Name: Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj technikę wielokolorowej immunofluorescencji do oceny modelu alergicznego nieżytu nosa u szczurów. Ta metoda umożliwia identyfikację białek związanych z alergią i badanie mechanizmów leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Departament Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2021YJ0175).

Eksperymentalny protokół i procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Administracyjny i Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (numer rekordu: 2022DL-010). Ośmiotygodniowe samce szczurów Sprague Dawley (SD) o wadze 180-200 g uzyskano komercyjnie (patrz tabela materiałów) i trzymano w naturalnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą (23 ± 2 °C) i wilgotnością względną (55% ± 10%). Dwanaście szczurów zostało losowo podzielonych na dwie grupy: grupę kontrolną i grupę AR. Wszystkie szczury zostały zaaklimatyzowane do tych warunków i zapewniono im swobodny dostęp do jedzenia i wody przez tydzień przed badaniem.
1. Stworzenie szczurzego modelu AR
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu uczulającego: zawiesić 30 mg albuminy jaja kurzego (OVA) i 3 g Al(OH)3 w 100 ml soli fizjologicznej (patrz tabela materiałów)14,15.</li>
	<li>Podstawowe uczulenie: chwyć i przytrzymaj w pełni przytomnego szczura brzuchem skierowanym do góry. Zdezynfekuj brzuch za pomocą wacików nasączonych 75% alkoholem. Za pomocą strzykawki o pojemności 1,5 ml wstrzyknąć 1 ml roztworu uczulającego przygotowanego w kroku 1.1 do lewej jamy brzusznej szczurów w grupie AR. Powtarzaj to wstrzyknięcie raz na dwa dni przez 14 dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Upewnij się, że głowa szczura jest umieszczona niżej niż ogon, aby zapobiec uszkodzeniu jelita grubego i cienkiego podczas wkładania strzykawki. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,5 cm od brzusznej linii środkowej. Szczury w grupie kontrolnej powinny otrzymywać dootrzewnowe wstrzyknięcia 1 ml soli fizjologicznej raz na dwa dni przez 14 dni.</li>
	<li>Prowokacja donosowa: Podaj 50 μl 5% OVA za pomocą kropli do nosa za pomocą pipety 100 μl (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) następnego dnia po podstawowym uczuleniu, powtarzając tę procedurę przez 7 dni (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Przygotować 5% roztwór OVA, mieszając 5 g OVA ze 100 ml soli fizjologicznej. Dla grupy kontrolnej podawaj krople o tej samej objętości soli fizjologicznej.</li>
</ol>
2. Ocena behawioralna szczurów
<ol>
	<li>W ciągu 30 minut po zakończeniu ostatniego wyzwania nosowego obserwuj i nagrywaj szczury za pomocą aparatu cyfrowego, aby zidentyfikować objawy, takie jak drapanie nosa, kichanie i katar, w oparciu o kryteria punktacji przedstawione w Tabeli 1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). 
	UWAGA: Potwierdzenie udanego modelowania AR opiera się na osiągnięciu łącznego wyniku ≥5 punktów14.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek błony śluzowej nosa
<ol>
	<li>Składanie szczurów w ofierze: składanie ich w ofierze poprzez wystawienie ich na przedawkowanie CO2 . Następnie zdezynfekuj szczury 75% etanolem (patrz Tabela materiałów). Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż dwóch kącików ust, aby odsłonić tkankę mięśniową (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A). Następnie przetnij stawy kości jarzmowej i żuchwy po obu stronach czaszki za pomocą nożyczek do tkanek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) i usuń żuchwę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Odsłonięcie jamy nosowej: oddziel skórę szczęki za pomocą hemostatu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2D), aby odsłonić jamę nosową (<silna klasa="xfig">Ryc. 2E). Przeciąć kościste połączenie między jamą nosową a szczęką nożyczkami do tkanek (<silna klasa="xfig">Ryc. 2F). Następnie przeciąć połączenie między jamą nosową a kośćmi oczodołu po obu stronach otworu podoczodołowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G) i usuń jamę nosową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Utrwalenie: wyekstrahowaną jamę nosową umieścić w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 24-72 godziny (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Upewnij się, że ilość użytego utrwalacza paraformaldehydu jest wystarczająca do całkowitego pokrycia sekcji w celu prawidłowego utrwalenia.</li>
</ol>
4. Wstępne przetwarzanie próbek błony śluzowej nosa
<ol>
	<li>Odwapnienie: zacznij od naprawienia usuniętych tkanek z kroku 3.1. Umyj je trzy razy PBS przez 20 minut każde. Następnie myj je trzykrotnie wodą destylowaną, za każdym razem przez 20 minut. Następnie odwapnić tkanki w roztworze odwapniającym o objętości 20-30 razy większej niż objętość tkanek w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Roztwór odwapniający (patrz tabela materiałów) powinien utrzymywać pH na poziomie 7,2-7,4. Na koniec umieść odwapnioną tkankę w pudełku do odwadniania. 
