Name: Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj ekonomiczny protokół minibug do przesiewowego badania leków oparty na transkryptomii komórek PBMC. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych celów lekowych przy zmniejszonej głębokości sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.S. jest wspierany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości (EXC2151-390873048), a także w ramach SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammacja, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, finansowany przez BMBF projekt doskonałości Dieta-Ciało-Mózg (DietBB); oraz projekt unijny SYSCID w ramach grantu nr 733100. M.B. jest obsługiwany przez DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. jest wspierany przez DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Numer projektu 513977171) oraz niemiecką strategię doskonałości (EXC2151-390873048). Obrazy utworzone za pomocą BioRender.com.

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi lokalnych komisji etycznych Uniwersytetu w Bonn.
1. Przygotowanie buforów, roztworów i sprzętu
<ol>
	<li>Przygotować roztwory i zgromadzić materiały opisane w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Rozgrzać łaźnię wodną do 37 °C i ogrzać pełną pożywkę wzrostową (RPMI-1640 + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny).</li>
	<li>Do zbioru komórek należy użyć lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
	UWAGA: Podczas pracy z komórkami należy zachować czystość otoczenia w celu utrzymania sterylności.</li>
</ol>
2. Obsługa komórek
UWAGA: Szczegółowy protokół kriozachowywania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej znajduje się w 7.
<ol>
	<li>Rozmrażanie i liczenie komórek
	<ol>
		<li>Wyjmij kriotubule z ciekłego azotu i rozmrażaj je w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 min, delikatnie odwracając probówki.</li>
		<li>Przenieś rozmrożone komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Przepłucz kriotubulę 1 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej i dodaj ten roztwór kroplami do komórek w probówce (1st etap rozcieńczania).</li>
		<li>Powtarzaj rozcieńczanie 1:1, aż do osiągnięcia objętości 32 mL (łącznie 5 rozcieńczeń z odpowiednio 1, 2, 4, 8 i 16 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej). Dodawaj pożywkę kroplami, aby zminimalizować wytrząsanie komórek, lekko agitując probówkę stożkową.</li>
		<li>Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min (300 x g, 20 °C) i usuń supernatant, delikatnie przechylając probówkę stożkową jednym płynnym ruchem.</li>
		<li>Resuspenduj komórki w 3 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej i przystąp do liczenia komórek.</li>
		<li>W celu liczenia zmieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z Trypan Blue (rozcieńczenie od 1:2 do 1:10 w zależności od gęstości zawiesiny komórkowej), aby odróżnić komórki żywe od martwych podczas liczenia. Komórki martwe lub uszkodzone będą miały kolor niebieski ze względu na pobranie barwnika, natomiast komórki żywe nie zostaną zabarwione. 
		UWAGA: Trypan Blue jest lekko cytotoksyczny, zabarwione komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż przez 5 min.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory liczbowej, wykorzystując 10 µL zabarwionego roztworu komórek.
		<ol>
			<li>Przy użyciu ulepszonej komory Neubauera policz wszystkie komórki w czterech dużych kwadratach znajdujących się w narożnikach i zastosuj poniższe równanie, aby obliczyć stężenie zawiesiny komórkowej. 
			<img alt="Równanie równowagi statycznej, wzór na liczbę komórek; obliczenia dla analizy rozcieńczenia i stężenia." src="/files/ftp_upload/65930/65930eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozcieńcz komórki do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/mL za pomocą ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej. Odwiruj tylko wtedy, gdy wymagana objętość jest mniejsza niż 3 mL, a następnie resuspenduj osad komórkowy do odpowiedniej objętości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew i traktowanie komórek
	<ol>
		<li>Wysiej 100 µL zawiesiny komórkowej na dołek w 96-dołkowej płytce do hodowli komórek (1 x 105 komórek / dołek). 
		UWAGA: Liczba komórek do wysiewu została zoptymalizowana dla kultur PBMC. Podczas gdy niskie stężenia komórek nie dostarczą wystarczającej ilości RNA do sekwencjonowania, nadmierna liczba komórek zwiększy ryzyko suboptimalnej lizy komórek i inhibicji reakcji odwrotnej transkrypcji.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenia leku o stężeniu dwukrotnie większym niż stężenie stosowane podczas traktowania (2x). Wybierz rozpuszczalnik zgodnie z rozpuszczalnością związku, najlepiej pełną pożywkę wzrostową. 
		UWAGA: Można stosować PBS lub dimetylosulfotlenek (DMSO), jeśli w inny sposób nie uda się osiągnąć wystarczającej rozpuszczalności. Maksymalne stężenie DMSO w końcowej objętości inkubacji nie powinno przekraczać 0,5 %, aby zapobiec cytotoksyczności indukowanej przez rozpuszczalnik.</li>
		<li>Dodaj 100 µL 2-krotnego rozcieńczenia leku (stężenie końcowe w dołku 1X) i inkubuj w 37 °C przez określony czas. 
