Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego
22 września 2023
Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.
Nasze główne badania opierają się na badaniu alergicznego nieżytu nosa. Nasze badania mają na celu przeanalizowanie, jakie białka są związane z alergicznym nieżytem nosa. Immunofluorescencja wielobarwna jest obecnie wykorzystywana do rozwoju badań w naszej dziedzinie.
W przyszłych badaniach skupimy się na możliwych mechanizmach TCM w leczeniu alergicznego nieżytu nosa. Na początek za pomocą skalpela wykonaj precyzyjne nacięcie wzdłuż dwóch kącików ust szczura, który został poddany eutanazji, aby odsłonić tkankę mięśniową. Użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć stawy kości jarzmowej i żuchwy po obu stronach czaszki.
Następnie usuń żuchwę. Użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć połączenie kostne między jamą nosową a szczęką. Następnie użyj hemostatu, aby oddzielić skórę szczęki, aby odsłonić jamę nosową.
Przeciąć połączenie między jamą nosową a kośćmi oczodołu po obu stronach otworu podoczodołowego i usunąć jamę nosową. Umieść pobraną jamę nosową w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia. Aby odwapnić tkankę, umyj utrwaloną tkankę wodą destylowaną.
Umieść tkanki w roztworze odwapniającym o objętości od 20 do 30 razy większej niż tkanki w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu odwapniania umieść tkankę w pudełku do odwadniania. Przenieś pojemnik do odwadniania do odwadniacza i odwodnij tkankę w zwiększającym się stężeniu alkoholu w różnych czasach inkubacji.
Następnie umieść tkankę w bezwodnym etanolu na 30 minut przez dwa cykle. Następnie przenieś tkankę na ksylen na 5 do 10 minut i powtórz. Następnie zanurz tkankę w wosku na godzinę.
Umieść blok wosku w kasetach do zatapiania. Usuń bloki wosku po ich zestaleniu i przytnij blok wosku. Włóż przycięty blok wosku do mikrotomu parafinowego i pokrój go w plastry o grubości trzech mikrometrów.
Barwienie hematoksyliną i eozyną u szczurów kontrolnych wykazało dobrze ułożone komórki nabłonkowe i celię. Błona śluzowa przegrody nosowej była uszkodzona i oderwana w grupie chorobowej, z wyraźnym naciekiem neutrofili. Na początek umieść wycinki tkanki błony śluzowej nosa szczura barwione hematoksyną i eozyną na stoliku mikroskopowym.
Dostosuj ostrość mikroskopu, aż obraz będzie wyraźnie widoczny. Uchwyć obraz tkanki z powiększeniem 40x. Podgrzej bufor fosforanu cytrynianu, aż się zagotuje.
Następnie dodaj szkiełka do pojemnika po wyjęciu go z ognia. Po podgrzaniu przez osiem minut do wrzenia wyłącz ogień na osiem minut, a następnie przełącz się na średnio niski ogień na siedem minut. Po pozostawieniu pojemnika do naturalnego ostygnięcia, przenieś plastry do PBS.
Użyj shakera odbarwiającego, aby potrząsać plasterkami przez pięć minut. Następnie narysuj okrąg wokół wysuszonej tkanki za pomocą pisaka immunohistochemicznego. Dodaj 3% roztwór nadtlenku wodoru do plastrów przed inkubacją.
Następnie przenieś plastry do PBS w celu umycia jak poprzednio. Aby zablokować, nałóż 5% koziej surowicy w zaznaczonym okręgu. Po inkubacji ostrożnie usuń roztwór blokujący i dodaj od jednego do dwóch mililitrów Foxp3 do plasterków tkanki.
Następnie umieść plastry w wilgotnej komorze do inkubacji przez noc. Po umyciu plastrów w PBS delikatnie osusz plastry bibułą filtracyjną. Następnie dodaj jeden do dwóch mililitrów wtórnego roztworu przeciwciał do plasterków.
Następnie inkubuj plastry w 100 mikrolitrach roztworu roboczego wzmacniającego sygnał tyramidu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji umyj plastry PBS trzy razy przez pięć minut każde. Teraz nałóż od jednego do dwóch mililitrów roztworu barwiącego DAPI na plastry przed inkubacją.
Ugasić autofluorescencję, inkubując plastry w hartownicy przez 5 minut przed 10-minutowym myciem PBS. Następnie uszczelnij je wygaszaczem antyfluorescencyjnym. Uchwyć mikroskopowe obrazy poplamionych sekcji pod 20-krotnym i 40-krotnym powiększeniem.
