Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii
23 lutego 2024
Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.
Transkryptomika pozwala nam dogłębnie zrozumieć program komórkowy i jego reakcję na zmiany zewnętrzne. Jednak pomimo znacznego zmniejszenia kosztów produkcji bibliotecznej i sekwencjonowania w ciągu ostatnich dziesięcioleci, zastosowanie tej technologii na skalę potrzebną do badań przesiewowych leków jest nadal nieosiągalne, co ogranicza ogromny potencjał tych metod. W naszym badaniu przedstawiono efektywny kosztowo system badań przesiewowych leków na podstawie transkrypcji.
Połączenie zminiaturyzowanych kultur perturbacyjnych z transkryptomiką minirobaków. Zoptymalizowany protokół dotyczący minibugów zapewnia informacyjny sygnał biologiczny przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek. Jedną z kluczowych korzyści płynących z połączenia transkryptomiki z bezstronnymi badaniami przesiewowymi leków jest możliwość identyfikacji nowych celów leków, które wcześniej nie były brane pod uwagę.
Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków często koncentrują się na ustalonych cząsteczkach docelowych lub szlakach, co utrudnia identyfikację nowych celów i potencjalnie prowadzi do powstania leków o nieprzewidzianych skutkach ubocznych i ograniczonej skuteczności. Na początek rozmrozić fiolkę kriowizyjną PBMC w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, delikatnie ją odwracając. Następnie przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.
Przepłucz kriokulę jednym mililitrem ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej i dodaj roztwór kroplami do komórek w stożkowej probówce, aby wykonać pierwszy etap rozcieńczania. Teraz odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut i płynnie przechyl stożkową rurkę, aby usunąć supernatant. Ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej.
Do liczenia komórek wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą 10 mikrolitrów barwionego roztworu komórkowego, za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory komórkowej. Użyj ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej, aby rozcieńczyć komórki, aby osiągnąć końcowe stężenie od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr.
Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dodaj 100 mikrolitrów dwukrotnie rozcieńczonego leku do każdej studzienki. Aby zebrać komórki, odwiruj płytkę do hodowli komórkowej przez 10 minut.
Użyj pompy próżniowej, aby usunąć supernatant, umieszczając końcówkę pompy w dolnym rogu studzienki, aby zatrzymać komórki. Teraz dodaj 200 mikrolitrów lodowatego PBS do każdej studzienki. Po odwirowaniu płytki przez pięć minut usunąć supernatant.
Następnie dodaj 15 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki. Za pomocą samoprzylepnej folii uszczelniającej uszczelnij płytę, aby zabezpieczyć ją przed zanieczyszczeniem. Zwiruj płytkę i odwiruj ją przez jedną minutę.
Na koniec zbierz sześć mikrolitrów roztworu zlizowanych komórek na płytce do PCR. Na początek zbierz PBMC traktowane lekiem przez odwirowanie i zbierz lizat komórkowy na płytce PCR. Odwiruj płytkę, aby zebrać lizat na dnie.
Następnie należy przeprowadzić denaturację mRNA za pomocą termocyklera. Następnie dodaj sześć mikrolitrów mieszaniny reakcji odwrotnej transkryptazy do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 12 mikrolitrów. Uszczelnij płytę, aby chronić przed zanieczyszczeniem i zapobiec parowaniu.
Odwirować płytkę po krótkim zawirowaniu. Umieść płytkę na termocyklerze i rozpocznij program reakcji odwrotnej transkrypcji. Po odwrotnej transkrypcji odwirować płytkę PCR, dodać 15 mikrolitrów mieszanki do wstępnej amplifikacji do każdej studzienki i zamknąć.
Umieść szczelną płytkę na termocyklerze i rozpocznij reakcję wstępnego amplifikacji. Aby oczyścić CDNA, dodaj magnetyczne kulki oczyszczające do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym na pięć minut lub do momentu, gdy kulki się rozdzielą.
Następnie ostrożnie usuń supernatant. Trzymając talerz na stojaku magnetycznym, delikatnie wprowadź 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby oczyścić koraliki. Po 30-sekundowej inkubacji użyj pipety, aby wyeliminować supernatant.
Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu na stojaku magnetycznym przez pięć minut lub do momentu, gdy etanol całkowicie odparuje, a kulki przestaną być błyszczące. Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego ponownie zawieś koraliki w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym, aż koraliki zostaną oddzielone.
Przenieść eluetę na świeżą płytkę PCR przygotowaną do kontroli jakości CDNA i znakowania. W celu znakowania dodać trzy mikrolitry mieszaniny znakującej dla każdej reakcji na nową płytkę PCR. Dodaj jeden mikrolitr CDNA do każdej reakcji.