		UWAGA: Należy przeprowadzić badania uzupełniające w celu ustalenia optymalnego czasu inkubacji leku i wykluczenia potencjalnych mechanizmów cytotoksyczności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór i liza komórek
	<ol>
		<li>Odwiruj płytkę do hodowli komórek przez 10 min (300 x g, 20 °C). Delikatnie usuń supernatant za pomocą pompy próżniowej, trzymając płytkę pod kątem (30°-45°) i kierując końcówkę w stronę dolnego narożnika dołka, aby usunąć jak najmniej komórek.</li>
		<li>Przemyj komórki, dodając 200 µL lodowatego PBS do każdego dołka i odwiruj płytkę przez 5 min (300 x g, 4 °C). Usuń supernatant za pomocą pompy próżniowej, ponownie trzymając płytkę pod dużym kątem, aby usunąć jak najwięcej PBS.</li>
		<li>Przygotuj bufor do lizy zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla wymaganej liczby reakcji (rxn), dodając 10% zapasu.</li>
		<li>Dodaj 15 µL buforu do lizy do każdego dołka i szczelnie zamknij płytkę folią uszczelniającą, aby chronić próbki przed kontaminacją. Wymieszaj płytkę w wortexie przed odwirowaniem przez 1 min (1000 x g, 4 °C) i inkubuj przez 5 min na lodzie.</li>
		<li>Zabierz 6 µL roztworu lizowanych komórek do płytki PCR i krótko zamroź lizat komórkowy w -80 °C, aby zapewnić optymalną lizę komórek. Pamiętaj, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania płytek. 
		UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Jeśli produkcja cDNA nie jest przeprowadzana bezpośrednio po tym etapie, lizat komórkowy można przechowywać w -80 °C przez kilka miesięcy bez znacznego spadku jakości RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania
<ol>
	<li>Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT) 
	UWAGA: Podczas pracy z RNA wszystkie próbki należy trzymać na lodzie i używać sprzętu wolnego od nukleaz (sterylnych, jednorazowych wyrobów plastikowych) oraz wody wolnej od nukleaz.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do reakcji RT zgodnie z Tabelą 2 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. Krótko wymieszać mieszaninę wirówkami (vortex) i krótko odwirCować. Mieszaninę przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
		<li>Rozmrozić lizat komórkowy w temperaturze pokojowej (RT) i krótko odwirować, aby zebrać cały lizat na dnie płytki.</li>
		<li>Przeprowadzić denaturację mRNA w termocyklerze zgodnie z Tabelą 3.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z termocyklera i krótko odwirować, aby zebrać potencjalny kondensat. Do każdej studni dodać 6 µL mieszaniny do reakcji RT, tak aby uzyskać końcową objętość 12 µL. Zamknąć płytkę, aby ją zabezpieczyć i uniknąć parowania, wymieszać wirówką i odwirować.</li>
		<li>Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić program reakcji RT zgodnie z Tabelą 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preamplifikacja
	<ol>
		<li>Rozmrozić polimerazę DNA o wysokiej wierności oraz starter do PCR in-situ (ISPCR) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do preamplifikacji zgodnie z Tabelą 4 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. Krótko wymieszać mieszaninę wirówkami i odwirować. 
		UWAGA: Mieszanina enzymatyczna jest stabilna w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.</li>
		<li>Odwirować płytkę PCR, dodać 15 µL mieszaniny do preamplifikacji do każdej studni i zamknąć płytkę.</li>
		<li>Umieścić ją w termocyklerze i uruchomić reakcję preamplifikacji zgodnie z Tabelą 5.
		<ol>
			<li>Dostosować liczbę cykli do zawartości RNA. Zacząć od mniejszej liczby i zwiększać ją, jeśli wydajność cDNA jest niewystarczająca. 
			UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że optymalną liczbę cykli należy ustalić dla każdego typu komórek; warunki eksperymentalne i traktowanie nie wpływają na optymalną liczbę cykli. Dlatego zalecamy eksperymentalne ustalenie optymalnej liczby cykli przy wdrażaniu tego protokołu dla nowego typu komórek. Generalnie komórki pierwotne wymagają większej liczby cykli w porównaniu do linii komórkowych. PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt preamplifikacji można przechowywać w temperaturze - 20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie cDNA i kontrola jakości (QC) 
	UWAGA: Oczyszczanie próbek można przeprowadzać sekwencyjnie dla każdej płytki, ponieważ próbki są na tym etapie dość stabilne. Zwiększenie liczby próbek wydłuży czas trwania protokołu, ale nie ograniczy liczby próbek, które można przetwarzać jednocześnie.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem doprowadzić magnetyczne kulki do oczyszczania do temperatury pokojowej i mieszać w wirówce z wysoką prędkością przez 1 min, aby w pełni resuspendować kulki.</li>
		<li>Dodać 0,8x v/v (20 µL) magnetycznych kulek do oczyszczania do każdej studni i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić płytkę PCR na statywie magnetycznym na 5 min, aż kulki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Trzymając płytkę na statywie magnetycznym, delikatnie dodać 100 µL świeżo przygotowanego 80% etanolu w celu przemycia kulek i inkubować przez 30 s. Użyć pipety o małej objętości do usunięcia supernatantu. Powtórzyć krok dla dodatkowego etapu płukania. Należy upewnić się, że usunięto jak najwięcej etanolu.</li>
		<li>Suszyć kulki na powietrzu na statywie magnetycznym w temperaturze pokojowej do 5 min, aż etanol całkowicie odparuje, a kulki przestaną być błyszczące.</li>
		<li>Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego, resuspendować kulki w 20 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 2 min.</li>
		<li>Ponownie umieścić płytkę na statywie magnetycznym, aż kulki się oddzielą.</li>
		<li>Przenieść eluat do nowej płytki PCR w celu kontroli jakości cDNA i tagmentacji.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę za pomocą TapeStation lub FragmentAnalyser, aby ocenić rozkład wielkości i stężenie biblioteki cDNA (Zalecany test: TapeStation D5000). Szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta. Przewidywana typowa wydajność to 20 ng.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tagmentacja z użyciem zestawu 
	UWAGA: Jeśli istnieją już opracowane inne protokoły tagmentacji, można ich użyć.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć cDNA do końcowego stężenia 150 - 300 pg/µL, używając wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Zaprogramować termocykler zgodnie z Tabelą 6, aby zapewnić natychmiastowy start reakcji tagmentacji po dodaniu cDNA do mieszaniny enzymatycznej.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do tagmentacji zgodnie z Tabelą 7 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru.</li>
		<li>Napiować 3 µL mieszaniny do tagmentacji na jedną reakcję do nowej płytki PCR i dodać 1 µL cDNA do każdej reakcji.</li>
		<li>Uruchomić reakcję tagmentacji natychmiast po dodaniu cDNA.</li>
		<li>Dezaktywować reakcję, dodając 1 µL buforu neutralizującego tagment (NT; alternatywnie można użyć 0,2% dodecylu siarczanu sodu (SDS)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR wzbogacający
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do PCR wzbogacającego zgodnie z Tabelą 7 dla odpowiedniej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. (Zalecany: zestaw Nextera UDI w celu zapobiegania zjawisku index hopping na przepływach wzorowanych (np. Illumina NovaSeq 6000)).</li>
		<li>Dodać 9 µL mieszaniny do PCR wzbogacającego do każdej reakcji, aby uzyskać całkowitą objętość 14 µL.</li>
		<li>Uruchomić program PCR wzbogacający zgodnie z Tabelą 8. 