		UWAGA: Roztwór odwapniający należy wymieniać co tydzień. Proces odwapniania można zakończyć, gdy tkanka zmięknie (około 2 miesiące).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie i woskowanie: przenieś pojemnik do odwadniania do suszarki (patrz Tabela materiałów). Zacznij od 75% alkoholu przez 4 godziny, następnie 85% alkoholu przez 2 godziny, 90% alkoholu przez 2 godziny i 95% alkoholu przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Następnie zanurz tkankę w bezwodnym etanolu na 30 min, powtórz proces przez kolejne 30 min, użyj ksylenu na 5-10 min, powtórz ten krok przez kolejne 5-10 min, zanurz tkankę w wosku na 1 h, powtórz ten krok przez kolejną godzinę, a na koniec zanurz tkankę w wosku na dodatkowe 1 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie: umieść blok stopionego wosku w pudełku do zatapiania (patrz Tabela materiałów) i przechowuj go w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Gdy wosk zastygnie, usuń go i przytnij blok wosku.</li>
	<li>Krojenie: przycięty blok wosku włożyć do mikrotomu parafinowego (patrz Tabela Materiałów) i pokroić w plastry o grubości 3 μm. Umieścić plastry w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C na szkiełku do smarowania. Spłaszcz chusteczkę, a następnie podnieś ją szklanym szkiełkiem i upiecz w piekarniku o temperaturze 60 °C.
	<ol>
		<li>Po odparowaniu wody i odpowiednim związaniu wosku należy zdjąć szkiełka i przechowywać je w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie H&E tkanki błony śluzowej nosa
<ol>
	<li>Odparafinowanie i nawilżanie: plastry umieścić w ksylenie na 20 min, powtarzać proces przez kolejne 20 minut, etanol absolutny przez 5 min, powtarzać ten krok przez kolejne 5 min, 75% alkohol przez 5 min, a na koniec myć przez 5 min.</li>
	<li>Barwienie hematoksyliną: dozować 100 μl roztworu barwiącego hematoksylinę (patrz tabela materiałów) przez 3-5 minut za pomocą pipety o pojemności 100 μl, płukać przez 5-10 s, dodawać 100 μl etanolu z 0,5% kwasu solnego przez 10-30 s, płukać przez 5-10 s, dodawać 100 μl 0,2% wody amoniakalnej przez 10-30 s i płukać przez 30 s. 
