Name: Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji cytotoksyczności ADCC w sferoidach raka piersi z użyciem linii komórkowych NK92 i JIMT-1 oraz trastuzumabu. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunoterapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LV otrzymało dofinansowanie z grantów Krajowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 i K147482. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z Węgierskiej Sieci Badawczej HUN-REN. Komórki CD16.176V.NK-92 uzyskano od dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Filadelfia, PA, w imieniu Brink Biologics, lnc. San Diego, Kalifornia), są chronione patentami na całym świecie i były licencjonowane przez Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Autorzy są wdzięczni Györgyowi Verebowi i Árpádowi Szöőrowi za pomoc w wykorzystaniu linii komórkowej NK-92 i TR-F(ab')2 oraz za porady techniczne.

1. Konfiguracja modelu sferoidalnego białka fluorescencyjnego wzmocnionego JIMT-1 (EGFP)
<ol>
	<li>Aby utworzyć dno odpychające komórki w kształcie litery U, pokryj 96-dołkową płytkę 0,5% roztworem agarozy-PBS (30 μl/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez około 30-45 minut.</li>
	<li>Umyj komórki JIMT-1-EGFP dwukrotnie 2 ml sterylnego PBS (generacja linii komórkowej JIMT1-EGFP została opisana w poprzedniej publikacji17). Do hodowli komórkowej należy użyć kolb do hodowli tkankowych T25 i pożywki JIMT-1 (pożywka DMEM/F-12 uzupełniona 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,3 U/ml insuliny (100 IU / ml, Humulin R) i 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
	<li>Dodać 2 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować przez 10 minut w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 odczepiły się po czasie inkubacji.</li>
	<li>Użyj 2 ml pożywki JIMT-1, aby zatrzymać trawienie i zebrać zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki w komorze Bürkera za pomocą 0,4% błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek) i dostosuj liczbę komórek do 20 000 komórek/ml.</li>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl zawiesiny komórek (2000 komórek/basenik) do każdego dołka płytki 96-dołkowej (wstępnie pokrytej 0,5% roztworem agarozy-PBS, jak wskazano w 1.1).</li>
	<li>Pozostawić komórki do zbicia się w bryły podczas 3-dniowej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj rozmiar i kształt sferoid za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
</ol>
2. Powłoka płyty HCS
UWAGA: Aby zapobiec przyczepianiu się sferoid JIMT-1-EGFP do szklanej powierzchni płyty, kluczowe jest pokrycie płytki o wysokiej zawartości (HCS) (inaczej analiza wysokiej zawartości nie byłaby możliwa).
<ol>
	<li>W 3 dniu po indukcji sferoid pokryć 96-dołkową płytkę przesiewową o wysokiej zawartości Pluronic-F127 (0,5% w DMSO, 50 μL/basenik) i inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć studzienki pożywką wolną od surowicy DMEM/F-12 (100 μl/studzienkę).</li>
</ol>
3. Przeniesienie sferoid na płytkę HCS
<ol>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś sferoidy w trzech porcjach na 96-dołkową płytkę HCS ze szklanym dnem.</li>
</ol>
4. Wstępne traktowanie sferoid JIMT-1 EGFP związkami testowymi
<ol>
	<li>Dodać badany związek (np. sunitynib rozcieńczony w DMSO w stężeniu 40 μM) pipetując 10 μl/studzienkę i dodać 10 μl świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych (CTL).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze z użyciem CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Indukcja ADCC poprzez dodanie komórek efektorowych
UWAGA: Komórki CD16.176V.NK92 (zwane dalej komórkami NK) hodowano w α-MEM z dodatkiem 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pirogronianu, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 100 IU/ml IL-2.
<ol>
	<li>Zebrać komórki NK z kolby do probówki o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek) i dostosuj gęstość komórek do stosunku efektora do celu (E:T) 20:1 (40 000 komórek NK/dołek).</li>
	<li>Wybarwić komórki NK za pomocą 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL w 1 ml pożywki α-MEM NK) i umieścić je w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować komórki NK przy 150 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie, aby zmyć nadmiar barwnika 1 ml pożywki α-MEM.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek NK w 1 ml świeżej pożywki JIMT-1.</li>
	<li>Dodać barwione komórki NK wraz z przeciwciałem anty-HER2 (Ab) (trastuzumab, rozpuszczony w sterylnym destylowanymH2O) do docelowych sferoidów JIMT-1 przez pipetowanie 55 μl/studzienkę komórek NK barwionych CTB i 55 μl/studzienkę 10 μg/ml Ab w pożywce JIMT-1 (całkowita objętość leczenia dodanego do ADCC wynosi 110 μL/studzienkę, a końcowe stężenie sunitynibu wynosi 20 μM). 
	UWAGA: Przy wyborze stężenia Ab i stosunku E:T opieraliśmy się na naszej poprzedniej publikacji17. Przeprowadzono wstępne eksperymenty z różnymi stosunkami E:T i stężeniami trastuzumabu, aby ocenić, który z nich jest najbardziej skuteczny w indukowaniu ADCC w sferoidach (rysunek uzupełniający S1).</li>
	<li>Dodać 110 μl/studzienkę świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych (CTL).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Ponieważ wiadomo, że komórki NK92 odgrywają niespecyficzne funkcje cytotoksyczne, do kontroli należy stosować komórki JIMT-1 inkubowane zarówno z samymi komórkami NK, jak i z kontrolną izotypem lub F(ab')2 Ab. W tym przypadku F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')2) był używany jako ujemny CTL. Fragment TR-F(ab')2 przygotowano zgodnie z raportem Tóth et al.19 i dodano w tej samej objętości co trastuzumab wraz z komórkami NK, jak opisano w 5.5. Stężenie dostosowano do 6,6 μg/ml, co odpowiada stężeniu równomolowemu z Trastuzumab23.</li>
</ol>
6. Aneksyna V-647 barwienie sferoidów
<ol>
	<li>Aby zmierzyć apoptozę śmierci komórki, wybarwić sferoidy koniugatem Annexin V-Alexa Fluor 647 przez 1 godzinę w pożywce JIMT-1 (1:100), pipetując 50 μl / studzienkę.</li>
</ol>
7. Obrazowanie
UWAGA: Płyta jest obrazowana po 24 godzinach od dodania komórek efektorowych NK do komórek docelowych. Do obrazowania używany jest analizator wysokiej zawartości i oprogramowanie do analizy obrazu.