		UWAGA: Standardowo w przypadku PCR wzbogacającego stosuje się 16 cykli. Jeśli jakość cDNA jest słaba, można dodać dodatkowe cykle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie i kontrola jakości (QC)
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem doprowadzić magnetyczne kulki do oczyszczania do temperatury pokojowej i mieszać w wirówce z wysoką prędkością przez 1 min, aby w pełni resuspendować kulki.</li>
		<li>Dodać 1,0x v/v (14 µL) magnetycznych kulek do oczyszczania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić płytkę na statywie magnetycznym i odczekać 5 min, aż kulki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Trzymając płytkę na statywie magnetycznym, delikatnie dodać 100 µL świeżo przygotowanego 80% etanolu w celu przemycia kulek i inkubować przez 30 s. Użyć pipety o małej objętości do usunięcia supernatantu. Powtórzyć krok dla dodatkowego etapu płukania. Należy upewnić się, że usunięto jak najwięcej etanolu.</li>
		<li>Suszyć kulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 min lub do momentu, gdy przestaną być błyszczące.</li>
		<li>Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego, resuspendować kulki w 20 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 2 min.</li>
		<li>Ponownie umieścić płytkę na statywie magnetycznym, aż kulki się oddzielą, i przenieść eluat do nowej płytki PCR w celu kontroli jakości biblioteki.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę za pomocą TapeStation lub Fragment Analyzer, aby ocenić rozkład wielkości i stężenie biblioteki cDNA (Zalecany test: TapeStation D1000 high-sensitivity). Szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta. Średnio spodziewana wydajność wynosi 10 ng. 
		​UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt PCR można przechowywać w temperaturze - 20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie i wstępne przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie 
	UWAGA: Poniższe wytyczne mają zastosowanie do wszystkich instrumentów Illumina do sekwencjonowania krótkich odczytów. W przypadku braku dostępności aparatury, sekwencjonowanie można zlecić zewnętrznemu ośrodkowi sekwencjonowania. Można również zastosować inne podejścia do sekwencjonowania. Dla uproszczenia zdecydowano się opisać wyłącznie najszerzej stosowaną technologię sekwencjonowania. 
	UWAGA: Poniższe kroki dotyczące obsługi oprogramowania opisują procedurę na sekwenatorze Illumina NovaSeq 6000.
	<ol>
		<li>Połącz biblioteki z unikalnymi indeksami w stosunku ekimolarnym, zgodnie z wynikami uzyskanymi w kroku 3.6.8.</li>
		<li>Zmierz stężenie końcowej puli za pomocą wysokoczułego testu, aby obliczyć molarność próbki w następujący sposób: 
		<img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie DNA, równanie stężenia kwasów nukleinowych, z uwzględnieniem ng/µL, schemat." src="/files/ftp_upload/65930/65930eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Należy załadować komórkę przepływową zgodnie ze specyfikacją urządzenia oraz optymalizacją eksperymentalną. Przykłady stężeń ładowania dla powszechnie stosowanych urządzeń przedstawiono w Tabela 9.</li>
		<li>Dotknij ekranu, aby wybrać Sekwencja w celu rozpoczęcia konfiguracji przebiegu.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i umieść w urządzeniu ogniwo przepływowe, kartridż do sekwencjonowania przez syntezę, kartridż do klastrowania oraz kartridż z buforem, a następnie upewnij się, że pojemniki na odpady są puste.</li>
		<li>Po rozpoznaniu przez instrument wszystkich odczynników należy kliknąć Konfiguracja uruchomieniaZdefiniuj tutaj nazwę uruchomienia oraz folder wyjściowy do przechowywania danych.</li>
		<li>Zdefiniuj szczegóły sekwencjonowania jako sekwencjonowanie par końców (paired-end), w którym oba odczyty mają długość 51 bp. Sekwencjonowane są również dwa odczyty indeksów, każdy o długości 8 bp.</li>
		<li>Naciśnij Przegląd a po sprawdzeniu poprawności wszystkich szczegółów sekwencjonowania należy nacisnąć Rozpocznij przebieg. 