	UWAGA: Po barwieniu hematoksyliną konieczne jest różnicowanie 0,5% etanolem kwasu solnego w celu usunięcia nadmiaru barwnika hematoksyliny związanego z jądrem i wchłoniętego przez cytoplazmę. Podczas barwienia eozyną jądra i cytoplazma zostaną wyraźnie wybarwione. Plastry będą czerwone lub różowe po różnicowaniu 0,5% etanolem kwasu solnego, więc spłucz natychmiast po różnicowaniu, aby usunąć kwas z plasterków tkanki, aby zatrzymać różnicowanie. Następnie użyj 0,2% wody amoniakalnej, aby wzmocnić barwienie jądrowe.</li>
	<li>Barwienie eozyną: za pomocą pipety o pojemności 100 μl dozować 100 μl roztworu barwiącego eozynę (patrz tabela materiałów) przez 5 minut i płukać przez 30 s.</li>
	<li>Odwodnienie i uszczelnienie: zanurzyć plastry w absolutnym etanolu na 5 minut, powtórzyć proces przez kolejne 5 minut, powtórzyć jeszcze raz przez 5 minut, dimetylu przez 5 minut i ksylenu przez 5 minut. Na koniec uszczelnij neutralną żywicą (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieszczanie zabarwionej sekcji na mikroskopie: umieść zabarwioną sekcję na mikroskopie, wyreguluj ostrość mikroskopu, aż obraz będzie wyraźnie widoczny, ustaw powiększenie na 40x i uchwyć obraz.</li>
</ol>
6. Wielobarwne barwienie immunologiczne tkanki błony śluzowej nosa
<ol>
	<li>Deparafinowanie i nawilżanie: postępuj tak samo, jak wspomniano w kroku 5.1.</li>
	<li>Traktowanie buforem cytrynianowo-fosforanowym: umieścić bufor cytrynianowo-fosforanowy (pH 6,0) (patrz tabela materiałów) w pojemniku nadającym się do kuchenki mikrofalowej. Podgrzej do wrzenia, wyjmij, a następnie dodaj szkiełka do pojemnika. Kuchenka mikrofalowa na średnim ogniu przez 8 minut do wrzenia, wyłącz ogień na 8 minut, a następnie przełącz na średnio-niski ogień na 7 minut.
	<ol>
		<li>Po naturalnym schłodzeniu przenieś plastry do PBS (pH 7,4), wstrząśnij i umyj je trzy razy za pomocą shakera odbarwiającego, za każdym razem przez 5 min. 
		UWAGA: Upewnij się, że bufor nie wyparuje podczas tego procesu i nie dopuścić do wyschnięcia plastrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie endogennej peroksydazy: wysuszyć plastry, narysować okrąg wokół tkanki pisakiem immunohistochemicznym (aby zapobiec odpływaniu przeciwciała) i nałożyć 3% roztwór nadtlenku wodoru (nadtlenek wodoru: czysta woda = 1:9).
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Po naturalnym schłodzeniu umieść plastry w PBS (pH 7,4) i potrząsaj nimi na wytrząsarce odbarwiającej przez trzy cykle po 5 minut każdy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie: nałóż 5% koziej surowicy w obrębie koła i inkubuj przez 30 min.</li>
	<li>Dodanie przeciwciał pierwotnych: delikatnie usunąć roztwór blokujący, dodać FOXP3 (rozcieńczenie: 1:200, patrz Tabela Materiałów) do plastra i umieścić go w wilgotnej komorze. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Dodaj niewielką ilość wody do wilgotnej komory, aby zapobiec parowaniu przeciwciał.</li>
	<li>Wtórne dodanie przeciwciał: umieść plastry w PBS (pH 7,4) i potrząsaj nimi na wytrząsarce odbarwiającej przez trzy cykle po 5 minut każdy. Delikatnie osusz plastry i nałóż przeciwciało drugorzędowe (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, patrz Tabela Materiałów) w okręgu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 50 minut w ciemności.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu rozcieńczającego tyramid: połączyć 100 μl 3% H2O2 z 100 ml 1x TBST (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodanie roztworu roboczego TSA: Zmieszać 1 ml rozcieńczalnika tyramidu z 2 μl CY3-Tyramidu, aby przygotować roztwór roboczy TSA. Nałóż 100 μl roztworu roboczego TSA na każdy plasterek i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Następnie umyj plastry PBS trzy razy, za każdym razem po 5 minut. 