<ol>
	<li>Wybierz rodzaj mikropłytki z listy płytek za pomocą opcji Typ płytki. Użyj 96-dołkowej płytki przesiewowej o wysokiej zawartości (HCS).</li>
	<li>Wybierz autofokus z dwoma szczytami, ponieważ test jest przeprowadzany na płytkach z obiektywem 10x z aperturą numeryczną 0,3 (NA), korzystając odpowiednio z opcji autofokusa i obiektywu. Wybierz tryb konfokalny z opcją Opt. Mode i zastosuj Binning 2 za pomocą opcji Binning.</li>
	<li>W przypadku sferoid obrazowania wybierz odpowiednie kanały za pomocą opcji Wybór kanału. Do wykrywania komórek JIMT-1 transdukowanych przez EGFP należy wybrać EGFP (czas integracji 200 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 2,0 μm; np.: 488 nm em: 500-550 nm), a do wykrywania komórek apoptotycznych należy użyć Alexa 647 (czas integracji 100 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 10,0 μm; np.: 640 nm em: 650-760 nm). Aby zobrazować komórki NK w sferoidach, wybierz następujący kanał: DAPI (czas integracji 100 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 2,0 μm; np.: 405 nm em: 435-480 nm).</li>
	<li>W opcji Wybór układu wybierz stosy Z, ponieważ komórki w sferoidach zwykle znajdują się na różnych płaszczyznach ogniskowych mikroskopu. 10 płaszczyzn (o odległości 10 μm) wystarcza do pokrycia całego obszaru sferoidalnego. Ustaw wartości pierwszej i ostatniej płaszczyzny odpowiednio na 0 μm i 90 μm. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem pomiaru można wykonać przykładowe zdjęcia za pomocą funkcji migawki w celu sprawdzenia prawidłowych ustawień.</li>
	<li>Ustaw liczbę dołków i pól do obrazowania za pomocą opcji Zdefiniuj układ.</li>
</ol>
8. Analiza o wysokiej zawartości (HCA)
UWAGA: Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony lub eksportuj obrazy do analizy za pomocą preferowanego oprogramowania innej firmy. W celu analizy skuteczności ADCC mierzy się intensywność fluorescencji załącznika V 647. Komórki docelowe zabijane przez ADCC pojawiają się w obszarze peryferyjnym sferoid. Dlatego komórki dodatnie aneksyny V są mierzone w tym sferoidalnym "pierścieniu". W celu walidacji tej metody przeprowadzono analizy z różnymi parametrami, aby ocenić, która z nich jest najbardziej wiarygodna i daje najlepsze wyniki (rysunek uzupełniający S2). Na filmie pokazano studzienkę ADCC, aby krok po kroku zademonstrować proces analizy obrazu.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj sferoidy na podstawie fluorescencji EGFP komórek JIMT-1 za pomocą opcji Znajdź regiony tekstury i odfiltruj je według rozmiaru (> 25 000 μm2).</li>
	<li>Usuń obiekty obramowania za pomocą opcji Wybierz populację.</li>
	<li>Ponieważ komórki dodatnie (apoptotyczne) aneksyny V pojawiają się na obrzeżach sferoid, zmierz intensywność aneksyny w tym apoptotycznym "pierścieniu", wybranym przez opcję Wybierz region (granica zewnętrzna -90%), aby określić śmierć komórki apoptotycznej.</li>
	<li>Wartości intensywności załącznika V należy wyrazić jako średnie natężenie.</li>
</ol>

<ol><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+monitoring+of+drug+effects+in+a+3D+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model.</a> Front Oncol. 7, 293(2017).</li>
<li>Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+for+efficient+drug+discovery%3A+Progress+so+far+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926(2022).</li>
<li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744(2020).</li>
<li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).</li>
<li>Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+systems+for+exploring+cancer+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">3D culture systems for exploring cancer immunology.</a> Cancers (Basel). 13 (1), 56(2020).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Front Immunol. 11, 603640(2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+immunotherapy+for+breast+cancer%3A+Tumor+microenvironment%2C+nanotechnology+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315(2021).</li>
<li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors%3A+Biological+evidence+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).</li>
<li>Sun, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+preventions+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Risk factors and preventions of breast cancer.</a> Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).</li>
<li>Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+breast+cancer+incidence+predisposing+risk+factors+identification+using+nationwide+big+data%3A+A+matched+nested+case-control+study+in+taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan.</a> BMC Cancer. 22 (1), 849(2022).</li>
<li>Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+treatments%3A+Updates+and+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Breast cancer treatments: Updates and new challenges.</a> J Pers Med. 11 (8), 808(2021).</li>
<li>Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+development+of+immunotherapies+for+HER2%28%2B%29+breast+cancer%3A+A+review+of+HER2-directed+monoclonal+antibodies+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond.</a> NPJ Breast Cancer. 6, 10(2020).</li>
<li>Musolino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fcgamma+receptors+in+HER2-targeted+breast+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003171(2022).</li>
<li>Petricevic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+mediates+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+and+phagocytosis+to+the+same+extent+in+both+adjuvant+and+metastatic+HER2%2FNEU+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients.</a> J Transl Med. 11, 307(2013).</li>
<li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+Trastuzumab-mediated+ADCC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li>
<li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+decreases+the+number+of+circulating+and+disseminated+tumor+cells+despite+Trastuzumab+resistance+of+the+primary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor.</a> Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).</li>
<li>Toth, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+Trastuzumab+and+Pertuzumab+administered+at+approved+doses+may+delay+development+of+Trastuzumab+resistance+by+additively+enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.</a> MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).</li>
<li>Ehlers, F. aI., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADCC-inducing+antibody+Trastuzumab+and+selection+of+KIR-HLA+ligand+mismatched+donors+enhance+the+NK+cell+anti-breast+cancer+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3232(2021).</li>
<li>Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+culture+of+Her2%2B+breast+cancer+cells+promotes+AKT+to+MAPK+switching+and+a+loss+of+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response.</a> BMC Cancer. 16, 345(2016).</li>
<li>Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+of+Her2-positive+breast+adenocarcinoma+for+studying+anticancer+immunotoxins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro.</a> Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).</li>
<li>Selis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Trastuzumab+fragments+acquire+an+increased+in+vivo+stability+but+show+a+largely+reduced+affinity+for+the+target+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), 491(2016).</li>
<li>Johnston, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+application+for+cell-type+specific+behaviour+in+heterogeneous+primary+breast+epithelial+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 18(2016).</li>
<li>Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+analysis+of+breast+cancer+using+single-cell+deep+transfer+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).</li>
<li>Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+high-content-screening+applications+of+clonogenicity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer.</a> SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+Her2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Pomimo znacznej poprawy w leczeniu BC w ciągu ostatnich kilku dekad, pacjenci nadal regularnie rozwijają oporność na leki lub doświadczają negatywnych skutków ubocznych24. Wysoka zachorowalność i śmiertelność związane z BC wymagają ciągłych badań nad mechanizmami molekularnymi leżącymi u ich podstaw, a także solidnych platform przesiewowych w celu identyfikacji nowych cząsteczek, które mogą być przydatne w rozwoju terapeutycznym25. Strategie te wymagają testów translacyjnych opartych na hodowlach komórkowych. Systemy hodowli nowotworów 3D, takie jak sferoidy i organoidy nowotworowe, pojawiły się ostatnio jako tanie, łatwe do wdrożenia modele, które reprezentują kluczowe aspekty patofizjologii guza ściślej niż konwencjonalne hodowle jednowarstwowe. Jedną z tych cech jest przestrzennie skoordynowana interakcja między różnymi komórkami odpornościowymi związanymi z nowotworem a komórkami rakowymi. To sprawia, że modele 3D współkultur są doskonałymi narzędziami do badań przesiewowych leków ukierunkowanych na modulatory działające na komórki odpornościowe w celu leczenia nowotworów złośliwych26.
