Zautomatyzowane cięcie wibratomiczne tkanki płucnej zatopionej w agarozie do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego

Protokół ten jest szczególnie przydatny w dużych modelach zwierzęcych przeszczepu i regeneracji płuc, takich jak świnie, gdzie z czasem możemy pobierać próbki małych fragmentów. Technika ta może pomóc nam lepiej zrozumieć biologię przestrzenną występującą w tych modelach. Technika ta pozwala na uzyskanie minimalnie przetworzonych wycinków płuc nadających się do obrazowania immunofluorescencyjnego bez konieczności pobierania antygenu i okazała się skuteczna w przypadku wszystkich testowanych do tej pory przeciwciał.

Procedura ta może być dostosowana do cięcia nieco grubszych odcinków, powiedzmy około jednego milimetra, które można następnie wykorzystać w mikroskopii fluorescencyjnej na arkuszach świetlnych w celu zbadania przestrzennej ekspresji białek w bardziej trójwymiarowej objętości. Nasze badania koncentrują się na czynnikach wpływających na odrzucenie przeszczepu płuc i opracowujemy terapie mające na celu zmniejszenie odrzucenia przeszczepu przy użyciu naszego modelu świni. Technika ta pomaga zrozumieć przestrzenne zmiany białek wpływające na wyniki przeszczepu po operacji.

Obecnie używamy tej techniki do zbadania przestrzennego krajobrazu ekspresji białek w naszym modelu przeszczepu płuc świni. Mamy nadzieję, że pomoże nam to lepiej zrozumieć mechanizmy stojące za naszymi eksperymentalnymi terapiami. Kluczem do sukcesu jest obserwacja wibratomów, wysokie amplitudy ostrzy i niższe prędkości siły to kluczowe rzeczy, na które należy zwrócić uwagę, jeśli cięcie pójdzie źle.

Na początek utrwal tkankę płucną świni w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie przenieś tkankę płucną do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 30 mililitrów PBS z 0,01% azydkiem sodu. Miej w pogotowiu plastikowy kubek, cienkie kleszczyki i sterylne nożyczki.

Podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej, aż osiągnie temperaturę wrzenia. Następnie schłodzić go do 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Przechowuj go w łaźni wodnej do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.

Usunąć biopsję płuc z roztworu azydku PBS. Użyj cienkich kleszczy i sterylnych nożyczek, aby ostrożnie rozciąć płaty płuc na mniejsze bloki. Następnie odetnij środek plastikowego kubka.

Wlej niewielką ilość agarozy na dno filiżanki. Umieść pokrywkę stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów ze zdjętą krawędzią na powierzchni agarozy. Przechowuj ten zestaw w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby agaroza zestaliła się.

Gdy agaroza zastygnie, wyjmij plastikowy kubek z lodówki. Teraz wlej około jednego mililitra płynnej agarozy na pokrywkę. Następnie delikatnie umieść blok tkanki płucnej na pokrywie.

Gdy agaroza częściowo zastygnie, powoli zanurz tkankę płucną w płynnej agarozie. Wstaw do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 15 minut, aż agaroza stanie się twarda. Użyj ostrego ostrza, aby ostrożnie usunąć nadmiar agarozy otaczającej tkankę płucną.

Na początek osadź tkankę płucną w agarozie. Aby przygotować tkankę płucną do cięcia, najpierw przymocuj każdy blok tkanki do krążka próbki wibratomu za pomocą super kleju i dodaj lód do otaczającej kąpieli. Następnie ostrożnie włóż krążek z próbką do tacki buforowej i napełnij tacę PBS.

Następnie ustaw parametry wibratomu, utrzymując grubość na poziomie 200 mikrometrów, częstotliwość na 100 herców, amplitudę ostrza na 1,3 milimetra, a prędkość naprzód ostrza między 0,02 a 0,03 milimetra na sekundę. Rozpocznij cięcie tkanki płucnej. Po utworzeniu wystarczającej liczby plasterków użyj pędzla, aby delikatnie podnieść plasterek chusteczki z tacki na wibratomy.

Przenieś plastry na 24-dołkową płytkę z roztworem azydku PBS. Zachowaj plastry płuc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zacznij od osadzenia tkanki płucnej i agarozy i podzielenia ich na sekcje za pomocą wibratomu.

Do pokrojonych tkanek dodaj 300 mikrolitrów środka blokującego. Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce, delikatnie mieszając przez 45 minut. Następnie odpipetować 300 mikrolitrów rozcieńczonego PBS przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Teraz delikatnie odpipetuj przeciwciała pierwszorzędowe, nie dotykając plasterka. Umyj plastry trzy razy 400 mikrolitrami PBS.

Następnie odpipetować 300 mikrolitrów rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Usunąć roztwór przeciwciał po inkubacji w zimnie przez 90 minut. Następnie dodaj DAPI i lektynę pomidorową-488 do studzienek.

Inkubować mieszaninę przez 30 minut. Po usunięciu DAPI i lektyny pomidorowej myj plastry w PBS przez trzy cykle po 10 minut. Za pomocą pędzla przenieś plasterki na szkiełko.

Umieść trzy krople podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i zamontuj na nim szkiełko nakrywkowe przed obrazowaniem. Wycinki płuc próbek pobranych od myszy, świń i ludzi wybarwiono immunofluorescencyjnie na obecność SMA, elastyny i LEA. Zaobserwowano, że SMA i elastyna są rozprowadzane w strukturach, takich jak przewody pęcherzykowe zębodołowe, naczynia krwionośne, oskrzela i pęcherzyki płucne.

Porównano dystrybucję pneumocytów typu drugiego u dorosłych i niemowląt. Przeciwciało HT2-280 przeciwko komórkom pęcherzykowym typu drugiego miało silne powinowactwo do powierzchni komórek pneumocytu. Próbka dla niemowląt wykazała znacznie wyższą liczbę pneumocytów typu drugiego.

Jednak próbka niemowlęca wykazywała również znacznie wyższe pokrycie rusztowania niż osoba dorosła. Liczba pneumocytów typu drugiego w oparciu o pokrycie rusztowaniem była również znacznie wyższa u niemowląt.