		UWAGA: Zalecana głębokość sekwencjonowania wynosi 5 x 106 odczytów/próbkę, z minimum 1 x 106 odczyty/próbka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne przetwarzanie danych
	<ol>
		<li>Przekształć surowe dane z sekwencjonowania do formatu FASTQ i przeprowadź demultipleksację zgodnie z indeksami próbek przy użyciu narzędzia Bcl2Fastq2. Przeprowadź demultipleksację przy użyciu ustawień domyślnych. Szczegółowe instrukcje dotyczące Bcl2Fastq2 znajdują się w podręczniku referencyjnym. 
		UWAGA: Konwersja do formatu FASTQ oraz demultipleksowanie są zazwyczaj wykonywane przez ośrodek sekwencjonowania, jeśli sekwencjonowanie nie jest przeprowadzane wewnątrz jednostki. Ośrodki sekwencjonowania zazwyczaj dostarczają zdemultipleksowane pliki FASTQ do dalszej analizy.</li>
		<li>Dostępnych jest kilka opcji dopasowania danych i kwantyfikacji obfitości odczytów sekwencjonowania (zalecany: rurociąg nf-core RNA-seq (https://nf-co.re/rnaseq)). Rurociąg ten oferuje kilka opcji; należy zastosować ustawienia domyślne z programem STAR.8 zgodnie z dopasowaniem i Salmon9 w celu ilościowego oznaczenia poziomu transkrypcji.</li>
		<li>UWAGA: Do dalszych analiz bioinformatycznych dostępnych jest kilka metod. Poza zakresem niniejszego protokołu znajduje się opisanie wszystkich z nich (zalecany: potok DEseq2)10). Standardowy skrypt oparty na opracowanym przez nas przepływie pracy DEseq2 znajduje się w serwisie GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Transcriptome Profiling for High-Throughput Drug Screening

<ol><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+transcriptome+profiling+in+drug+and+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery.</a> Front Genet. 11, 19(2020).</li>
<li>Bonaguro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+systems-level+immunomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A guide to systems-level immunomics.</a> Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).</li>
<li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+mechanism+of+action+and+sensitivity+to+drug+candidates+from+integrated+transcriptome+and+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state.</a> ELife. 11, 78012(2022).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>De Domenico, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+on+infectious+diseases+including+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100233(2020).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Patro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Frankish, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENCODE+reference+annotation+for+the+human+and+mouse+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes.</a> Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Odkrywanie i opracowywanie leków może przynieść ogromne korzyści z holistycznego spojrzenia na procesy komórkowe, które może zapewnić transkryptomika masowa. Niemniej jednak podejście to jest często ograniczone przez wysokie koszty eksperymentu ze standardowym protokołem masowego sekwencjonowania RNA, co uniemożliwia jego zastosowanie w środowisku akademickim, a także jego potencjał skalowalności przemysłowej.
Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są rozmrażanie komórek i początkowe etapy przygotowania biblioteki. Zapewnienie wysokiej żywotności komórek po rozmrożeniu ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia i analizy transkryptomicznej. Pierwsze etapy zbierania komórek i przygotowania biblioteki do momentu syntezy cDNA mają kluczowe znaczenie dla zachowania integralności RNA. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby lizat komórkowy był cały czas utrzymywany na lodzie i przetwarzał próbki tak szybko, jak to możliwe. W przypadku zaobserwowania nadmiernej degradacji RNA, powierzchnie i sprzęt laboratoryjny należy oczyścić specjalnymi produktami, aby zahamować jakąkolwiek aktywność RNazy.
Opisany tutaj protokół jest obecnie zoptymalizowany pod kątem leczenia farmakologicznego na PBMC od zdrowych dawców przez maksymalnie 24 godziny. Aby przeprowadzić eksperyment z innym typem komórek lub dla dłuższego czasu inkubacji, może być konieczne odpowiednie zoptymalizowanie liczby komórek w warunkach siewu i hodowli.
Dzięki temu protokołowi zapewniamy przepływ pracy do analizy transkryptomicznej po leczeniu farmakologicznym na PBMC przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i bez potrzeby stosowania komercyjnych zestawów. Dzięki takiemu podejściu i unikaniu etapu oczyszczania RNA, znacznie obniżyliśmy koszty, co pozwoliło na równoległą analizę dużej liczby związków.
Ponieważ protokół ten opiera się na teście in vitro, jego głównym ograniczeniem jest to, że nie można w nim ocenić żadnego procesu metabolicznego leków, który mógłby prowadzić do różnej bioaktywności. Ponadto liczba przechwyconych transkryptów i głębokość sekwencjonowania będą niższe niż w standardowych masowych metodach transkryptomicznych o pełnej długości, co uniemożliwi wykorzystanie tych danych do zastosowań wymagających większej ilości informacji, takich jak splicing różnicowy lub kwantyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów.

Rozwój nowych leków to złożony i czasochłonny proces, który obejmuje identyfikację potencjalnych leków i ich celów, optymalizację i syntezę kandydatów na leki oraz testowanie ich skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach przedklinicznych i klinicznych1. Tradycyjne metody badań przesiewowych leków, tj. systematyczna ocena bibliotek związków kandydujących do celów terapeutycznych, obejmują wykorzystanie modeli zwierzęcych lub testów komórkowych w celu przetestowania wpływu na określone cele lub szlaki. Chociaż metody te okazały się skuteczne w identyfikacji kandydatów na leki, często nie dostarczały wystarczających informacji na temat złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności leków, a także toksyczności i mechanizmów potencjalnych skutków ubocznych.