W tej pracy wprowadziliśmy nowy model sferoidalny dla zależnego od trastuzumabu ADCC zależnego od komórek NK przeciwko komórkom raka piersi JIMT-1 i opisaliśmy zautomatyzowany przepływ obrazowania i analizy w celu oceny zabijania komórek rakowych za pośrednictwem komórek NK. Procedura została wdrożona dla oprogramowania do obrazowania i analizy obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na monitorowanie istotnej z chorobą zdolności komórek NK do indukowania apoptozy komórek nowotworowych. Wcześniej zidentyfikowano wielocelowy inhibitor kinazy tyrozynowej Sunitynib jako związek indukujący oporność na ADCC zależny od trastuzumabu w komórkach JIMT-1 w testach hodowli komórkowych 2D. Sunitynib upośledza funkcję zabijania komórek NK i indukuje autofagię, regulację w dół ekspresji HER2 i zwiększa przyleganie komórek JIMT-117. W celu walidacji naszego procesu analizy sferoidalnej w celu identyfikacji związków, przetestowaliśmy sunitynib jako związek modelowy i wykazaliśmy, że może on znacznie utrudnić zdolność komórek NK do zabijania sferoid komórek rakowych, odtwarzając efekt, który wykazał w monowarstwie.
Nasza metoda jest prosta, obejmuje wzrost sferoidów na pokrytych agarozą 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych, jednorazowy transfer utworzonych sferoid do mikropłytki ze szklanym dnem odpowiedniej do zastosowań HCS i HCA, dodanie związków testowych i oddzielnie barwionych komórek NK aktywowanych do zabicia przez podanie trastuzumabu, jednoetapowe barwienie śmierci komórki oraz analiza mikroskopowa. Po rozpoczęciu kohodowli dwóch typów komórek i leczenia farmakologicznego nie stosuje się żadnych poważnych manipulacji w studzienkach, aby uniknąć naruszenia integralności sferoid. Wykonanie testu trwa tylko 4 dni. Powlekanie dna 96-dołkowych płytek do hodowli tkankowych 1% niskotopliwą agarozą w ramach procedury jest tanią alternatywą dla stosowania płytek o bardzo niskim naczepniku w celu zapobieżenia przyleganiu komórek JIMT-1 do powierzchni płytki i promowania spontanicznej organizacji komórek nowotworowych w sferoidy. Ponieważ przechwytywanie obrazu nie jest możliwe przez poduszkę agarozową i plastikową powierzchnię w kształcie litery U, sferoidy musiały zostać przeniesione do płytki obrazowej. Kluczowe znaczenie miała pasywacja szklanej powierzchni płytki HCS bioobojętnym środkiem powierzchniowo czynnym Pluronic-F127 przed przeniesieniem sferoidowym. Bez tego kroku sferoidy rozprzestrzeniają się na dnie studni, co utrudnia obrazowanie i analizę.
Ludzka linia komórek nowotworowych stabilnie eksprymująca EGFP została wykorzystana do tworzenia sferoid17. Genetycznie zakodowany marker zapewnia trwałą fluorescencję w całym protokole zamiast barwienia komórek. Nienadzorowana analiza tekstury sygnału EGFP stanowi podstawę do rozpoznania zwartego jądra sferoidów, które obejmuje całą sferoidę bez indukcji śmierci komórki. Po dodaniu komórek NK i indukowaniu ADCC wyraźny rozpad konturów stanowił czasami wyzwanie dla algorytmu analizy obrazu, aby nakreślić kontur sferoidy. Ponieważ komórki V-dodatnie aneksyny znajdowały się głównie na obrzeżach sferoid, problem ten został ominięty poprzez ocenę śmierci komórki w obwodowym obszarze pierścieniowym generowanym przez wbudowany moduł segmentacji obrazu w oprogramowaniu poprzez rozszerzenie dobrze zdefiniowanego rdzenia sferoidalnego. Czynnik ekspansji określający zewnętrzną granicę tego obszaru został wybrany tak, aby obejmował półcień umierających, rozdrobnionych i rozproszonych komórek we wszystkich przypadkach po wizualnym kuratorowaniu setek obrazów sferoidalnych. Określenie całkowitej fluorescencji obszaru pierścienia apoptotycznego w maksymalnych rzutach obrazów stosu Z przyniosło niższe błędy eksperymentalne i wyraźniejszy efekt ADCC niż pomiar całego obszaru sferoidalnego lub całego obszaru studzienki (rysunek uzupełniający S2). Do oznaczania komórek BC (EGFP) i wykrywania śmierci komórek (Alexa 647) wybrano znaczniki fluorescencyjne, aby wykluczyć potrzebę separacji kanałów. Zdecydowano się na odczyt punktu końcowego w oparciu o znakowanie fluorescencyjne dla eksponowanej fosfatydyloseryny, markera apoptotycznego, w przeciwieństwie do monitorowania spadku fluorescencji EGFP w celu określenia żywotności sferoidów w czasie, co może być inną opcją. Barwienie aneksyną pozwoliło na dokładniejszą i bardziej czułą identyfikację śmierci komórki. Zasadniczo możliwe jest ulepszenie obecnego jednowymiarowego podejścia do barwienia poprzez uzupełnienie go o dodatkowe, bardziej precyzyjne markery śmierci komórki, które mogą zidentyfikować modalność śmierci komórki (np. fluorescencyjne substraty kaspazy) i typ obumarłej komórki.
Metodę tę można zmienić przy minimalnych zmianach w celu zbadania innych typów efektorowych komórek odpornościowych (makrofagi, limfocyty T i komórki odpornościowe wykazujące ekspresję chimerycznego receptora antygenowego [CAR]) i cząsteczek aktywujących (np. cytokiny, interleukiny). Dążąc do prostoty, solidności i krótkiego czasu przetwarzania, nie wyczerpaliśmy możliwości, jakie HCA może zaoferować dla tego testu. Protokoły obrazowania i analizy są podatne na dodawanie kolejnych znaczników fluorescencyjnych. Test ten można dostosować do badania bardziej złożonych sferoid poprzez dodawanie różnych typów komórek i używanie multipleksowanych sond fluorescencyjnych do rozróżniania tych typów komórek i specyficznych markerów fluorescencyjnych w celu powiązania ich z trwającymi zdarzeniami komórkowymi 4,5. Protokół można dostosować do dowolnego imagera HC, a obrazy mogą być analizowane za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu zawierającego moduł analizy tekstury.
