartości intensywności aneksyny należy wyrazić jako średnią intensywność. Jak wskazuje barwienie aneksyną V, dodanie komórek NK i trastuzumabu do komórek JIMT-1 spowodowało śmierć komórek w sferoidach guza.

Komórki apoptotyczne apoptotyczne dodatnie pod względem aneksyny pojawiły się w strefie obwodowej sferoid. Jednak przy braku trastuzumabu komórki NK nie wyzwalały apoptozy komórek nowotworowych. Aby rozróżnić bezpośrednie lub zależne od ADCC skutki trastuzumabu, trastuzumab-Fab2 pozbawiony zdolności wiązania regionu FC zastosowano w tym badaniu jako kontrolę ujemną.

Ponieważ trastuzumab-Fab2 był nieskuteczny w tym modelu, śmierć komórek nowotworowych prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem ADCC. Co więcej, wstępne leczenie sunitynibem zmniejszyło barwienie aneksyny V w sferoidach, potwierdzając indukowaną przez sunitynib oporność ADCC i ujawniając zapobieganie apoptotycznej śmierci komórek w sferoidach JIMT-1 inkubowanych jednocześnie z komórkami NK i trastuzumabem. Dane te potwierdziły cytoprotekcyjne działanie sunitynibu w modelu ADCC i wymagają ostrożności w odniesieniu do potencjalnych połączeń immunoterapii opartych na ADCC i sunitynibu.

Podsumowując, nasz test HCS może być odpowiedni do identyfikacji związków zwiększających ADCC.