Test aktywnego unikania miejsc (APA), skuteczne, wszechstronne i powtarzalne zadanie uczenia się przestrzennego dla myszy
16 lutego 2024
W tym miejscu przedstawiamy protokół testu aktywnego unikania miejsc, zależnego od hipokampa paradygmatu uczenia się przestrzennego przeznaczonego dla gryzoni. Zmiana kluczowych parametrów pozwala na ponowne badanie zwierząt przed i po zabiegach lub w czasie.
Chcemy zbadać, w jaki sposób zależne od hipokampa uczenie się przestrzenne zmienia się wraz z wiekiem. Następnie badamy, w jaki sposób interwencje, takie jak ćwiczenia fizyczne, zmieniają te wyniki poznawcze. Ten paradygmat behawioralny pozwala nam łatwo zbadać je w tej samej kohorcie myszy.
Dostępnych jest wiele testów poznawczych do testowania uczenia się przestrzennego u myszy, z których większość istnieje od dziesięcioleci. Należą do nich labirynt wodny Morrisa, labirynt Y i labirynt Barnesa. Każdy z nich ma ograniczenia, zwłaszcza w odniesieniu do badań podłużnych.
Głównym wyzwaniem eksperymentalnym jest testowanie zwierząt w sposób podłużny, co utrudnia dokładne określenie efektu interwencji ruchowych. Większość testów uczenia się przestrzennego jest albo łatwa do nauczenia, albo jest bardzo stresująca lub nieodpowiednia dla chorych modeli. Zmieniając niektóre kluczowe elementy aktywnego unikania miejsc, takie jak kierunek obrotu areny lub lokalizacja strefy szoku.
Ten test może być używany wielokrotnie. Zmieniając kolor podłogi areny, jesteśmy w stanie przetestować myszki o różnych kolorach takich jak C57 black 6 czy myszki szwajcarskie. Aby rozpocząć, umieść urządzenie do unikania aktywnego miejsca lub APA w ramie kamery zamontowanej na suficie.
Otwórz oprogramowanie do śledzenia zwierząt, aby śledzić mysz. Na karcie eksperymentu ustaw czas trwania próby na 10 minut, a następnie określ czas trwania wstrząsu na 500 milisekund i utrzymuj strefę wstrząsu na poziomie 270 stopni z zakładki edycji celu. Umieść cztery wskazówki wizualne w neutralnych kolorach na różnych ścianach pomieszczenia na tej samej wysokości co obrotowa platforma i w odległości od 30 do 50 centymetrów od ich areny.
Dostosuj natężenie światła w pomieszczeniu w zakresie od 30 do 70 luksów. Otwórz zakładkę śledzenia w oprogramowaniu śledzącym, a następnie kliknij zakładkę z kalibratora i odpowiednio ustaw rozmiar myszy i zakresy obszaru, aby upewnić się, że mysz jest rozpoznawana na arenie. Na karcie od kalibratora dostosuj próg kontrastu, przesuwając czerwoną linię i panel progu, aby zapewnić dokładne śledzenie zwierząt.
Na koniec uruchom arenę i upewnij się, że podczas obracania się pozostaje w masce. Następnie w zakładce urządzenia wybierz źródło prądu i ustaw bieżący tryb na śledzenie w zależności od tego, jak i kiedy dostarczane są wstrząsy nożne, ustaw poziom wstrząsu na 0,5 miliampera. Przyzwyczaj mysz w pomieszczeniu przez 30 minut.
Uruchom oprogramowanie śledzące. Utwórz katalog wyjściowy przy użyciu karty danych wyjściowych pliku, aby zapisać dane próbne. Następnie utwórz folder specyficzny dla eksperymentu i w zależności od modelu eksperymentalnego utwórz osobne foldery dla każdego dnia lub wersji próbnej.
Zapisz dane eksperymentu w folderze wyjściowym. Przed rozpoczęciem okresu próbnego kliknij przycisk zapisz i w nowo otwartym oknie dodaj unikalny identyfikator myszy.Następnie za pomocą dłoni pokrytej rękawicą ostrożnie podnieś mysz z podstawy ogona z klatki domowej. Umieść mysz na obracającej się arenie aparatu APA w celu zamieszkania bez wywoływania wstrząsów.