Kluczowym aspektem znaczenia tego protokołu jest wykorzystanie sferoid. W związku z tym należy wziąć pod uwagę szereg parametrów. Wiadomo, że komórki w hodowli 3D wykazują osłabioną odpowiedź na związki w porównaniu z komórkami hodowanymi w monowarstwach21,22. Zastosowanie hodowli komórkowych 2D nie pozwala przewidzieć efektywnego zakresu stężeń badanego czynnika w całym organizmie. Podczas tworzenia naszego modelu 3D przetestowaliśmy wyższe stężenia związków i współczynniki E:T niż te zgłoszone w 2D. Na przykład protokół został zoptymalizowany poprzez zwiększenie stosunku E:T z 2:1 stosowanego w naszym teście 2D ADCC17 do 20:1 dla sferoid nowotworowych. Uzasadnieniem tego może być fakt, że leki nie były w stanie skutecznie przeniknąć do rdzenia sferoid i wpływały głównie na komórki warstw zewnętrznych. Z drugiej strony, zwiększenie stężenia trastuzumabu nie zwiększyło dodatkowo odpowiedzi ADCC (rysunek uzupełniający S1). Ten wybór może się różnić w zależności od linii komórkowych i celu. W związku z tym interesujące byłoby przetestowanie tego protokołu na innych liniach komórkowych, np. linii komórkowej BC innej niż HER2, biorąc pod uwagę, że poziom ekspresji HER2 jest ważnym wyznacznikiem odpowiedzi ADCC20.
Podsumowując, nasza nowa metoda stanowi szybką i solidną platformę do analizy wpływu związków w trójwymiarowym modelu immunologiczno-nowotworowym, która może być wykorzystana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Podkreśla to znaczenie stosowania sferoid HER2+ BC i NK92. Komórki CD16 w dalszym doskonaleniu zrozumienia mechanizmów molekularnych trastuzumabu, dając tym samym możliwość przewidywania skuteczności zależnego od trastuzumabu ADCC w zakresie potencjału terapeutycznego in vivo27. Poszukiwanie nowych przeciwnowotworowych modulatorów immunologicznych może przynieść ogromne korzyści z tego testu. Metodę można rozszerzyć o spersonalizowane testy wrażliwości na chemoterapię kultur komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów. Wykazaliśmy, że tradycyjne kokultury 2D stosowane w testach zabijania komórek odpornościowych i ADCC można przekształcić w testy sferoidalne 3D, potencjalnie zwiększając ich znaczenie translacyjne.

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) są powszechnie stosowanymi modelami trójwymiarowymi (3D), które powstają w wyniku tendencji komórek adherentnych do agregacji i stanowią ważne narzędzie do uzyskania wglądu w mechanizmy biologii komórek nowotworowych. Mogą być one generowane z szerokiej gamy typów komórek za pomocą licznych technik, takich jak hodowle 3D w środowisku ciekłym oraz na rusztowaniach (scaffold-based)1. Ich główną zaletą w stosunku do monolayerowych modeli 2D jest to, że odwzorowują one główne cechy guzów in vivo , a mianowicie organizację strukturalną i hipoksję, naśladując biologiczne zachowanie komórek nowotworowych, zwłaszcza mechanizmy prowadzące do ucieczki terapeutycznej i oporności na leki2. Ponieważ zatem MCTS mogą poprawić przewidywalność toksyczności i wrażliwości na leki, są one szeroko wykorzystywane do badania nowotworów w 3D i mogą wspomóc opracowanie skutecznych leków na różne rodzaje raka3.
Aby badać jakąkolwiek chorobę, niezbędne są odpowiednie i wygodne modele. Tworzenie modeli do badań nad immunologią nowotworów jest trudne, ponieważ układ odpornościowy składa się z wielu typów komórek. Każdy typ komórek posiada kilka podtypów oraz szerokie spektrum stanów aktywacji. Te różne typy komórek odpornościowych oddziałują z komórkami nowotworowymi i innymi składnikami guza, co w ostateczności wpływa na przebieg choroby. Metody hodowli komórkowych 2D in vitro nie odtwarzają tych złożonych interakcji komórkowych, ponieważ brakuje im możliwości translacji i nie są one w stanie przewidzieć działania leku na poziomie systemowym (np. w tkankach)4,5. Co więcej, modele mysie również mają poważne ograniczenia ze względu na fundamentalne różnice między ludzkim a mysim układem odpornościowym. Systemy hodowli 3D mogą zatem wypełnić obecne luki w dostępnych modelach, zapewniając alternatywną metodę i poprawiając nasze zrozumienie immunologii nowotworów6. W szczególności modele sferoidów mogą być wykorzystywane do testowania immunoterapii, głównie w celu oceny skuteczności przesiewania leków i przeciwciał terapeutycznych w zwiększaniu infiltracji komórek odpornościowych oraz efektów przeciwnowotworowych przeciwko celom sferoidalnym7. Ponadto szeroko wykazano potencjał MCTS składających się z komórek w różnych stanach metabolicznych i proliferacyjnych do badania interakcji między komórkami zrębu (np. limfocytami, makrofagami, fibroblastami) a komórkami nowotworowymi oraz do opracowywania nowych strategii przeciwnowotworowych8. Zatem istnieje kluczowa potrzeba opracowania predykcyjnych i dokładnych platform w celu usprawnienia procesu testowania leków, z uwzględnieniem patofizjologii mikrośrodowiska guza.
Rak piersi (BC) jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet na całym świecie. Klasyfikacja kliniczna tej heterogennej choroby opiera się na obecności receptorów transmembrane, np. receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) (zbiorczo nazywanych receptorami hormonalnymi, HR), a także na nadekspresji lub amplifikacji białka/onkogenu receptora ludzkiego czynnika wzrostu naskórka 2 (HER2). Na podstawie immunohistochemicznej ekspresji tych receptorów powszechnie wyróżnia się cztery podtypy: luminalny A (HR+/HER2-), luminalny B (HR+/HER2+), HER2-dodatni (HR-/HER2+) oraz potrójnie ujemny rak piersi (HR-/HER2-). Grupa HER2+ stanowi 10-15% przypadków BC i charakteryzuje się wysoką ekspresją HER2 przy braku ER i PR, co wiąże się z gorszym rokowaniem w porównaniu do guzów luminalnych i wymaga zastosowania specyficznych leków skierowanych przeciwko białku HER2/neu9.
Rozwój raka piersi (BC) jest procesem wieloetapowym, a wczesna diagnoza jest niezbędna dla skutecznego leczenia tej choroby10. Jednak mimo niedawno wprowadzonych spersonalizowanych opcji leczenia raka piersi (np. terapii endokrynnych i przeciwciał anty-HER2), BC nadal stanowi wyzwanie dla onkologów. Podobnie jak chirurgia, chemioterapia i radioterapia, te spersonalizowane terapie mogą wywoływać poważne działania niepożądane, a pacjenci mogą rozwinąć oporność na te środki, co sprawia, że wyznaczenie najlepszej strategii jest długoterminowym wyzwaniem11,12. W związku z tym lepsze zrozumienie oddziaływań między guzem a jego mikrośrodowiskiem jest niezbędne i ma szansę wskazać nowe kierunki rozwoju innowacyjnych metod leczenia, które uwzględnią specyfikę różnych podtypów raka piersi13. W szerokiej populacji pacjentów z guzami wykazującymi ekspresję HER2 badana jest nowa fala immunoterapii, takich jak koniugaty przeciwciało-lek, adoptywna terapia limfocytami T, szczepionki oraz nowe przeciwciała monoklonalne (mAbs) skierowane przeciwko HER214.