	UWAGA: Roztwór roboczy TSA należy natychmiast przygotować i zużyć, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności; Jest ważny do 24 godzin.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.2-6.8: przełączyć na rozcieńczenie RORγt (barwnik fluorescencyjny FITC) w stosunku 1:200, a następnie na rozcieńczenie TICAM1 (barwnik TYP620) w stosunku 1:200 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Jądra barwione przeciwstawnie DAPI: delikatnie potrząśnij plastrami, aby je wysuszyć, nałóż roztwór barwiący DAPI i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Hartowanie autofluorescencji: umieść plastry w PBS (pH 7,4) i potrząśnij nimi na wytrząsarce odbarwiającej przez trzy cykle po 5 minut każdy. Nałóż wygaszacz autofluorescencji (patrz Tabela Materiałów) na plastry, odczekaj 5 minut, a następnie myj przez 10 minut.</li>
	<li>Blokowanie: umieść plastry w PBS (pH 7,4) i potrząsaj nimi na wytrząsarce odbarwiającej przez trzy cykle po 5 minut każdy. Delikatnie potrząśnij plastrami, aby je wysuszyć i uszczelnij je środkiem antyfluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Mikroskopia: umieść zabarwiony fragment na mikroskopie, wyreguluj ostrość mikroskopu, aby uzyskać wyraźną widoczność, ustaw powiększenie na 20x i 40x i uchwyć obraz. 
	UWAGA: DAPI ma długość fali wzbudzenia UV 330-380 nm i długość fali emisji 420 nm (światło niebieskie). FITC ma długość fali wzbudzenia 465-495 nm i długość fali emisji 515-555 nm (zielone światło). CY3 ma długość fali wzbudzenia 510-560 nm i długość fali emisji 590 nm (światło czerwone). TYP-690 ma długość fali wzbudzenia 630 nm i długość fali emisji 690 nm (światło różowe).</li>
</ol>

Multicolor Immunofluorescence of the Nasal Tissue in an Allergic Rhinitis Rat Model

<ol><li>Brożek, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+rhinitis+and+its+impact+on+asthma+%28ARIA%29+Guidelines-2016+revision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).</li>
<li>Maurer, M., Zuberbier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undertreatment+of+rhinitis+symptoms+in+Europe%3A+findings+from+a+cross-sectional+questionnaire+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey.</a> Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-linolenic+acid+improves+nasal+mucosa+epithelial+barrier+function+in+allergic+rhinitis+by+arresting+CD4%2B+T+cell+differentiation+via+IL-4R%CE%B1-JAK2-STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%3A+International+Journal+of+Phytotherapy+and+Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway.</a> Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825(2023).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NLRP3+inflammasome+contributes+to+the+inflammatory+response+to+allergic+rhinitis+via+macrophage+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis.</a> International Immunopharmacology. 110, 109012(2022).</li>
<li>Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+allergic+inflammation+in+the+nasal+mucosa+of+allergic+rhinitis+sufferers+with+topical+pharmaceutical+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents.</a> Frontiers in pharmacology. 10, 294(2019).</li>
<li>Patel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1%28%2B%29CD8%28%2B%29+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Badoua, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-ex+pressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Fedchenko, N., Reifenrath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+approaches+for+interpretation+and+reporting+of+immunohistochemistry+analysis+results+in+the+bone+tissue+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review.</a> Diagnostic Pathology. 9, 221(2014).</li>
<li>Faget, L., Hnasko, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+for+immunofluorescent+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).</li>
<li>Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+faces+of+programmed+cell+death+ligand+1+expression+in+malignant+and+nonmalignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology.%3A+AIMM%22%5BJournal%5D)">The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).</li>
<li>Welsh, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+estrogen+receptor+measurement+in+breast+cancer+suggests+false-negative+results+are+a+function+of+threshold+intensity+rather+than+percentage+of+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+for+preparation+of+allergic+rhinitis+animal+model+%28draft%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Traditional+and+Herbal+Drugs%22%5BJournal%5D)">Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft).</a> Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astragalus+polysaccharides+attenuate+ovalbumin-induced+allergic+rhinitis+in+rats+by+inhibiting+nlrp3+inflammasome+activation+and+nod2-mediated+nf-+%CE%BA+b+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Food%22%5BJournal%5D)">Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation.</a> Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Bousquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Allergic rhinitis.</a> Nature reviews. 6 (1), 95(2020).</li>