Wycofaj się za kurtynę i włącz oprogramowanie śledzące, rozpocznij eksperymentalną próbę. Po pięciu minutach wyjmij mysz z aparatu APA i umieść ją z powrotem w klatce domowej. Zbierz wszystkie odpady i dokładnie wyczyść siatkę za pomocą 80% etanolu.
Następnie na karcie eksperymentu ustaw czas trwania próby na 10 minut. Następnie określ czas trwania wstrząsu na 500 milisekund i utrzymuj strefę wstrząsu pod kątem 270 stopni z zakładki edycji celu, umieść kursor myszy na arenie aparatu APA, jak pokazano wcześniej. Wycofaj się za kurtynę.
Kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć wersję próbną i monitorować aktywność myszy. Po próbie usuń mysz z areny APA i umieść ją z powrotem w klatce domowej. Aby przeanalizować dane zadania APA myszy, otwórz program do analizy ścieżek.
Z menu rozwijanego wybierz unikanie. Kliknij dodaj zadanie, aby przesłać zapisane pliki danych. Następnie w polu Nazwa grupy utwórz grupę, aby przeanalizować dane.
Kliknij katalog wyjściowy, aby wybrać lokalizację, w której mają zostać zapisane analizowane dane. Następnie kliknij dodaj pliki i wybierz pliki do analizy z dysku lokalnego. Kliknij ustaw czas i określ okres analizy z zakresu od zera do 600 sekund.
Po dodaniu wszystkich ścieżek należy kliknąć w zakładkę analiza i wybrać opcję uruchom analizę. Otwórz dane zapisane w folderze TBL files w arkuszu kalkulacyjnym. Na koniec zapisz arkusz kalkulacyjny do analizy statystycznej.
Myszy z nienaruszoną zdolnością uczenia się przestrzennego wykazują zmniejszenie liczby wstrząsów podczas kolejnych prób akwizycji. Dodatkowo myszy te wykazują wydłużenie maksymalnego czasu spędzonego na unikaniu strefy szoku. Mapy śladowe wykazały, że myszy z nienaruszoną zdolnością uczenia się przestrzennego otrzymały tylko dwa wstrząsy i spędzały czas głównie po przeciwnej stronie strefy szoku.
W przeciwieństwie do tego, myszy z trudnościami w uczeniu się otrzymały więcej wstrząsów, a mapa śladów ujawnia nieuporządkowany wzorzec.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół testu aktywnego unikania miejsca (active place avoidance test), który jest paradygmatem uczenia się przestrzennego zależnym od hipokampa, opracowanym dla gryzoni. Protokół ten umożliwia ponowne badanie zwierząt przed i po zastosowaniu leczenia lub w określonych odstępach czasu poprzez zmianę kluczowych parametrów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania behawioralne
- Uczenie się przestrzenne
Wstęp
- Test aktywnego unikania miejsca jest paradygmatem behawioralnym wykorzystywanym do oceny uczenia się przestrzennego.
- Jest on szczególnie użyteczny w badaniu wpływu starzenia się oraz interwencji, takich jak ćwiczenia fizyczne, na funkcje poznawcze.
- Tradycyjne testy uczenia się przestrzennego mają swoje ograniczenia, zwłaszcza w przypadku badań podłużnych.
- Modyfikacje testu aktywnego unikania miejsca mogą zwiększyć jego użyteczność w badaniach z wielokrotnymi pomiarami.
Cel badania
- Aby zbadać, w jaki sposób starzenie się wpływa na zależne od hipokampa uczenie się przestrzenne.
- Aby zbadać wpływ ćwiczeń fizycznych na wyniki poznawcze u myszy.
- Aby opracować wiarygodną metodę podłużnego testowania uczenia się przestrzennego w tej samej kohorcie myszy.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie aparatury do aktywnego unikania miejsca z regulowanymi parametrami.
- Śledzenie zachowania myszy za pomocą specjalistycznego oprogramowania podczas prób.
- Wdrożenie specyficznych protokołów wstrząsowych w celu oceny uczenia się i unikania.