Ocena stanów transkrypcyjnych całego genomu stanowi skuteczne podejście do przezwyciężenia obecnych ograniczeń w badaniach przesiewowych leków, ponieważ umożliwia kompleksową ocenę ekspresji genów w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne2. Mierząc transkrypty RNA w sposób obejmujący cały genom wyrażony w danym czasie, transkryptomika ma na celu zapewnienie holistycznego spojrzenia na zmiany transkrypcyjne, które zachodzą w odpowiedzi na leki, w tym zmiany we wzorcach ekspresji genów, alternatywny splicing i niekodującą ekspresję RNA3. Informacje te mogą być wykorzystane do określenia celów leków, przewidywania ich skuteczności i toksyczności oraz optymalizacji dawkowania i schematów leczenia.
Jedną z kluczowych korzyści płynących z połączenia transkryptomiki z bezstronnym badaniem przesiewowym leków jest możliwość identyfikacji nowych celów leków, które wcześniej nie były brane pod uwagę. Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków często koncentrują się na ustalonych cząsteczkach docelowych lub szlakach, co utrudnia identyfikację nowych celów i potencjalnie prowadzi do powstania leków o nieprzewidzianych skutkach ubocznych i ograniczonej skuteczności. Transkryptomika może przezwyciężyć te ograniczenia, dostarczając wglądu w zmiany molekularne, które zachodzą w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, odkrywając potencjalne cele lub szlaki, które mogły nie być wcześniej brane pod uwagę2.
Oprócz identyfikacji nowych celów leków, transkryptomika może być również używana do przewidywania skuteczności i toksyczności leków. Analizując wzorce ekspresji genów związanych z reakcjami na leki, można opracować biomarkery, które można wykorzystać do przewidywania odpowiedzi pacjenta na określony lek lub schemat leczenia. Może to również pomóc w optymalizacji dawkowania leków i zmniejszeniu ryzyka wystąpienia niepożądanych skutków ubocznych4.
Pomimo potencjalnych korzyści, koszt transkryptomiki pozostaje istotną przeszkodą dla jej szerokiego zastosowania w badaniach przesiewowych leków. Analiza transkryptomiczna wymaga specjalistycznego sprzętu, wiedzy technicznej i analizy danych, co może stanowić wyzwanie dla mniejszych zespołów badawczych lub organizacji o ograniczonych funduszach w wykorzystaniu transkryptomiki w badaniach przesiewowych leków. Jednak koszt transkryptomiki stale spada, co czyni ją bardziej dostępną dla społeczności naukowych. Ponadto postęp w technologii i metodach analizy danych sprawił, że transkryptomika stała się bardziej wydajna i opłacalna, co jeszcze bardziej zwiększyło jej dostępność2.
W tym protokole opisujemy wielowymiarowy i eksploracyjny system do badań przesiewowych leków opartych na transkryptomie, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacji z analizą transkryptomiczną mini-masową5,6. Dzięki temu protokołowi możliwe jest obniżenie kosztu na próbkę do 1/6 obecnego kosztu komercyjnych rozwiązań do sekwencjonowania mRNA o pełnej długości. Protokół wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, a jedynym wyjątkiem jest stosowanie technologii sekwencjonowania z krótkim odczytem, które można zlecić na zewnątrz, jeśli przyrządy do sekwencjonowania nie są dostępne we własnym zakresie. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza bogatych w informacje sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek.
Celem eksperymentu jest sprawdzenie aktywności leków na PBMC w różnych kontekstach biologicznych. Protokół ten może być zastosowany do każdego zagadnienia biologicznego, w którym kilka leków powinno być testowanych z odczytem transkryptomicznym, dając szeroki transkryptom wglądu w komórkowy efekt leczenia.

<table><tbody><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10203001</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Amplicon Tagment Mix (ATM)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)</td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A 63881</td><td></td></tr><tr><td>Betaina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa do hodowli komórkowych (VACUSAFE)</td><td>Integra Bioscience</td><td>158300</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforany deoksynukleotydów (dNTP) mieszają się po 10 mM każdy</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DTT (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>do komórek adherentnych</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące (10 &mikro; L)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F171203</tr><tr><td>Końcówki filtrujące (100 &mikro; L)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F171403</tr><tr><td>Końcówki filtrujące (20 &mikro; L)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F171303</tr><tr><td>Końcówki filtrujące (200 &mikro; L)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F171503</tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td></td></tr><tr><td>Starter ISPCR (10 &mikro; M)</td><td>Biomers.net GmbH</td><td>SP10006</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3&prime;</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Podstawka magnetyczna 96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Neutralize Tagment (NT) Buffer&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek), alternatywnie 0,2 % SDS</td></tr><tr><td>Starter indeksujący kompatybilny z Nextera</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>PCR 96-dołkowe płytki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0600</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka do płytek PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSF0031</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna&nbsp;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Invitrogen</td><td>15723679</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy (40 U/ul)</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych TAKARA</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>61870036</td><td>Jeśli nie działa z PBMC, dostosuj do typu komórki&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter SMART dT30VN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3</td></tr><tr><td>Standardowe wyposażenie laboratoryjne</td><td>różne</td><td>np</td><td>. wirówka, maszyna do lodu, wiadro na lód, woda destylowana, łaźnia wodna</td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza (SSRT II)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Bufor odwrotnej transkryptazy (SSRT II) (5x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Tagment DNA Buffer (TD)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)</td></tr><tr><td>System TapeStation 4200</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (S1000)</td><td>Bio-Rad</td><td>1852148</td><td></td></tr><tr><td>TSO-LNA (100 uM)</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5' Biotyna AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Mixer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr></tbody></table>

ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

Transkryptomika pozwala uzyskać kompleksowy wgląd w programy komórkowe i ich reakcje na zakłócenia. Pomimo znacznego spadku kosztów produkcji bibliotecznej i sekwencjonowania w ostatniej dekadzie, zastosowanie tych technologii na skalę niezbędną do badań przesiewowych narkotyków pozostaje zbyt drogie, co utrudnia wykorzystanie ogromnego potencjału tych metod. W naszym badaniu przedstawiono efektywny kosztowo system do badań przesiewowych leków na podstawie transkryptomu, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacyjne z transkryptomiką mini-masową. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza informacyjnych sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek. W zależności od wybranego leczenia i czasu inkubacji, protokół ten spowoduje sekwencjonowanie bibliotek w ciągu około 2 dni. Ze względu na kilka punktów zatrzymania w tym protokole, przygotowanie biblioteki, jak również sekwencjonowanie, mogą być wykonywane niezależnie od czasu. Możliwe jest jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek; Pomiar do 384 próbek został przetestowany bez utraty jakości danych. Nie są również znane żadne ograniczenia co do liczby schorzeń i/lub leków, pomimo uwzględnienia zmienności optymalnego czasu inkubacji leków.