<li>Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+activated+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+as+a+predictive+and+prognostic+marker+in+advanced+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma.</a> World Journal of Surgical Oncology. 13, 314(2015).</li>
<li>Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perennial+rhinitis%3A+An+independent+risk+factor+for+asthma+in+nonatopic+subjects%3A+results+from+the+European+Community+Respiratory+Health+Survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).</li>
<li>Guerra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhinitis+is+an+independent+risk+factor+for+developing+cough+apart+from+colds+among+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults.</a> Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).</li>
<li>Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+of+asthma+and+allergic+rhinitis%3A+a+23-year+follow-up+study+of+college+students%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+and+Asthma+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students.</a> Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).</li>
<li>Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+the+pathomechanisms+of+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Allergy%22%5BJournal%5D)">Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis.</a> Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).</li>
<li>Van Nguyen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-allergic+rhinitis+activity+of+%CE%B1-lipoic+acid+via+balancing+th17%2Ftreg+expression+and+enhancing+nrf2%2Fho-1+pathway+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12528(2020).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+ror%CE%B3t+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+the+transcription+factor+Foxp3+leads+to+the+generation+of+pathogenic+memory+T+cells+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo.</a> Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).</li>
<li>Ziegler, S. F., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+and+the+regulation+of+Treg%2FTh17+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li>
<li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Recapitulate%22%5BJournal%5D)">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li>
<li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Otorhinolaryngology%2C+Head%2C+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li>
<li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Coal+Industry+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+blockade%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li>
<li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Alergiczny nieżyt nosa (AR) jest niezakaźną chorobą zapalną błony śluzowej nosa wynikającą z połączenia czynników środowiskowych i genetycznych. Stała się globalnym problemem zdrowotnym, wpływając na wydajność pracy, obniżając jakość życia, pogarszając sen, funkcje poznawcze oraz powodując drażliwość i zmęczenie. AR dotyka 10–20% światowej populacji¹ i wiąże się ze znacznymi kosztami ekonomicznymi, powodując roczne straty w wysokości do 30–50 mld euro w krajach UE18. Co więcej, kilka badań wykazał...

Alergiczny nieżyt nosa (AR) jest przewlekłą, niezakaźną chorobą zapalną błony śluzowej nosa, w której pośredniczy głównie specyficzna immunoglobulina E (IgE)1,2. Charakteryzuje się objawami takimi jak kichanie, katar, przekrwienie błony śluzowej nosa i swędzenie nosa. Wraz z industrializacją i urbanizacją rozpowszechnienie AR stopniowo rośnie, dotykając około 10%-20% światowej populacji1. Technika immunofluorescencji (IF) to metoda barwienia fluorescencyjnego, która wykorzystuje reakcję wiązania przeciwciało-antygen. Można go wykorzystać do wykrywania i ilościowego określania poziomów dystrybucji i ekspresji określonych białek w tkankach biologicznych lub komórkach. W badaniach AR IF może jednocześnie wykrywać wiele celów, w tym cytokiny związane z AR, komórki zapalne, receptory i inne, ułatwiając eksplorację patogenezy AR i działania leków3,4,5,6.
Proces barwienia wielokolorową immunofluorescencją (mIF) bardzo przypomina tradycyjny IF, z dodatkiem etapu elucji przeciwciał podczas każdej rundy barwienia. Modyfikacja ta umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu biomarkerów na tym samym odcinku tkanki poprzez sekwencyjne pojedyncze znakowanie i wiele rund ponownego barwienia. mIF opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidu (TSA), co pozwala na wielokrotne cykle barwienia fluorescencyjnego TSA i zastosowanie ogrzewania mikrofalowego w celu usunięcia przeciwciał przy jednoczesnym zachowaniu sygnałów fluorescencyjnych7,8. W porównaniu z konwencjonalnym IF, mIF ma kilka zalet: (1) może wykrywać antygeny o niskiej ekspresji, które są trudne do zidentyfikowania za pomocą konwencjonalnego IF9,10; (2) zapewnia wysokiej jakości barwienie z lepszym stosunkiem sygnału do szumu; (3) pozwala na ilościowe określenie struktur i regionów specyficznych dla tkanki 11; (4) Multipleksowanie wielu ścieżek efektywnie wykorzystuje tkanki i oszczędza ograniczone zasoby patologiczne<klasa SUP="xref">12; (5) analiza wieloparametrowa za pomocą mIF oferuje głębszy wgląd w tkanki, odkrywając ukryte informacje biologiczne13.