Trastuzumab, na przykład, stanowi efektywną metodę leczenia HER2+ BC. W ramach swojego mechanizmu działania Trastuzumab pośredniczy w aktywnościach zależnych od receptorów fragmentu krystalizowalnego gamma (FcγR). Receptory FcγR różnią się powinowactwem do fragmentu Fc oraz rodzajem inicjowanej przez nie odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja FcγRIIIa (CD16A) na komórkach natural killer (NK) jest kluczowa dla pośredniczenia w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), natomiast pobudzenie FcγRIIa (CD32A) i FcγRIIIa na makrofagach indukuje fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP)15. Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że myszy pozbawione receptorów FcγRI (CD64) i FcγRIII (CD16) nie były w stanie zainicjować ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom specyficznym dla guza, co wskazuje, że ADCC jest prawdopodobnie głównym mechanizmem działania przeciwciała monoklonalnego Trastuzumab16.
Ponieważ komórki NK wykorzystują przeciwciała związane z komórkami nowotworowymi do niszczenia komórek rakowych poprzez ADCC, ekspresja receptorów Fc jest kluczowa dla skutecznego leczenia Trastuzumabem17 (Rysunek 1). Ponadto ich działanie jest efektywnie równoważone przez stymulację receptorów aktywujących i hamujących, np. receptorów KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptors)18.
<img alt="Interakcja komórki NK z komórką nowotworową za pośrednictwem receptora Fcγ w procesie ADCC; schemat komórkowy dla badania immunologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mechanizm ADCC w kontekście odpowiedzi przeciwnowotworowej. Receptor Fcγ komórki NK (natural killer) rozpoznaje region Fc przeciwciała, które uprzednio związało się z antygenem powierzchniowym komórki nowotworowej. Ta synapsa immunologiczna prowadzi do degranulacji komórki NK, która uwalnia mediatory cytotoksyczne, takie jak granzymy i perforyny. Cząsteczki te przyczyniają się do tworzenia porów w błonie komórkowej i aktywują szlaki apoptotyczne, powodując programowaną śmierć komórki docelowej (obraz utworzony za pomocą Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rozwój immunoterapii w przypadku raka piersi HER2+ stanowi ewoluującą dziedzinę. W tym kontekście należy wziąć pod uwagę interakcje między różnymi komponentami układu odpornościowego. Co więcej, w poprzednich publikacjach szeroko testowano terapie skojarzone, obejmujące wszystkie rodzaje tradycyjnych terapii, immunoterapii lub terapii komórkowych, w celu zidentyfikowania kombinacji o działaniu synergicznym19.
Kilka modeli 3D raka piersi z nadekspresją HER2 (HER2+ BC) było wcześniej wykorzystywanych w badaniach nad nowymi lekami. Na przykład Balalaeva i wsp. wykorzystali sferoidy SKBR-3 z nadekspresją HER2 do oceny cytotoksyczności immunotoksyny 4D5scFv-PE40 skierowanej przeciwko HER220. W innym badaniu opracowano system hodowli 3D HER2+ BC oparty na Matrigelu w celu pomiaru wzrostu komórek w odpowiedzi na Trastuzumab oraz leki endokrynne21. Badania te podkreślają znaczenie modeli sferoidów nowotworowych komórek rakowych z nadekspresją HER2 jako skutecznej strategii służącej do klinicznej poprawy odpowiedzi terapeutycznej22.
Nasza grupa zidentyfikowała wcześniej Sunitynib, wielocelowy inhibitor tyrozynowej kinazy, jako inhibitor zależnej od Trastuzumabu cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w komórkach raka piersi JIMT-1 HER2+ w teście hodowli 2D. Badanie wykazało, że Sunitynib indukuje autofagię i upośledza funkcję zabijania komórek NK, obniżając ekspresję HER2 i zwiększając przyleganie powierzchniowe komórek JIMT-117.
W niniejszej pracy opracowaliśmy nowy trójwymiarowy (3D) sferoidalny model ADCC (komórki NK.92.CD16+Trastuzumab+komórki nowotworowe JIMT-1-EGFP) do zastosowań w badaniach wysokoprzepustowych, a w celu walidacji powyższych wyników jako związku modelowego wykorzystano sunitinib. W pierwszej kolejności wygenerowaliśmy komórki JIMT-1 wykazujące ekspresję EGFP17, a następnie z tych komórek wyhodowaliśmy sferoidy. ADCC indukowano za pomocą komórek NK wraz z trastuzumabem, a sferoidy utrzymywano w hodowli w obecności lub w nieobecności badanych związków przez 24 h (Rysunek 2). Ilościowa ocena ADCC opiera się na detekcji apoptycznej śmierci komórek nowotworowych (barwienie aneksyną V) z wykorzystaniem systemu analizy wysokotreściowej (High-Content Analysis).
<img alt="Schemat procesu ADCC: komórka NK, interakcja z guzem, przeciwciało Trastuzumab, analiza tworzenia sferoidów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. ADCC w 3D systemie kokultury sferoidów. Nasze warunki eksperymentalne opierają się na systemie sferoidów 3D, który pozwala na dokładniejsze modelowanie mikrośrodowiska in vivo w porównaniu do modeli 2D. Komórki raka piersi JIMT-1 EGFP wysiano na wklęsłe dno odstraszające komórki, aby utworzyły okrągłe skupiska komórkowe, zwane sferoidami. Następnie zainicjowano ADCC poprzez dodanie komórek naturalnych zabójców NK92.CD16 (stosunek E:T = 20:1) oraz przeciwciała monoklonalnego anty-HER2, Trastuzumabu. Model eksperymentalny okazał się wydajny i łatwy w zastosowaniu do identyfikacji związków testowych modyfikujących ADCC (obraz utworzony za pomocą Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wykazaliśmy, że pozyskiwanie danych w ten sposób może odbywać się w czasie rzeczywistym i jest statystycznie wiarygodne do zastosowania w wysokoprzepustowych badaniach wysokotreściowych (high-content screening) w procesie odkrywania leków przeciwnowotworowych. Co istotne, model ten umożliwia rozszerzoną walidację większego zestawu związków i może być zastosowany w kilku interesujących badaniach.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowe szklane dno Nośnik komórek Ultra mikropłytki</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td>LLC</td><td>6055302 do pomiarów sferoid</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>TPP</td><td>92096</td><td>do wysiewu komórek</td></tr> <tr><td>i pożywki alfa-MEM</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>w pożywce NK</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>do wysiewu sferoid</td></tr><tr><td>Aneksyna V-Alexa Fluo 647 koniugat</td><td>Invitrogen-ThermoFisher Scientific</td><td>A23204</td><td>do pomiaru apoptozy za pomocą komórek HCS</td></tr><tr><td>CD16.176 V.NK-92</td><td>Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA w imieniu Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)</td><td>ATCC CRL-2407</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Cell Tracker Blue</td><td>Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)</td><td>C2110</td><td>do barwienia komórek