Zgodnie z opisanym protokołem, ludzkie PBMC wysiano, poddano działaniu różnych leków immunomodulujących, a po różnych czasach inkubacji zebrano do analizy transkryptomicznej typu bulk, stosując protokół sekwencjonowania (Rycina 1).
Optymalne stężenia leków i czasy inkubacji dla testowanych związków powinny zostać określone przed rozpoczęciem niniejszego protokołu przy użyciu uzupełniających strategii eksperymentalnych i w oparciu o konkretne pytanie badawcze. W większości przypadków inkubacja przez 2 - 4 h oraz 24 h powinna zapewnić reprezentatywny obraz wczesnych i późnych odpowiedzi transkrypcyjnych na zastosowane leczenie.
Najważniejszymi wynikami służącymi do oceny prawidłowości wykonania protokołu są kontrole jakości (QC) cDNA oraz biblioteki (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Profil cDNA powinien charakteryzować się szerokim rozkładem ze średnią wielkością &gt; 1000 bp (Rysunek 2); mniejsza średnia wielkość lub akumulacja cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (Rysunek 4) może wskazywać na zbyt niską ilość wprowadzonego RNA lub jego degradację.
Przygotowanie wysokiej jakości biblioteki do sekwencjonowania jest również istotnym etapem protokołu; biblioteki po tagmentacji powinny wykazywać dość wąski rozkład fragmentów o długości około 250 bp (Rysunek 3); dłuższe fragmenty będą charakteryzować się niską wydajnością podczas sekwencjonowania (Rysunek 5).
Po sekwencjonowaniu surowe pliki FASTQ są dopasowywane do odpowiedniego genomu referencyjnego (np. ludzkiego lub mysiego), a następnie kwantyfikowana jest obfitość transkryptów dla każdej próbki (patrz: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Następnie przeprowadzona zostanie eksploracyjna analiza danych w celu sprawdzenia ogólnej jakości danych. Dopasowane dane powinny obejmować wysoką liczbę genów kodujących białka, ponieważ w tym protokole wychwycone zostanie tylko RNA poliadenylowane (Rysunek 6A). W próbkach ludzkich spodziewamy się wychwycenia od 15000 do 20000 transkryptów (wartość ta opiera się na adnotacji referencyjnego genomu ludzkiego GENCODE 2711). Dalsza eksploracyjna analiza danych może obejmować analizę głównych składowych (PCA). Dzięki niej struktura danych może zostać zwizualizowana na wykresie dwuwymiarowym. Na Rysunku 6B przedstawiono przykładowy wykres PCA; kropki są tu określone kolorami według zastosowanego leczenia, co pokazuje trzy różne klastry warunków eksperymentalnych prowadzących do podobnych profili transkrypcyjnych. Widać również, że repliki biologiczne (kropki w tym samym kolorze) są transkrypcyjnie podobne, co świadczy o dobrej powtarzalności protokołu. Wyniki przedstawione na tym rysunku zostały wygenerowane za pomocą pipeline'u dostępnego na GitHubie, opartego na workflow DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
<img alt="Schemat od manipulacji komórkami do sekwencjonowania, RT PCR, przygotowanie cDNA, kroki przepływu pracy, konfiguracja laboratorium." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szacowany czas i schemat przepływu pracy. (A) Szacowany czas trwania tego protokołu dla analizy 96 próbek. (B) Schemat każdego kroku w protokole, od rozmrożenia komórek do wstępnego przetwarzania danych. Schemat należy czytać od góry do dołu, zgodnie ze strzałkami. Strzałki w okręgach opisują powtórzenie kroku. Czerwone kropki reprezentują punkty zatrzymania opisane szczegółowo w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wyników elektroforezy; rozkład wielkości fragmentów DNA; zakres wielkości od 15 do 10000 bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykładowe wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy obrazujące rozkład wielkości przykładowej biblioteki cDNA. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). Profil cDNA wykazuje szeroki rozkład o średniej wielkości &gt; 1000 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; rozkład wielkości DNA; wykres; analiza piku; określanie wielkości cząsteczek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykładowe wyniki dla bibliotek do sekwencjonowania. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości pomyślnie przygotowanych bibliotek do sekwencjonowania z wąskim rozkładem i średnią wielkością około 250 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy, wykres fragmentacji DNA, przedstawiający rozkład wielkości, analiza fragmentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowe suboptymalne wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości suboptymalnej biblioteki cDNA o średniej wielkości &lt; 200 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy, intensywność próbki względem wielkości, piki drabinki DNA, wykres do analizy genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykładowe nieoptymalne wyniki dla bibliotek sekwencjonowania. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości nieoptymalnej biblioteki sekwencjonowania zawierającej dłuższe fragmenty o rozmiarze 200 - 1000 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza danych ekspresji genów; wykres słupkowy i wykres rozrzutu PCA przedstawiające wariancję po zastosowaniu leków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Eksploracyjna analiza danych. Reprezentatywne wyniki eksploracyjnej analizy danych wykazujące wpływ wybranych leków immunomodulujących na PBMC. (A) Wykres słupkowy liczby wykrytych genów (osie Y) z podziałem na typy genów (osie X). (B) Analiza PCA wszystkich genów w zbiorze danych, z kolorami odpowiadającymi poszczególnym lekom. Kropki tego samego koloru to powtórzenia biologiczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Stężenie</td>
			<td >Objętość [µL] /reakcja</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorowodorek guanydyny</td>
			<td >80 mM</td >
			<td >7.50</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Deoksynukleotydotrifosforany (dNTPs)</td >
			<td >po 10 mM każdego</td >