Ogólnie rzecz biorąc, mIF pozwala na obserwację różnych ekspresji i rozkładów antygenu w tej samej próbce, ułatwiając badanie docelowych białek. W przyszłości naukowcy dążący do zrozumienia ekspresji i dystrybucji wielu białek docelowych uznają tę technikę za cenny wybór. Badanie to demonstruje zastosowanie mIF do barwienia próbek błony śluzowej nosa od szczurów za pomocą AR i ocenia ustanowienie szczurzego modelu AR.

<table><tbody><tr><td>Al(OH)3</td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A7130</td><td></td></tr><tr><td>75% etanolu</td><td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td><td>20210107</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2021070101</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022070501</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz</td> <td>antyfluorescencyjnySouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna maszyna do farbowania</td><td>Thermo scientific</td><td>Varistain Gemini ES</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice nośne</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>220518001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowo-fosforanowy </td><td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (PH 6,0)</td><td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td>220518001</tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>CS01-2450</td><td></td></tr><tr><td>CY3-Tyramid</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1223-50UL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka odbarwiająca</td><td>SCILOGEX</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA roztwór odwapniający</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td>CR2203047</tr><tr><td>Suszarka elektryczna z ogrzewaniem </td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do znakowania pudełek do zatapiania</td><td>Thermo scientific</td><td>  Maszyna</td> do zatapiania PrintMate AS <td></td></tr><tr><td></td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>Szybka maszyna do odwadniania tkanek</td><td>Thermo scientific</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka do folii</td><td>Thermo scientific</td><td>Autostainer 360</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Tyramid</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1222-50UL</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Słoneczny Technologia optyczna Co.Ltd</td><td>CX40</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>bs-10211R</td><td></td></tr><tr><td>Stół zamrażalniczy</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-L5</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł Anty-Królik IgG H&amp; L (HRP)</td><td>Liankebio Co., Ltd</td><td>GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Biosharp</td><td>BL210A</td><td></td></tr><tr><td>H&amp; Zestaw do barwienia E</td><td>Leagene</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td><td>210608</td><td></td></tr><tr><td>Długopis immunohistochemiczny</td><td>Biosharp</td><td>BC004</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td>Midea M1-L213B</td><td></td></tr><tr><td>Guma neutralna</td><td>Grupa Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego </td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A804010</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka palmowa</td><td>SCILOGEX</td><td>D1008E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0099-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Skaner sekcji patologii</td><td>3DHISTECH Kft</td><td>Pannoramic SCAN </td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS</td><td>Pipeta Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Smok</td><td>KE0003087/KA0056573</td><td></td></tr><tr><td>Rorγ t</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF3196</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td><td>20170022</td><td></td></tr><tr><td>Samofluorescencyjny środek hartowniczy Sudan Black B</td><td>Bioengineering Co., Ltd</td><td>A602008-0025</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica</td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td>Krajalnica</tr><tr><td></td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>PC2-301</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley szczury</td><td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td><td>SYX <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto; "> 2023-0100</td><td></td></tr><tr><td>TICAM-1</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF6289</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J22120</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do rozprowadzania tkanek do pieczenia</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>TYR-690 barwniki fluorescencyjne</td><td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td><td>RC0086-34RM</td><td></td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do kąpieli wodnej</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>Trymer do wosku</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JXL-818</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022051901</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

Alergiczny nieżyt nosa (AR) jest przewlekłą, niezakaźną chorobą zapalną błony śluzowej nosa, w której pośredniczy głównie specyficzna immunoglobulina E (IgE), dotykającą około 10%-20% światowej populacji. Podczas gdy barwienie immunofluorescencyjne (IF) od dawna jest standardową techniką wykrywania ekspresji białek specyficznych dla choroby, konwencjonalne techniki IF mają ograniczoną zdolność do wykrywania poziomów ekspresji trzech lub więcej białek w tej samej próbce. W związku z tym w ostatnich latach opracowano wielokolorowe techniki IF, które umożliwiają jednoczesne znakowanie wielu celów w komórkach lub tkankach.