NK</td></tr><tr><td>DMEM/ F-12 medium</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td>w podłożu JIMT1-EGFP</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>do powlekania płytki HCS przed przeniesieniem sferoid</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Biosurowica</td><td>FB-1090/500</td><td>JIMT-1-EGFP i pożywka NK</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>35,050– 061</td><td>w medium NK</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td>do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Harmony</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>dla HCA</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Proleukin, Novartis Hungá ria Kft., Budapeszt, Węgry</td><td>PHC0026</td><td>w pożywce NK</td></tr><tr><td>Insulina (Humulin R)</td><td>Eli Lilly</td><td>HI0219</td><td>JIMT-1-EGFP podłoże</td></tr><tr><td>JIMT-1 komórki</td><td></td><td></td> raka piersi <td>do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (MEM-NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11,140– 050</td><td>w pożywce NK</td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td>w pożywce NK</td></tr><tr><td>Sprzęt do analizy wysokiej zawartości Opera Phenix</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td>HH14001000</td><td>dla HCA</td></tr><tr><td>PBS (Posphate buforowana sól fizjologiczna)</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td>do płukania komórek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Biosura</td><td>LM-A4118</td><td>JIMT-1-EGFP i pożywka NK</td></tr><tr><td>pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP</td><td>Invitrogen, (Prof. Jó zsef T<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margines: auto; ">zsé r, Uniwersytet w Debreczynie)</td><td></td> <td>dla linii komórkowej JIMT-1-EGFP</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>do powlekania płytki HCS przed przeniesieniem sferoid</td></tr><tr><td>Jabłczan sunitynibu</td><td>SigmaAldrich</td><td>PZ0012</td><td>do leczenia</td></tr><tr><td>Trastuzumab Ab (humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2)</td><td>Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapeszt, Węgry</td><td>NDC-63459-303-43</td><td>do leczenia</td></tr><tr><td>Trastuzumab-F(ab')2</td><td>Dar od prof. Gyö rgy Vereb i Á rp&amp;aaostry; d Szö <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margines: auto; ">r </td><td>Wydział Biofizyki i Biologii Komórki, Uniwersytet w Debreczynie</td><td>do zabiegów</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4% roztwór</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1X w PBS</td><td>Biosura</td><td>LM-T1706</td><td>do odrywania komórek</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Immunoterapia oparta na przeciwciałach monoklonalnych, ukierunkowana na antygeny nowotworowe, jest teraz podstawą leczenia raka. Jednym z klinicznie istotnych mechanizmów działania przeciwciał jest cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w której przeciwciało wiąże się z komórkami nowotworowymi i angażuje komórkowy składnik układu odpornościowego, np. komórki NK (natural killer), w celu zabicia komórek nowotworowych. Skuteczność tych terapii można poprawić, identyfikując związki adiuwantowe, które zwiększają wrażliwość komórek nowotworowych lub siłę działania komórek odpornościowych. Ponadto nieodkryte interakcje lekowe u pacjentów z rakiem leczonych jednocześnie z powodu wcześniejszych schorzeń lub objawów związanych z rakiem mogą decydować o powodzeniu terapii przeciwciałami; Dlatego takie niepożądane interakcje z lekami muszą zostać wyeliminowane. Mając na uwadze te cele, stworzyliśmy model ADCC raka i opisaliśmy tutaj prosty protokół poszukiwania leków modulujących ADCC. Ponieważ modele 3D, takie jak sferoidy komórek rakowych, są lepsze od kultur 2D w przewidywaniu in vivo odpowiedzi nowotworów na terapie przeciwnowotworowe, sferoidalne kokultury komórek raka piersi HER2 + JIMT-1 z ekspresją EGFP i NK92. Linie komórkowe CD16 zostały utworzone i indukowane za pomocą trastuzumabu, przeciwciała monoklonalnego klinicznie zatwierdzonego przeciwko HER2-dodatniemu rakowi piersi. Sferoidy JIMT-1 pozwolono na tworzenie się w odpychających komórki 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U. W dniu 3 dodano komórki NK i trastuzumab. Sferoidy zostały następnie wybarwione aneksyną V-Alexa 647 w celu zmierzenia apoptotycznej śmierci komórki, którą określono ilościowo w strefie peryferowej sferoid za pomocą automatycznego mikroskopu. Przydatność naszego testu do identyfikacji cząsteczek modulujących ADCC została wykazana poprzez wykazanie, że Sunitinib, receptorowy inhibitor kinazy tyrozynowej zatwierdzony przez FDA przeciwko rakowi z przerzutami, prawie całkowicie znosi ADCC. Generowanie sferoid oraz potoki akwizycji i analizy obrazów są kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi pod kątem związków modulujących ADCC w sferoidach komórek nowotworowych.

Wygenerowano komórki JIMT-1 wykazujące ekspresję EGFP, a następnie z tych komórek wyhodowano sferoidy. W качестве związku testowego zastosowano sunitynib, ponieważ wcześniej wykazano, że wpływa on na przebieg ADCC17. Sferoidom pozwolono na agregację przez 72 h. W 3. dniu do sferoidów dodano 10 µg/mL trastuzumabu (lub ekimolarną dawkę 6,6 µg/mL TR-F(ab')219) oraz komórki NK (20:1) w obecności lub przy braku 20 µM sunitynibu (wstępna inkubacja przez 1 h), na łączny czas 24 h. Jako CTL wykorzystano same komórki JIMT-1 oraz komórki JIMT-1 współinkubowane z komórkami NK (20:1). Sferoidy barwiono Annexin V 647 przez 1 h w celu wykrycia apoptycznej śmierci komórek, a następnie obrazowano za pomocą analizatora High-Content Analyzer.
Jak wykazało barwienie aneksyną V, dodanie komórek NK wraz z Trastuzumabem do komórek JIMT-1 spowodowało śmierć komórek w sferoidach nowotworowych. Komórki aneksyna-dodatnie (apoptotyczne) pojawiły się w strefie obwodowej sferoidów, co widoczne jest na Ryc. 3A. Z kolei samo dodanie komórek NK nie spowodowało apoptozy komórek nowotworowych. Aby odróżnić zdolność Trastuzumabu do rekrutacji ADCC od jego bezpośredniego efektu biologicznego, jako kontrolę negatywną Trastuzumabu zastosowano TR-F(ab')2 pozbawiony funkcjonalnej zdolności wiązania FcR. Ponieważ wykazano, że TR-F(ab')2 jest nieskuteczny w tym modelu (Ryc. 3B), efekt ten jest prawdopodobnie zapośredniczony przez ADCC. Ponadto wstępne opracowanie Sunitinibem zmniejszyło barwienie aneksyną V w sferoidach, co potwierdza indukowaną Sunitinibem oporność na ADCC i wskazuje na zapobieganie apoptycznej śmierci komórek w sferoidach JIMT-1 współinkubowanych z komórkami NK i Trastuzumabem.