- Analiza danych przy użyciu oprogramowania do śledzenia w celu oceny wskaźników wydajności.
Główne wyniki
- Myszy z nienaruszonymi zdolnościami uczenia się przestrzennego otrzymały mniej wstrząsów i spędzały więcej czasu, unikając strefy wstrząsu.
- Mapy śladów wskazały, że myszy te utrzymywały bardziej uporządkowany wzorzec unikania.
- Myszy z zaburzeniami uczenia się otrzymały więcej wstrząsów i wykazywały nieuporządkowane wzorce ruchu.
- Protokół umożliwia powtarzanie testów z modyfikacjami w celu zminimalizowania stresu i maksymalizacji niezawodności danych.
Wnioski
- Test aktywnego unikania miejsca jest skuteczny w ocenie uczenia się przestrzennego u gryzoni.
- Modyfikacje testu zwiększają jego przydatność w badaniach podłużnych.
- Wyniki wskazują na istotne różnice w zdolnościach uczenia się przestrzennego w zależności od interwencji i wieku.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test aktywnego unikania miejsca (Active Place Avoidance, APA) stanowi solidną, powtarzalną platformę do oceny zależnego od hipokampa uczenia się przestrzennego w przedklinicznych modelach mysich. Jego wszechstronność i możliwość zastosowania w badaniach podłużnych umożliwiają wysoką wiarygodność oceny interwencji poznawczych, wspierając podejmowanie decyzji prognostycznych na wczesnych etapach odkryć oraz w punktach zwrotnych badań translacyjnych. Zdolność testu APA do adaptacji w modelach chorobowych i badaniach interwencyjnych zwiększa jego wartość w procesie selekcji projektów z portfolio oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju w dziedzinie neuronauk.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę ścieżek uczenia się przestrzennego istotnych dla mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie wyników poznawczych po interwencjach genetycznych lub farmakologicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze kandydatów dzięki powtarzalnym testom z regulowanymi parametrami.
Przesiew i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowany test behawioralny, który można dostosować do różnych szczepów myszy i warunków eksperymentalnych.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników, takich jak liczba wstrząsów i czasy unikania, przeznaczonych do dalszej analizy.
- Umożliwia skalowalne, podłużne badanie efektów interwencji w obrębie tej samej kohorty zwierząt.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby, w tym z myszami w starszym wieku lub poddanymi manipulacjom chirurgicznym, w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera postępy z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez odróżnianie fenotypów reagujących na interwencję od grup kontrolnych.
- Umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego dla punktów końcowych funkcji poznawczych w przedklinicznych programach badań nad neurodegeneracją.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test APA integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a translacyjną walidacją punktów końcowych funkcji poznawczych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących obwodów uczenia się przestrzennego i pamięci przy zastosowaniu różnych interwencji.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów w celu oceny wpływu związków chemicznych lub modyfikacji genetycznych na funkcje poznawcze.
- Analityka: Generuje ilościowe mierniki behawioralne umożliwiające rzetelne porównania statystyczne między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną, powtarzalną platformę, którą można dostosować do zmieniających się priorytetów badawczo-rozwojowych i systemów modelowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów poznawczych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy behawioralne dzięki skalowalnym, powtarzalnym protokołom i zautomatyzowanemu gromadzeniu danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go oraz efektywność kapitałową, umożliwiając podłużne porównania w obrębie tej samej kohorty.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów neuropoznawczych i strategii interwencyjnych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuronauki behawioralnej oraz pracy z zwierzętami.
- Wymagane jest specjalistyczne instrumentarium, w tym obrotowa arena oraz oprogramowanie do śledzenia zwierząt.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów eksperymentalnych i schematów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych szczepów myszy i modeli chorób poprzez modyfikacje protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują wrażliwość na zmienne środowiskowe oraz konieczność przeprowadzenia rygorystycznej analizy statystycznej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:21
Setting Up the Active Place Avoidance Apparatus for Mouse Behavioral Testing
2:45
Habituation and Acquisition Training in the Active Place Avoidance Arena for Mouse Behavioral Studies
4:31
Analysis of Mouse Behavioral Data in the Active Place Avoidance Task Using Track Analysis Software