			<td >6.52</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Starter SMART dT30VN</td >
			<td >100 µM</td >
			<td >0.33</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Woda wolna od nukleaz</td >
			<td ></td >
			<td >0.65</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Objętość całkowita</td>
			<td ></td >
			<td >15.00</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Bufor do lizy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Tom [µL] /rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor SSRT II (5x)</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (100 mM)</td>
			<td>0.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaina (5 M)</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2 (1 M)</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSRT II (200 U/µL)</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy (40 j./µL)</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO-LNA (100 µM)</td>
			<td>0.20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>6.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Mieszanina do reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">denaturacja mRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denaturacja mRNA</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>w lodzie</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Transkrypcja odwrotna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrotna transkrypcja</td>
			<td>42 °C </td>
			<td>90 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inaktywacja enzymu</td>
			<td>70 °C</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>przytrzymać</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Program termocyklera dla denaturacji mRNA i odwrotnej transkrypcji (RT).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość [µL] /reakcja </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności </td>
			<td>12.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>starter do IS-PCR (10 µM)</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>2.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>15.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Mieszanina do preamplifikacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępna denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="3">16–18 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>67 °C</td>
			<td>20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>72 °C </td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>przytrzymać</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Program termocyklera dla preamplifikacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tagmentacja</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>przytrzymać</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Program termocyklera do tagmentacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Mieszanina do tagmentacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Tom [µL] /rxn </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina do tagmentacji amplikonów (ATM)</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do tagmentacji DNA (TD)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Mieszanina do PCR wzbogacającego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość [µL] /rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności </td>
			<td>7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter indeksujący kompatybilny z Nextera</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>9.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 7: Mieszanina do tagmentacji i mieszanina do PCR wzbogacania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Temperatura </td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szybki start (Hot Start)</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępna denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">16 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ostateczna elongacja</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>przytrzymać</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 8: Program termocyklera dla PCR wzbogacania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td>Stężenie nakładane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq v2</td>
			<td>10 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550</td>
			<td>1,4 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000</td>
			<td>1250 pM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 9: Przykłady stężeń ładowania dla powszechnie stosowanych sekwenatorów.

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease ...

Transkryptomika pozwala nam dogłębnie zrozumieć program komórkowy i jego reakcję na zmiany zewnętrzne. Jednak pomimo znacznego zmniejszenia kosztów produkcji bibliotecznej i sekwencjonowania w ciągu ostatnich dziesięcioleci, zastosowanie tej technologii na skalę potrzebną do badań przesiewowych leków jest nadal nieosiągalne, co ogranicza ogromny potencjał tych metod. W naszym badaniu przedstawiono efektywny kosztowo system badań przesiewowych leków na podstawie transkrypcji.Połączenie zminiaturyzowanych kultur perturbacyjnych z transkryptomiką minirobaków. Zoptymalizowany protokół dotyczący minibugów zapewnia informacyjny sygnał biologiczny przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek. Jedną z kluczowych korzyści płynących z połączenia transkryptomiki z bezstronnymi badaniami przesiewowymi leków jest możliwość identyfikacji nowych celów leków, które wcześniej nie były brane pod uwagę.Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków często koncentrują się na ustalonych cząsteczkach docelowych lub szlakach, co utrudnia identyfikację nowych celów i potencjalnie prowadzi do powstania leków o nieprzewidzianych skutkach ubocznych i ograniczonej skuteczności. Na początek rozmrozić fiolkę kriowizyjną PBMC w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut, delikatnie ją odwracając. Następnie przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Przepłucz kriokulę jednym mililitrem ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej i dodaj roztwór kroplami do komórek w stożkowej probówce, aby wykonać pierwszy etap rozcieńczania. Teraz odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut i płynnie przechyl stożkową rurkę, aby usunąć supernatant. Ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej.Do liczenia komórek wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą 10 mikrolitrów barwionego roztworu komórkowego, za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory komórkowej. Użyj ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej, aby rozcieńczyć komórki, aby osiągnąć końcowe stężenie od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr.Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dodaj 100 mikrolitrów dwukrotnie rozcieńczonego leku do każdej studzienki. Aby zebrać komórki, odwiruj płytkę do hodowli komórkowej przez 10 minut.Użyj pompy próżniowej, aby usunąć supernatant, umieszczając końcówkę pompy w dolnym rogu studzienki, aby zatrzymać komórki. Teraz dodaj 200 mikrolitrów lodowatego PBS do każdej studzienki. Po odwirowaniu płytki przez pięć minut usunąć supernatant.Następnie dodaj 15 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki. Za pomocą samoprzylepnej folii uszczelniającej uszczelnij płytę, aby zabezpieczyć ją przed zanieczyszczeniem. Zwiruj płytkę i odwiruj ją przez jedną minutę.Na koniec zbierz sześć mikrolitrów roztworu zlizowanych komórek na płytce do PCR. Na początek zbierz PBMC traktowane lekiem przez odwirowanie i zbierz lizat komórkowy na płytce PCR. Odwiruj płytkę, aby zebrać lizat na dnie.Następnie należy przeprowadzić denaturację mRNA za pomocą termocyklera. Następnie dodaj sześć mikrolitrów mieszaniny reakcji odwrotnej transkryptazy do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 12 mikrolitrów. Uszczelnij płytę, aby chronić przed zanieczyszczeniem i zapobiec parowaniu.Odwirować płytkę po krótkim zawirowaniu. Umieść płytkę na termocyklerze i rozpocznij program reakcji odwrotnej transkrypcji. Po odwrotnej transkrypcji odwirować płytkę PCR, dodać 15 mikrolitrów mieszanki do wstępnej amplifikacji do każdej studzienki i zamknąć.Umieść szczelną płytkę na termocyklerze i rozpocznij reakcję wstępnego amplifikacji. Aby oczyścić CDNA, dodaj magnetyczne kulki oczyszczające do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym na pięć minut lub do momentu, gdy kulki się rozdzielą.Następnie ostrożnie usuń supernatant. Trzymając talerz na stojaku magnetycznym, delikatnie wprowadź 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby oczyścić koraliki. Po 30-sekundowej inkubacji użyj pipety, aby wyeliminować supernatant.Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu na stojaku magnetycznym przez pięć minut lub do momentu, gdy etanol całkowicie odparuje, a kulki przestaną być błyszczące. Po wyjęciu płytki ze stojaka magnetycznego ponownie zawieś koraliki w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym, aż koraliki zostaną oddzielone.Przenieść eluetę na świeżą płytkę PCR przygotowaną do kontroli jakości CDNA i znakowania. W celu znakowania dodać trzy mikrolitry mieszaniny znakującej dla każdej reakcji na nową płytkę PCR. Dodaj jeden mikrolitr CDNA do każdej reakcji.Natychmiast rozpocznij reakcję tagowania. Następnie zneutralizuj reakcję, dodając jeden mikrolitr zneutralizowanego buforu znakującego do każdej reakcji. W przypadku PCR wzbogacającego dodać dziewięć mikrolitrów mieszanki PCR do każdej reakcji, aby uzyskać całkowitą objętość 14 mikrolitrów.Uruchom program PCR wzbogacający. Aby rozpocząć, połącz unikatowo indeksowane biblioteki w stosunku równomolowym. Zmierz stężenie końcowej puli za pomocą testu o wysokiej czułości, aby obliczyć molowość próbki za pomocą tego równania.Teraz załaduj komórkę przepływową zgodnie ze specyfikacją przyrządu i dowolną optymalizacją eksperymentalną. Wybierz sekwencję na ekranie, aby rozpocząć konfigurację uruchamiania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować sekwencję komórek przepływowych za pomocą wkładu do syntezy, wkładu klastrującego i wkładu buforowego.Po rozpoznaniu wszystkich odczynników przez sprzęt dodaj nazwę przebiegu w ustawieniach przebiegu. Określ szczegóły sekwencjonowania jako parę do końca, przy czym oba odczyty mają długość 51 par podstaw. Dodatkowo sekwencja dwóch odczytów indeksu po osiem par zasad każda.Określ katalog wyjściowy do przechowywania danych i dotknij Przejrzyj. Po sprawdzeniu poprawności wszystkich parametrów sekwencjonowania wybierz opcję Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć sekwencjonowanie.

cost-efficient-transcriptomic-based-drug-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Opisujemy metodologię łączącą zautomatyzowaną hodowlę komórek z obrazowaniem wysokotreściowym w celu wizualizacji i kwantyfikacji wielu procesów oraz struktur komórkowych w sposób wysokoprzepustowy. Takie metody mogą wspomagać dalszą adnotację funkcjonalną genomów, a także identyfikację sieci genów związanych z chorobami i potencjalnych punktów uchwytu dla leków.

Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Obecne prace opisują protokół uruchamiania algorytmu Pathway2Targetes, skryptu R, który przewiduje i priorytetowo nadaje cele terapeutyczne na podstawie profilu szlaków sygnalizacji wewnątrzkomórkowej generowanej przez porównanie próbek przypadków i kontrolnych z eksperymentu sekwencjonowania RNA w masowym składzie.

Wykorzystanie list genów wyrażanych różnicowo ekspresyjnie u człowieka do analizy wzbogacania szlaków w dalszej części i priorytetyzacji celów

Poznaj ekonomiczny protokół minibug do przesiewowego badania leków oparty na transkryptomii komórek PBMC. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych celów lekowych przy zmniejszonej głębokości sekwencjonowania.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Przeglądaj więcej filmów