<img alt="Analiza modelu sferoidów 3D, wpływ efektorów ADCC, wykres intensywności Annexiny V 647, apoptoza komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Detekcja związków efektorowych ADCC w modelu sferoidów 3D. Sferoidy nowotworowe wygenerowano z komórek JIMT-1-EGFP. Po 3 dniach inkubacji sferoidy przeniesiono na płytkę HCS, uprzednio pokrytą Pluronic F-127 w celu zapobiegania adhezji komórek. Następnego dnia do dołków dodano 10 µg/mL Trastuzumabu (TR) (lub ekimolarny 6,6 µg/mL TR-F(ab')2 jako negatywną kontrolę CTL) oraz komórki NK92.CD16 (wcześniej barwione Cell Tracker Blue) (stosunek E:T wynoszący 20:1), w obecności lub przy braku 20 µM Sunitynibu (SUN). Jako kontrole CTL wykorzystano same sferoidy JIMT-1 oraz sferoidy JIMT-1 współinkubowane z komórkami NK (20:1). (A) Po 24 h inkubacji sferoidy barwiono Annexiną V 647 (kolor czerwony) przez 1 h w celu wizualizacji komórek apoptotycznych. (B) Wykonano zdjęcia 3 sferoidów na warunek, a następnie przeanalizowano intensywność fluorescencji Annexiny V 647 w obszarze peryferyjnym sferoidów (region pierścieniowy). Histogram przedstawia 4 niezależne eksperymenty (średnie±SEM). Dane przeanalizowano testem Kruskala-Wallisa, a następnie post-hoc testem Dunna (*p &lt; 0.05, #p &lt; 0.05, ns: brak istotności statystycznej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Dane te potwierdzają, że Sunitinib hamuje ADCC. Przewiduje się, że związki zwiększające ADCC zostaną zidentyfikowane w podobny sposób. Podsumowując, nasz test HCS może być odpowiedni do identyfikacji związków wpływających na ADCC.
Rysunek uzupełniający S1. Optymalizacja stosunku E:T oraz stężenia trastuzumabu. Do generowania sferoidów wykorzystano komórki JIMT-1-EGFP. W 3. dniu sferoidy przeniesiono na płytkę HCS i dodano komórki NK w różnych stosunkach E:T (20:1, 40:1 i 60:1) wraz z trastuzumabem (TR) w stężeniach 10, 20 i 50 µg/mL, aby sprawdzić, która metoda leczenia najskuteczniej indukuje śmierć komórek w sferoidach. Kontrolę (JIMT-1-EGFP) traktowano pożywką do hodowli komórek JIMT-1. (A) Po 24 h komórki barwiono przez 1 h za pomocą Annexin V 647 (kolor czerwony), a śmierć komórek wskutek apoptozy mierzono przy użyciu HCA. Histogramy przedstawiają wyniki 3 niezależnych eksperymentów (średnie±SEM). Słupki reprezentują intensywność barwienia Annexin V 647 wokół sferoidów JIMT-1. (B) Analizie intensywności Annexin V 647 w obszarze pierścienia poddano obrazy 3 sferoidów na warunek. Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA), a następnie testu post-hoc Tukeya (*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ns: brak istotności). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/Supplementary%20Figure%20S1..zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S2. Ocena apoptozy komórek JIMT-1 w sferoidach. Do generowania sferoidów wykorzystano komórki JIMT-1-EGFP. W 3. dniu sferoidy przeniesiono na płytkę HCS i poddano wstępnej inkubacji z 20 µM Sunitinib (SUN) przez 1 h, a następnie dodano komórki NK w stosunku E:T 20:1 wraz z 10 µg/mL Trastuzumab. Po 24 h komórki barwiono Annexin V 647 przez 1 h, a śmierć komórek apoptotycznych mierzono za pomocą HCA. Obrazy 3 sferoidów na warunek przeanalizowano pod kątem intensywności Annexin V 647 (kontrola: JIMT-1-EGFP, ADCC: komórki NK 20:1 + 10 µg/mL Trastuzumab, ADCC+SUN: 20 µM Sunitinib + komórki NK 20:1 + 10 µg/mL Trastuzumab). Kolumny reprezentują intensywność Annexin V 647 wokół sferoidów JIMT-1 (pierścień) (A), w całym sferoidzie (B) oraz w całym dołku (C). Histogramy przedstawiają 3 niezależne eksperymenty (średnie±SEM). Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya (*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ns: brak istotności statystycznej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/Supplementary%20Figure%20S2..zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Jedna z najskuteczniejszych celowanych terapii przeciwnowotworowych opiera się na przeciwciałach, takich jak przeciwciało anty-HER2 trastuzumab. Działanie przeciwnowotworowe trastuzumabu obejmuje zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową, ADCC, przez komórki NK lub komórki NK. Zrozumienie mechanizmów regulujących wrażliwość komórek nowotworowych na terapię przeciwciałami przeciwko receptorowi czynnika wzrostu, ze szczególnym uwzględnieniem ADCC, może mieć kluczowe znaczenie dla opracowania nowych, bardziej skutecznych metod leczenia.Modele 3D, takie jak sferoidy komórek rakowych, okazały się lepsze w przewidywaniu odpowiedzi immunologicznej nowotworów na różne terapie przeciwnowotworowe. Dlatego stworzyliśmy model sferoidalny ADCC przy użyciu linii komórkowej NK92 natural killer, komórek raka piersi JIMT-1 eksprymujących GFP i trastuzumabu. Stworzyliśmy system testowy ADCC, indukując anty-HER2-dodatnie komórki raka piersi JIMT-1 do tworzenia trójwymiarowych klastrów zwanych sferoidami.Linia komórkowa JIMT-1 użyta w eksperymentach stabilnie ulega ekspresji białka zielonej fluorescencji. Eksperyment rozpoczynamy od przygotowania 96-dołkowej płytki do tworzenia sferoid. Aby stworzyć dno w kształcie litery U i odpychające komórki, pokryj 96-dołkową płytkę roztworem 0,5% agarozy w PBS.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez około 30 do 45 minut. W międzyczasie trypsynizacja i liczenie komórek JIMT-1 do wysiewu komórek. Umyj komórki dwoma mililitrami sterylnego PBS.Dodaj dwa mililitry trypsyny-EDTA do kolby i umieść kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 minut. Po inkubacji postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 się odłączyły. Przerwij trawienie za pomocą dwóch mililitrów pożywki JIMT-1 i zbierz zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki.Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego w komorze Burkera i dostosuj liczbę komórek do 20 000 komórek na ml. Zasiej komórki na 96-dołkowej płytce, pipetując 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki w celu utworzenia sferoid. Pozwól komórkom zbić się razem podczas trzydniowej inkubacji w temperaturze 37 stopni w inkubatorze CO2.Regularnie sprawdzaj rozmiar i kształt sferoid za pomocą odwróconego mikroskopu. Trzeciego dnia po indukcji sferoid pokryj 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości roztworem Pluronic F-127 w DMSO. Powłoka ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia przywieraniu sferoid JIMT-1 EGFP do powierzchni szkła lub płyty.Po okresie inkubacji trwającym 45 minut w temperaturze pokojowej odessać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć studzienki pożywką niezawierającą surowicy DMEM F12. Przenieść sferoidy na 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości w trzech porcjach za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Dodać sunitynib do studzienek o stężeniu 40 mikromolowym w 10 mikrolitrach na studzienkę i odpipetować świeżą pożywkę JIMT-1 do studzienek kontrolnych w celu zwiększenia objętości.Inkubować płytkę przez godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni. Podczas gdy trwa inkubacja wstępnie potraktowanych sferoid, należy zebrać komórki NK92 z kolby do 15-mililitrowej probówki. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego w komorze Burkera i dostosuj liczbę komórek, aby osiągnąć stosunek efektora do celu 20 do 1.Wybarwić komórki NK 10-mikromolowym roztworem CellTracker Blue i umieścić je w inkubatorze CO2 na godzinę w temperaturze 37 stopni. Aby zmyć nadmiar barwnika, należy dwukrotnie odwirować komórki NK w temperaturze 150 RCF przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki na świeżym nośniku JIMT-1.Dodaj wybarwione komórki NK do docelowych sferoid JIMT-1 EGFP, pipetując 55 mikrolitrów na studzienkę wraz z przeciwciałem anty-HER2 trastuzumabem. Rozcieńczyć trastuzumab w pożywce JIMT-1 do stężenia 10 mikrogramów na ml. Dodaj 110 mikrolitrów świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych i inkubuj płytkę przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni.W rezultacie całkowita objętość leczenia dodanego do ADCC wynosi 110 mikrolitrów, a końcowe stężenie sunitynibu wynosi 20 mikromoli na litr. Aby wykryć i zmierzyć apoptozę śmierci komórki po zabiegach, wybarwić sferoidy koniugatem Annexin V Alexa Fluor 647 przez jedną godzinę w pożywce JIMT-1. Po zakończeniu etapów eksperymentalnych przenieś płytkę do urządzenia do analizy o wysokiej zawartości.Płytka jest obrazowana 24 godziny po dodaniu czynników NK do komórek docelowych. Do obrazowania używamy analizatora o wysokiej zawartości i oprogramowania do analizy obrazu. Wybierz typ mikropłytki z listy płytek za pomocą opcji Typ płytki.Użyj 96-dołkowej płytki sitowej o wysokiej zawartości. Wybierz dwa szczytowe autofokusy, jak testy przeprowadzane na płytkach z obiektywem 10x i aperturą numeryczną 0,3, korzystając odpowiednio z opcji autofokusa i obiektywu. Wybierz tryb konfokalny z opcją OptiMode i zastosuj Binning 2 do opcji Binning.W przypadku sferoid obrazowania wybierz odpowiednie kanały za pomocą opcji Wybór kanału. Aby wykryć komórki JIMT-1 przetoczone przez EGFP, wybierz EGFP z 200-milisekundowym czasem integracji, 50% mocą lasera, dwumikrometrową wysokością stosu, wzbudzeniem 488 nanometrów i długościami fal emisji 500, 550 nanometrów. Aby wykryć komórki apoptotyczne, użyj Alexa 647 z czasem integracji 100 milisekund, 50% mocą lasera, 10-mikrometrową wysokością stosu, wzbudzeniem 640 nanometrów, długościami fal emisji 650, 760 nanometrów.Aby zobrazować komórki NK w sferoidach, wybierz następujący kanał: DAPI z czasem integracji 100 milisekund, 50% mocą lasera, wysokością stosu wynoszącą dwa mikrometry, wzbudzeniem 405 nanometrów i długością fali emisji 435 418 nanometrów. W opcji Wybór układu wybierz stosy Z, ponieważ komórki w sferoidach zwykle znajdują się na różnych płaszczyznach ogniskowych mikroskopu. 10 płaszczyzn o odległości 10 mikrometrów wystarcza do pokrycia całego obszaru sferoidalnego.Ustaw wartości pierwszej i ostatniej płaszczyzny odpowiednio na 0 mikrometrów i 90 mikrometrów. Przed rozpoczęciem pomiaru można wykonać przykładowe obrazy za pomocą funkcji Snapshot w celu sprawdzenia poprawności ustawień. Ustaw liczbę dołków i pól do obrazowania za pomocą opcji Zdefiniowany układ.Zidentyfikuj sferoidy za pomocą komórek fluorescencyjnych EGFP lub JIMT-1 za pomocą opcji Obszar drobnej tekstury i odfiltruj je według rozmiaru. Usuń obiekty obramowania przy użyciu modułu Wybierz populację. Ponieważ komórki dodatnie aneksyny pojawiają się na sferoidach obwodowych, zmierz intensywność aneksyny w pierścieniu apoptotycznym.W module Select Region (Wybierz region) ustaw obramowanie zewnętrzne na wartość minus 90. Wartości intensywności aneksyny należy wyrazić jako średnią intensywność. Jak wskazuje barwienie aneksyną V, dodanie komórek NK i trastuzumabu do komórek JIMT-1 spowodowało śmierć komórek w sferoidach guza.Komórki apoptotyczne apoptotyczne dodatnie pod względem aneksyny pojawiły się w strefie obwodowej sferoid. Jednak przy braku trastuzumabu komórki NK nie wyzwalały apoptozy komórek nowotworowych. Aby rozróżnić bezpośrednie lub zależne od ADCC skutki trastuzumabu, trastuzumab-Fab2 pozbawiony zdolności wiązania regionu FC zastosowano w tym badaniu jako kontrolę ujemną.Ponieważ trastuzumab-Fab2 był nieskuteczny w tym modelu, śmierć komórek nowotworowych prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem ADCC. Co więcej, wstępne leczenie sunitynibem zmniejszyło barwienie aneksyny V w sferoidach, potwierdzając indukowaną przez sunitynib oporność ADCC i ujawniając zapobieganie apoptotycznej śmierci komórek w sferoidach JIMT-1 inkubowanych jednocześnie z komórkami NK i trastuzumabem. Dane te potwierdziły cytoprotekcyjne działanie sunitynibu w modelu ADCC i wymagają ostrożności w odniesieniu do potencjalnych połączeń immunoterapii opartych na ADCC i sunitynibu.Podsumowując, nasz test HCS może być odpowiedni do identyfikacji związków zwiększających ADCC.

quantifying-antibody-dependent-cellular-cytotoxicity-tumor-spheroid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje test in vitro oceniający cytotoksyczne działanie limfocytów CAR T na sferoidy guza 3D wyrażające białka fluorescencyjne. W tej ocenie wykorzystuje się czerwoną sondę fluorescencyjną Annexin V, która wiąże się z odsłoniętymi resztami fosfatydyloseryny na zewnętrznym płatku apoptotycznych komórek rakowych po interakcjach z komórkami CAR T. Czerwona fluorescencja emitowana przez sondę pomaga w odróżnieniu tych komórek od zdrowych emitujących zieloną fluorescencję.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności limfocytów CAR T wobec sferoid nowotworowych

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Poznaj metodę kwantyfikacji cytotoksyczności ADCC w sferoidach raka piersi z użyciem linii komórkowych NK92 i JIMT-1 oraz trastuzumabu. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunoterapii przeciwnowotworowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Przeglądaj więcej filmów