Barwienie hematoksyliną i eozyną u szczurów kontrolnych wykazało dobrze ułożone komórki nabłonkowe i celię. Błona śluzowa przegrody nosowej była uszkodzona i oderwana w grupie chorobowej, z wyraźnym naciekiem neutrofili. Barwienie wieloimmunofluorescencyjne wykazało, że ekspresja ROR gamma t i TICAM-1 była zwiększona w grupie chorobowej.
Jednak Foxp3 był niedostatecznie wyrażony.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje technikę wielobarwnej immunofluorescencji służącą do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżycia nosa. Celem badania jest analiza białek związanych z allergic rhinitis oraz zbadanie mechanizmów terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Immunologia
- Badania nad alergiami
Wstęp
- Alergiczny nieżyt nosa jest powszechną chorobą dotykającą wielu osób.
- Zrozumienie roli białek leżących u podłoża tej choroby może pomóc w opracowaniu metod leczenia.
- Wielokolorowa immunofluorescencja jest cenną techniką w tych badaniach.
- Przyszłe badania będą dotyczyć metod leczenia w ramach tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM).
Cel badania
- Ocena szczurzego modelu nieżytu alergicznego.
- Identyfikacja białek związanych z tym stanem.
- Zbadanie potencjalnych mechanizmów terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie modelu szczurzego poprzez procedury chirurgiczne.
- Zastosowanie technik wielokolorowej immunofluorescencji.
- Analiza ekspresji białek powiązanych z nieżytem nosa pochodzenia alergicznego.
- Przyszłe skupienie na mechanizmach TCM w leczeniu.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych białek związanych z nieżytem nosa pochodzenia alergicznego.
- Skuteczne zastosowanie wielobarwnej immunofluorescencji.
- Wnioski dotyczące potencjalnych podejść terapeutycznych.
- Podstawa dla przyszłych badań nad terapiami TCM.
Wnioski
- Technika wielokolorowej immunofluorescencji jest skuteczna dla tego modelu.
- Zrozumienie interakcji białkowych jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
- Przyszłe badania poszerzą wiedzę na temat terapii alergicznego nieżytu nosa.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielokolorowe znakowanie immunofluorescencyjne w przekrojach tkanki błony śluzowej nosa umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów białkowych w modelach alergicznego nieżytu nosa, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację punktów uchwytu we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną poprzez ilościowe określanie zmian w ekspresji białek istotnych dla choroby, co pozwala na lepszą selekcję projektów w portfolio oraz strategii badań translacyjnych. Możliwość multipleksowania tej metody stanowi kluczowy punkt zwrotny w zakresie wiarygodnej identyfikacji biomarkerów w badaniach nad układem oddechowym i immunologią.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę sieci białek związanych z chorobą w modelach nieżytowego zapalenia błony śluzowej nosa.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie zmian w ekspresji RORγt, TICAM-1 oraz Foxp3.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli szlaków immunologicznych w zapaleniu błony śluzowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wdrażania celów immunomodulacyjnych.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane skrawki tkanek do zastosowania w procesach multipleksowej detekcji białek.
- Standaryzuje ilościowe odczyty immunofluorescencji w celu opracowania powtarzalnych testów.
- Umożliwia skalowalne przesiewy potencjalnych interwencji wpływających na markery komórek odpornościowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na ekspresję białek istotnych dla przebiegu choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profile ekspresji biomarkerów z punktami końcowymi istotnymi dla choroby w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji strategii modulacji immunologicznej.
- Uzasadnia decyzje dotyczące rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe dane na poziomie tkankowym.
- Wzmacnia translacyjne dopasowanie biomarkerów dla portfolio w obszarze chorób dróg oddechowych i immunologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wielokolorowej immunofluorescencji wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjną walidacją biomarkerów w badaniach nad alergicznym zapaleniem błony śluzowej nosa.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez multipleksowanie markerów immunologicznych in situ.
- Przesiewowanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testów oraz oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne pomiary zmian w ekspresji białek do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany biomarkerów na poziomie tkankowym z punktami końcowymi badań przedklinicznych istotnymi dla programów rozwoju leków na choroby układu oddechowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do multipleksowej analizy tkanek w programach badawczych nad immunologią i zapaleniem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach szlaków odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność multipleksowych analiz tkanek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu solidnego triage'u opartego na biomarkerach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów immunomodulujących.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach immunofluorescencji i sekcjonowania tkanek.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej oraz infrastruktury do analizy obrazu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów tkanek lub modeli chorób.
- Złożoność multipleksowania może ograniczać przepustowość w zależności od dostępnej aparatury.