Ten protokół dostarcza kompleksowego przeglądu procesu tworzenia szczurzego modelu AR, pobierania próbek błony śluzowej nosa oraz technicznych procedur immunofluorescencji wielokolorowej. Wszystkie szczury w grupie AR wykazywały typowe objawy, takie jak kichanie, katar i swędzenie nosa, a obserwacje behawioralne uzyskały ≥5 punktu. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazało zwiększoną liczbę komórek zapalnych i zaburzoną integralność błony śluzowej nosa w grupie AR. Immunofluorescencja wielobarwna (mIF) wykazała zwiększoną ekspresję RORγt i TICAM-1, podczas gdy ekspresja Foxp3 zmniejszyła się w tkance błony śluzowej nosa szczurów AR.

U sześciu szczurów SD skutecznie wywołano model AR poprzez dopasowanie iniekcji OVA do jamy brzusznej oraz wyzwanie nosowe. AR wystąpił u wszystkich szczurów w grupie AR, co stanowiło 100% grupy. Wszystkie szczury w grupie AR wykazywały typowe objawy, takie jak kichanie, wyciek z nosa oraz świąd nosa. Wszystkie obserwacje behawioralne otrzymały ocenę ≥5 punktów (Tabela 2).
H&amp;Wyniki barwienia E w dniu 21.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Dzień modelowan...

Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Nasze główne badania opierają się na badaniu alergicznego nieżytu nosa. Nasze badania mają na celu przeanalizowanie, jakie białka są związane z alergicznym nieżytem nosa. Immunofluorescencja wielobarwna jest obecnie wykorzystywana do rozwoju badań w naszej dziedzinie.W przyszłych badaniach skupimy się na możliwych mechanizmach TCM w leczeniu alergicznego nieżytu nosa. Na początek za pomocą skalpela wykonaj precyzyjne nacięcie wzdłuż dwóch kącików ust szczura, który został poddany eutanazji, aby odsłonić tkankę mięśniową. Użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć stawy kości jarzmowej i żuchwy po obu stronach czaszki.Następnie usuń żuchwę. Użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć połączenie kostne między jamą nosową a szczęką. Następnie użyj hemostatu, aby oddzielić skórę szczęki, aby odsłonić jamę nosową.Przeciąć połączenie między jamą nosową a kośćmi oczodołu po obu stronach otworu podoczodołowego i usunąć jamę nosową. Umieść pobraną jamę nosową w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia. Aby odwapnić tkankę, umyj utrwaloną tkankę wodą destylowaną.Umieść tkanki w roztworze odwapniającym o objętości od 20 do 30 razy większej niż tkanki w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu odwapniania umieść tkankę w pudełku do odwadniania. Przenieś pojemnik do odwadniania do odwadniacza i odwodnij tkankę w zwiększającym się stężeniu alkoholu w różnych czasach inkubacji.Następnie umieść tkankę w bezwodnym etanolu na 30 minut przez dwa cykle. Następnie przenieś tkankę na ksylen na 5 do 10 minut i powtórz. Następnie zanurz tkankę w wosku na godzinę.Umieść blok wosku w kasetach do zatapiania. Usuń bloki wosku po ich zestaleniu i przytnij blok wosku. Włóż przycięty blok wosku do mikrotomu parafinowego i pokrój go w plastry o grubości trzech mikrometrów.Barwienie hematoksyliną i eozyną u szczurów kontrolnych wykazało dobrze ułożone komórki nabłonkowe i celię. Błona śluzowa przegrody nosowej była uszkodzona i oderwana w grupie chorobowej, z wyraźnym naciekiem neutrofili. Na początek umieść wycinki tkanki błony śluzowej nosa szczura barwione hematoksyną i eozyną na stoliku mikroskopowym.Dostosuj ostrość mikroskopu, aż obraz będzie wyraźnie widoczny. Uchwyć obraz tkanki z powiększeniem 40x. Podgrzej bufor fosforanu cytrynianu, aż się zagotuje.Następnie dodaj szkiełka do pojemnika po wyjęciu go z