Natychmiast rozpocznij reakcję tagowania. Następnie zneutralizuj reakcję, dodając jeden mikrolitr zneutralizowanego buforu znakującego do każdej reakcji. W przypadku PCR wzbogacającego dodać dziewięć mikrolitrów mieszanki PCR do każdej reakcji, aby uzyskać całkowitą objętość 14 mikrolitrów.
Uruchom program PCR wzbogacający. Aby rozpocząć, połącz unikatowo indeksowane biblioteki w stosunku równomolowym. Zmierz stężenie końcowej puli za pomocą testu o wysokiej czułości, aby obliczyć molowość próbki za pomocą tego równania.
Teraz załaduj komórkę przepływową zgodnie ze specyfikacją przyrządu i dowolną optymalizacją eksperymentalną. Wybierz sekwencję na ekranie, aby rozpocząć konfigurację uruchamiania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować sekwencję komórek przepływowych za pomocą wkładu do syntezy, wkładu klastrującego i wkładu buforowego.
Po rozpoznaniu wszystkich odczynników przez sprzęt dodaj nazwę przebiegu w ustawieniach przebiegu. Określ szczegóły sekwencjonowania jako parę do końca, przy czym oba odczyty mają długość 51 par podstaw. Dodatkowo sekwencja dwóch odczytów indeksu po osiem par zasad każda.
Określ katalog wyjściowy do przechowywania danych i dotknij Przejrzyj. Po sprawdzeniu poprawności wszystkich parametrów sekwencjonowania wybierz opcję Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć sekwencjonowanie.
Przegląd
To badanie prezentuje opłacalny przepływ pracy do przesiewowego badania leków opartego na transkryptomie, wykorzystujący hodowle komórek ex vivo lub in vitro. Innowacyjny protokół minibug łączy miniaturyzowane hodowle pertubacyjne z zaawansowanymi badaniami transkryptomu, aby skutecznie identyfikować nowe cele leków.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Transkryptyka
- Przesiewowe badanie leków
- Techniki hodowania komórek
Tło
- Transkryptyka wspiera wgląd w reakcje komórkowe na warunki zewnętrzne.
- Konwencjonalne przesiewowe badanie leków często pomija nowe cele leków.
- Koszty i złożoność utrudniają szerokie zastosowanie transkryptomu w odkrywaniu leków.
Stosowane metody
- Wykorzystanie PBMC (komórek jednojądrowych krwi obwodowej) do eksperymentów
- Miniaturyzowane techniki rozcieńczania leków
- Zaawansowane protokoły sekwencjonowania i analizy
Główne wyniki
- Protokół minibug daje cenne sygnały biologiczne przy niższej głębokości sekwencjonowania.
- Zidentyfikowano potencjalne nowe cele leków poza znanymi cząsteczkami.
- Ułatwiono rozległe przesiewowe badanie znanych leków i nowych związków.
Wnioski
- Badanie ustanawia przepływ pracy, który promuje łatwiejsze identyfikowanie nowych celów leków.
- Podkreśla znaczenie integracji transkryptomu we współczesnych badaniach biologicznych i odkrywaniu leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Transcriptomic-based drug screening offers a scalable solution for unbiased identification of drug-induced cellular responses, addressing the limitations of conventional target-focused approaches. The mini-bulk protocol enables high-throughput, cost-efficient transcriptome profiling, supporting early discovery and lead identification across diverse compound libraries. This workflow enhances predictive confidence and portfolio triage by revealing novel mechanisms and off-target effects at scale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of cellular pathways in response to drug perturbations.
- Supports identification of novel drug targets beyond established pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by capturing unbiased transcriptomic signatures.
- Improves predictive confidence for target engagement and downstream effects.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for high-throughput transcriptomic screening.
- Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for compound evaluation.
- Supports assay standardization and scalability to hundreds of conditions per run.
- Enables reliable comparison of known and novel molecules across diverse conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic readouts with disease-relevant cellular models when PBMCs or other primary cells are used.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation by linking molecular signatures to phenotypic outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on unbiased molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical assessment, enabling scalable, unbiased drug response profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring transcriptomic changes after drug treatment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible gene expression data for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs for statistical comparison of drug effects across multiple conditions.
- Translational Research: Connects molecular signatures to disease-relevant models, supporting biomarker discovery when applicable.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for repeated use across diverse drug discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and miniaturizes transcriptomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting large-scale, unbiased screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates based on robust molecular data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transcriptomics, cell culture, and sequencing technologies.
- Needs access to high-throughput sequencing platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Adaptable to various cell types and drug conditions with protocol optimization.
- Sample throughput and incubation time variability must be managed for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:08
Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing
3:01
cDNA Library Preparation from the Drug Treated‐Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing
5:31
mRNA Sequencing to Understand the Cellular Effect of Drug Treatment