ognia. Po podgrzaniu przez osiem minut do wrzenia wyłącz ogień na osiem minut, a następnie przełącz się na średnio niski ogień na siedem minut. Po pozostawieniu pojemnika do naturalnego ostygnięcia, przenieś plastry do PBS.Użyj shakera odbarwiającego, aby potrząsać plasterkami przez pięć minut. Następnie narysuj okrąg wokół wysuszonej tkanki za pomocą pisaka immunohistochemicznego. Dodaj 3% roztwór nadtlenku wodoru do plastrów przed inkubacją.Następnie przenieś plastry do PBS w celu umycia jak poprzednio. Aby zablokować, nałóż 5% koziej surowicy w zaznaczonym okręgu. Po inkubacji ostrożnie usuń roztwór blokujący i dodaj od jednego do dwóch mililitrów Foxp3 do plasterków tkanki.Następnie umieść plastry w wilgotnej komorze do inkubacji przez noc. Po umyciu plastrów w PBS delikatnie osusz plastry bibułą filtracyjną. Następnie dodaj jeden do dwóch mililitrów wtórnego roztworu przeciwciał do plasterków.Następnie inkubuj plastry w 100 mikrolitrach roztworu roboczego wzmacniającego sygnał tyramidu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji umyj plastry PBS trzy razy przez pięć minut każde. Teraz nałóż od jednego do dwóch mililitrów roztworu barwiącego DAPI na plastry przed inkubacją.Ugasić autofluorescencję, inkubując plastry w hartownicy przez 5 minut przed 10-minutowym myciem PBS. Następnie uszczelnij je wygaszaczem antyfluorescencyjnym. Uchwyć mikroskopowe obrazy poplamionych sekcji pod 20-krotnym i 40-krotnym powiększeniem.Barwienie hematoksyliną i eozyną u szczurów kontrolnych wykazało dobrze ułożone komórki nabłonkowe i celię. Błona śluzowa przegrody nosowej była uszkodzona i oderwana w grupie chorobowej, z wyraźnym naciekiem neutrofili. Barwienie wieloimmunofluorescencyjne wykazało, że ekspresja ROR gamma t i TICAM-1 była zwiększona w grupie chorobowej.Jednak Foxp3 był niedostatecznie wyrażony.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Ten film pokazuje ilościowe określenie poziomów mediatorów immunologicznych w ekstrakcie z błony śluzowej nosa u noworodków. System testów multipleksowych oparty na elektrochemiluminescencji mierzy te mediatory, oceniając intensywność emitowanego światła, gdy są one wzbudzone.

Kwantyfikacja poziomów mediatorów immunologicznych w płynie z błony śluzowej człowieka

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ten manuskrypt opisuje użycie technik wchłaniania przez nos i oskrzela, w szczególności przy użyciu syntetycznych matryc absorpcyjnych (SAM) do pobierania próbek płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) górnych i dolnych dróg oddechowych. Metody te zapewniają lepszą standaryzację i tolerancję niż istniejące techniki pobierania próbek z układu oddechowego.

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę kopania w punktach akupunkturowych i demonstruje jego skuteczność w leczeniu alergicznego nieżytu nosa.

Terapia osadzająca katagut Acupoint w tradycyjnej medycynie chińskiej w leczeniu alergicznego nieżytu nosa

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę unikania zanieczyszczenia krwi mysim płynem do płukania nosa (NLF). Ponieważ metoda ta zapewnia pobranie NLF bez zanieczyszczenia krwi, pozwala na dokładniejsze wykrywanie składników immunologicznych i różnych patogenów układu oddechowego.

Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj technikę wielokolorowej immunofluorescencji do oceny modelu alergicznego nieżytu nosa u szczurów. Ta metoda umożliwia identyfikację białek związanych z alergią i badanie mechanizmów leczenia.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Przeglądaj więcej filmów